半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

1、半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤以下实验步骤仅供参考：1样品RNA的抽提 取冻存已裂解的细胞，室温放置 5分钟使其完全溶解。 两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入的氯仿，盖紧管盖。手动 剧烈振荡管体15秒后，15到30C孵育2到3分钟。4C下12000rpm离心15 分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOLL式剂的60%。 RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混 合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30C孵育10分钟后，于4C下12000rp

2、m离 心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% 乙醇（75%乙醇用DEPCHO配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4C下7000rpm离 心 5 分钟。 RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使 RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分 钟。 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40卩用枪反复吹打几次， 使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80C待用。2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100） 后

3、，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和 纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40卩g RNA/ml样品RNA浓度（卩g/m计算公式为：A260 X 稀释倍数X 40卩g/m具体计算如下：RNA溶于40卩l DEP水中，取5ul，1:100稀释至495卩的TE中，测得 A260 =RNA 浓度= X 100 X 40 卩 g/ml = 840 或 g/rpl g/ 卩 l取5ul用来测量以后，剩余样品 RNA为35卩,1剩余RNA总量为：35 卩 l x g / 卩l = ug 纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围到。2）变

4、性琼脂糖凝胶电泳测定 制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60C，10 ml的10X MOP电泳缓冲液和18 ml 的 37% 甲醛溶液 M）。10X MOP电泳缓冲液浓度成分MOPS，pH乙酸钠EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入 25卩溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1 x MOPS!泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 准备 RNA 样品取3卩gRNA加3倍体积的甲醛上样染液，加 EB于甲醛上样染液中至终浓度为 10卩g/m。加热至70C孵育15分钟使样品变性。 电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5V/cm电压下2h，电泳 至溴酚兰指示剂进胶至少2

5、-cm。 紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小稍 微扩散的带，它由低分子量的 RNA （tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和 28S核糖体带之间可以看到一片弥散的 EB染色物质，可能是由mRNA和其它异 型RNA组成。RNA制备过程中如果出现 DNA污染，将会在28S核糖体RNA带 的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带， RNA 的降解表现为核糖体 RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成 反应体系 序号反应物剂量1逆转录bu

6、ffer2卩12上游引物卩13下游引物卩14dNTPyl5逆转录酶MMLl6DEPC水 5卩17RNA模版2卩18总体积10卩1轻弹管底将溶液混合， 6000rpm 短暂离心。 混合液在加入逆转录酶 MMLV之前先70E干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶门37C水浴60分钟。 取出后立即95C干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80C 待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（伕actin）实时定量PCR 3-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011,反应前取3卩1按 10倍稀释（加水27卩并充分混匀）为1010,依次稀释至10

7、9、108、107、106、 105、 104，以备用。 反应体系如下： 标准品反应体系 序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染料 10 卩12阳性模板上游引物Fl3阳性模板下游引物Ryl4dNTPyl5Taq 酶 1 yl6阳性模板DNA5xl7ddH2Ol8总体积50卩1轻弹管底将溶液混合， 6000rpm 短暂离心。 管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料 10 卩12内参照上游引物Fl3内参照下游引物Rl4dNTPyl5Taq酶1卩16待测样品cDNA5xl7ddH2Ol8总体积50卩1 轻弹管底将溶液混合， 6000rpm 短暂离心。 制备好的阳性标

8、准品和检测样本同时上机，反应条件为：93C 2分钟，然后93C 1分钟，55C 2分钟，共40个循环。5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的 DNA模板 针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。 反应体系：序号反应物剂量110 x PC缓冲液 ul2MgCl2 溶液 ul3 上游引物 F ul4 下游引物 R ul5dNTP混合液3 ul6Taq聚合酶1 ul7cDNA1 ul8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合， 6000rpm 短暂离心。35个PCR循环（94E 1分钟；55C 1分钟；72C 1分钟）；72oC延伸5分钟。 PCR产物与DNA La

9、dder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。 将PCR产物进行10倍梯度稀释：将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR 产物浓度为 1x 1010，依次稀释至 109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。6 待测样品的待测基因实时定量 PCR所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。 体系配置如下： 序号反应物剂量1SYBR Green 1染料 10 ul2 上游引物 1ul3 下游引物 1ul4dNTP 1ul5Taq聚合酶2ul6 待测样品 cDNA5ul7ddH2O 30ul8 总体积 50 ul轻弹管底将溶液混合， 60

10、00rpm 短暂离心。将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCRT增反应。反应条 件为：93C2分钟预变性，然后按93C 1分钟，55C 1分钟，72C 1分钟，共 40做个循环，最后72C 7分钟延伸。7实时定量PCR使用引物列表引物设计软件： Primer Premier ，并遵循以下原则： 引物与模板的序列紧密互补； 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位 点引发 DNA 聚合反应 (即错配)。8 电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与DNALadder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异 性扩增条带。RT-PCR各以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因 表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项 技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCF比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的 RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。RT-PCR勺模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转 录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP起始。RT