荧光PCR病毒病原学检测项目可行性分析

1、实时荧光pcr病毒病原学检测项目可行性分析1.实时荧光定量pcr（fq-pcr）病毒病原学检测的背景1.1 实时fq-pcr的原理 m o实时qf-pcr（也称taqman pcr,以下简称fq-pcr）是美国pe（perkin elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规pcr基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与传统pcr相比，fq-pcr具有许多优点。在pcr的反应体系中设计一对特异性引物,并在引物 3端的下游再设计一条带有双荧光标记的探针,该探针能与模板dna发生特异性杂交。探针的5端标记荧光报告基团 fam (6-羧基荧光素,荧光发射值在518nm)

2、, 3端标记荧光淬灭基团 tamra(6 -羧基四甲基丹诺明,荧光发射值在582nm),两者之间构成能量传递。探针的结构完整时,5-fam所发出的荧光被3-tamra所吸收或抑制,不出现荧光信号的变化。随着 pcr反应的进行，由于taq酶具有5到3外切酶的活性,当合成的新链移动到探针结合的位置s时 ,taq酶将探针切断,探针的完整性遭到破坏,能量传递结构亦被破坏,3tamra的淬灭作用被解除,5fam的荧光报告基团的荧光信号被释放出来。pcr每复制一个特异的核苷酸片段 ,就有一个探针被切断 ,同时一个荧光报告基团被释放出来。产物与荧光信号产生一对一的对应关系 ,随着产物的增加 ,荧光信号亦随之

3、增强。在 pcr反应过程中检测反应体系中荧光信号连续不断的变化,当信号增强到某一阈值时(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差,计算出以99.7 %的置信度大于平均值的荧光值,即为阈值),循环次数即循环阈值 ct(cycle threshold,ct)被记录下来。该循环参数 ct和 pcr体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系 ,利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的 ct值和该阳性定量标准的模板数经过对数拟和作图 ,制成标准曲线 ,再根据待测样品的 ct值就可以准确的确定起始模板的数量，所以根据pcr反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。/ w2 s8 b9 g0 d+ o j2 l 实

4、时qf-pcr的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。1.2实时fq-pcr在病毒病原学检测中的应用现状由于pcr技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但因其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，pcr扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模板定量显得特别重要。常规pcr由于不能定量而限制了其应用，然而fq-pcr技术给解决这一问题提

5、供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。同时，由于fq-pcr可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。整理多个检测机构的研究应用成果和发表的文献，澳大利亚最大的感染性疾病检测中心adelaide研究所推荐认为：实时fq-pcr的检测结果已经被目前所有实验室所认可，并已经应用在细菌、病毒和真菌的病原学检测上。主要应用在威胁人类生命的病毒感染型疾病如禽流感、单纯疱疹等，同时也广泛应用在呼吸道病毒、人类疱疹病毒、肠道病毒、多瘤病毒、bk病毒、百日咳杆菌、肺炎支原体、沙眼支原体、奈瑟(氏)菌、烟曲霉、金罗维氏肺孢子

6、虫。比较实时fq-pcr和传统的培养方法，前者有更高的特异性和敏感性。同时上海市疾控中心、广州市儿童医院等国内多家诊断中心也已经开展部分项目，并取得满意的结果，发表多篇相关检测论文。1.3实时fq-pcr的技术优势1. 敏感性 实时qf-pcr技术的敏感度通常达10拷贝/ml，且线性范围很宽，可以检测到单拷贝的基因,这是传统的 pcr难以做到的。敏感性大大提高。2. 特异性 实时fq-pcr技术具有引物和探针的双重特异性，故与传统的pcr相比，特异性大为提高。荧光探针的使用相当于在pcr的过程中自动完成了southern印迹杂交,进一步提高目的基因检测的特异性。同时封闭的反应环境降低产物污染的

7、风险性。3. 可重复性 实时qf-pcr技术结果相当稳定，同一标本的ct值相同，但是其产物的荧光量却相差很大。因为域值设置在指数扩增期，在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，ct值与荧光信号的对数呈线性关系。4. 实时qf-pcr技术使用了“内对照”系统 ,可校正pcr效率获得定量结果。实时qf-pcr技术使用即时法 ,有效地解决了传统定量只能终点检测的局限 ,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件中。ct值代表样品的浓度 ,通过对每个样品 ct值的计算,常规法须在pcr完成后测出全部的pcr产物量 ,再确定原样品浓度。实时fq-pcr技术无需内标而采用外标准曲线定

8、量,其原理根据ct值的重现性以及ct值与起始模板的线性关系。用实时qf-pcr技术检测,循环数约2024个 ,而常规 pcr法需使用34循环。5. 仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断。1.4实时fq-pcr的技术局限任何一种尽管实时荧光pcr技术得到了很大的发展，但仍存在一些不足之处：1、由于运用了封闭检测，减少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；2、 因为荧光素种类以及检测光源的局限性，所以相对限制了实时荧光pcr的复合式(multiplex)检测的应用能力；3、在定量检测中，标准品的来源无统一标准，因此各实验室的检测结果可比性不够；4、目前实时荧光pcr实验成本

9、相对pcr较高。2、项目开展是否可行？在史文元老师的“关于开展病毒病原学检测的申请”部分内容及我所了解的国内外现状特总结如下几点：1、儿童的呼吸道疾病和腹泻大部分是病毒引起，而目前此类患者占门诊和住院患者的大部分，为其提供高效、可靠的病原学检测是我们医疗部门的责任。2、开展此项目是服务临床、提升我院医疗能力的重要手段。3、从目前我院收诊的样本来看，我院有足够多的病例需要检测。4、当前我院的设备、专业技术人员已经不足和落后，急需补充。5、患者能够接受此项目检测，且本院尚有能力购买相关设备。6、此项目有很多优势，且国外已经广泛开展，国内检测也已经趋于成熟，我院又有可靠的技术支持。7、此项目开展可以

10、增强本院实力、且能够在短期内收回成本，具有显著的社会效益和经济效益。综上所述，本人觉得此项目开展是对我院和患者有利的好方案。3、项目开展初步规划4、主要参考文献1、abu al-soud, w., and radstrom, p. (2000). effects of amplification facilitators on diagnostic pcr in the presence of blood, feces, and meat. j. clin. microbiol 38, 44634470.2、al-soud, w.a., ouis, i.s., li, d.q., ljungh

11、, s., and wadstrom, t. (2005). characterization of the pcr inhibitory effect of bile to optimize real-time pcr detection of helicobacter species. fems immunol.med. microbiol. 44, 177182.3、rodney m. ratcliff1, grace chang.molecular diagnosis of medical viruses curr. issues mol. biol. 9: 87-102.4、5、6、

12、whiley dm, sloots tp.（2005）a 5-nuclease real-time rt-pcr assay for the detection of a broad range of influenza a subtypes, including h5n1. diagn.microbiol.infect. dis. 3(4):335337.7、whiley, d.m., mackay, i.m., and sloots, t.p. (2001).detection and differentiation of human olyomaviruses jc and bk by

13、light cycler pcr. j. clin. microbiol. 39,43574361.8、whiley, d.m., mackay, i.m., syrmis, m.w., witt, m.j.,and sloots, t.p. (2004b). detection and ifferentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by a duplex light cycler pcr that incur porates an internal control pcr reaction. j. clin. virol. 30, 3238.9、10、maimuna e mendy, steve kaye, marianne van der sande, pura rayco-solon, pauline a waight, deborah shipton, dorka awi, paul snell, hilton whittle and samuel j mcconkey. application of real-time pcr to quantify hepatitis b virus dna in chr