四环素人工抗原的合成与鉴定(一)

1、四环素人工抗原的合成与鉴定 （一 ）作者：肖理文 ,袁耀萍 ,郗日沫 ,孙秀兰 ,王洪新【摘要】目的 :对牛血清白蛋白进行羧基化和四环素的衍生化 ,制备更高 偶联比的四环素（ TC） -牛血清白蛋白（ BSA）偶联物并进行鉴定。方 法 :四环素通过两步衍生化后 ,形成一种活泼的重氮化中间产物 ,与羧基 化的 BSA上的表位羧基反应 ,合成 TC-BSA偶联物。结果 :HPLC-MASS图 谱鉴定表明成功的制备了四环素衍生物 ,红外及紫外扫描图谱表明 ,偶 联成功,计算得偶联比分别为 71和 111。结论:BSA经过羧基化后的 偶联效果明显好于未经羧基化的 BSA,并成功制备了 TC-BSA人工

2、抗原。 【关键词】四环素（ TC）羧基化偶联人工抗原 四环素类抗生素 （TCs）是一类由链霉菌产生的宽谱抗生素 ,对革兰氏阳 性和革兰氏阴性细菌均具有较强的抵抗能力。因其高效、便宜且能直 接通过口服起效的特性 ,被广泛应运于禽畜养殖业中 ,既能预防治疗疾 病,也能起促进生长的作用。 1998 年,欧洲动物卫生联盟的一份调查显示 在欧盟 15 国中 ,四环素类抗生素的使用量占了整个禽畜业中抗生素使 用量的 651。在国内 ,四环素类抗生素也同样被大量广泛的用于禽 畜养殖业中。人长期低剂量的摄入四环素类抗生素可能会产生各种慢 性和蓄积性疾病 ,主要表现在对胃、肠、肝脏的损害 ,以及牙齿的染色 ,

3、还会造成过敏反应、二重感染、致畸胎等 ,同时可能会导致人体肠道中 菌群平衡的失调以及耐药性细菌的产生。为此 ,我国规定畜禽肉中四环 素的最大残留量不得超过 100ppb,禽蛋中不超过 200ppb2。目前 ,我国用于检测四环素类抗生素的 ELISA试剂盒主要靠国外进口 ,价格昂贵 , 因此急需开发拥有自主知识产权的试剂盒或免疫传感器,而其关键之一就是制备具有优良免疫原性的四环素完全抗原。我们通过对载体蛋白 BSA进行羧基化 ,大大提高了其表面活性羧基的数量 ,同时对四环素进行 衍生化,获得活泼的重氮化中间产物 ,再与 BSA及 sBSA偶联,制备四环素 完全抗原并对其进行比较。1 材料和方法1

4、.1材料 UV-2100紫外扫描仪为北京瑞利公司产品 ;NicoletNexus傅立叶 变换红外光谱仪为美国热电公司产品 ;WATERSPlatformZMD4000型高效 液相色谱质谱联用仪为美国 WATERS公司产品 ;950mL/L 盐酸四环素标 准品 （TC.HCl购） 于中国药品生物制品检定所 ;牛血清白蛋白（ BSA）为北 京 博 奥 生 物 技 术 有 限 公 司 Sigma 公 司 进 口 分 装 ; 丁 二 酸 酐 （Succinicanhydride）、N-氯丁二酰亚胺 （NCS、） 水合肼（ Hydrazinehydrate） 均为美国 Sigma 公司产品;其他试剂均为

5、分析纯;PBS 缓冲液为 0.01mol/L,pH7.4,所用水均为 SZ-97自动三重纯水蒸馏器制得。1.2 方法1.2.1BSA的羧基化 （sBSA取） 20mL0.1mol/L 的 NaCl 溶液,用 0.1mol/L 的 NaOH溶液调 pH值至8.0,冷却至 4,加入 1gBSA充分溶解后,缓慢加入 75mg丁二酸酐,用3.5mol/L的NaOH调pH值至 8.0,保持 4磁力搅拌 1h,随后于 PBS缓冲液中透析 3d,及时换液 ,最后冷冻干燥得粉末状固体 , 于-20下保存备用 3,4。1.2.2TC半抗原的衍生化与鉴定 TC在酸碱条 件下都比较活泼 ,容易形成差向异构化四环素或

6、降解 5,因此通过两 步衍生化 ,封闭其活性基团 ,形成一种活泼的重氮化中间产物 ,再与 BSA 偶联。(1)四环素衍生物 4-氧代脱 -甲氨基四环素 4,6-半缩酮(C20H17O9N) (TC1)的合成 :称取 400mgTC.HCl标准品,溶解于 20mL超纯水中 ,滴加 适量 0.01mol/L 的盐酸溶液 ,使盐酸四环素充分溶解。室温条件下 ,加入 280mgNCS粉末,磁力搅拌数分钟后有沉淀析出。反应 30min 后,过滤,得 粗产物,加入 5mL 超纯水洗涤 ,然后加入 10mL乙醚萃取 ,放掉下层水相 , 反复操作 3 次,以有效去除杂质。 最后将萃取液置于通风厨中 ,自然挥发

7、 收集产物 ,取少量进行 HPLC-MASS鉴定 6。(2)四环素衍生物 4-腙-脱 甲基-四环素(C20H19O8N3)(TC2)的合成:取 220mg上步反应所得的 TC1 溶于 15mL950mL/L的乙醇中 ,室温下缓慢加入 50L水合肼 ,立刻析出沉 淀,磁力搅拌 1h。过滤得粗产物 ,加入 8mL乙醇洗涤,反复 3次,收集产物, 取少量进行 HPLC-MASS鉴定 7。1.2.3TC-BSA和 TC-sBSA完全抗原的合成与鉴定取 2份经过纯化后的 TC2 各 50mg 溶于 20mLpH4.7 的超纯水盐酸溶液中 ,分别加入 250mgBSA和 sBSA摇, 匀后缓慢加入 20m

8、gEDC磁, 力搅拌 1h,反应结束后 8,以 PBS 缓冲液为洗脱液 ,4下 SephadexG-25柱凝胶过滤 ,合并 278nm 处的收集 液,最后冷冻干燥 ,所得粉末保存于 -20冰箱中备用 9。 对所合成的完全抗原进行紫外分光光度计扫描测定 10,按下式计算 偶联物的结合比 11。CaCb=ACamKBbm-ACbmKBamACbmKAam-ACamKAbm式中:Ca/Cb:偶联物中 A、B2 种物质摩尔浓度比 （结合比 ）;ACam,ACbm偶: 联物分别在 A、B 最大吸收波长下的吸光值 ;KAam,KBbm:A、B 在各自最 大吸收波长下的摩尔消光系数 ;KAbm:A 在 B

9、最大吸收峰波长处的摩尔 消光系数 ;KBam:B在 A 最大吸收峰波长处的摩尔消光系数 12。2 结果2.1 四环素衍生物 TC（1 C20H17O9N）和 TC（2 C20H19O8N3）的 HPLC-MASS 鉴定图 1 和图 2 是 TC1的 HPLC-MASS谱图,TC1在液相色谱上的保留时 间为 5.23min,其余为杂质峰 ,通过积分计算其纯度为 83.35%;质谱图中 454 和 438 分别 TC1与 K+和 Na+的离子峰 ,计算出相对分子质量（ Mr ） 为 415,与实际 Mr 相符,说明 TC1合成成功。图 3和图 4为 TC2HPLC-MASS 谱图,TC2的保留时间

10、为 9.49min,积分得其纯度为 52.46%,杂质较多 ,在与 载体蛋白偶联前需通过进一步纯化 ;质谱图中 428.1 为其阴离子峰 ,计算 得其 Mr 为 429,与实际 Mr 相符 ,由此判断 ,四环素衍生化合成成功。图 1TC1HPLC图（略）图 2TC1质谱图（略）2.2TC-BSA和 TC-sBSA的 HPLC分析取透析后 TC-BSA和 TC-sBSA做 HPLC 分析 ,得到图 5 和图 6 的色谱分析图。图中最高峰的出峰时间分别为 8.960min 和 8.925min,与 BSA的出峰时间类似 ,为 TC-BSA和 TC-sBSA偶 联物的吸收峰。但图 5 中左边有 2

11、个比较突出的吸收峰 ,可能为 BSA在 与四环素偶联过程中自身活性氨基与活性羧基相互交联而形成聚合物 , 对比图 6,经过羧基化的 BSA产生的聚合物明显减少 ,偶联物的纯度有所提高。2.3TC-sBSA和 TC-BSA的红外分析比较 TC-BSA和 BSA的红外光谱发现 , 它们在 36003200cm-1 区域以及 17001600cm-1 区域具有相似的吸 收,这是蛋白质中氨基酸产生的特征峰 ,说明合成的 TC-BSA化合物具有 BSA的特征官能团。将 TC-sBSA和 TC-BSA的红外光谱与 TC的红外光谱 相比较:在 TC-sBSA和 TC-BSA的红外光谱 947cm-1和 863cm-1处,出现了 2 个明显的四环素特征峰 ,而 BSA 在此处无明显吸收 ,说明 TC-sBSA和 TC-BSA具有 TC 的特征官能团的存在 ,由此说明 TC-sBSA和 TC-BSA人工 抗原偶联成功 ,可以作为免疫抗原。图 3TC2HPLC图（略）图 4TC2质谱图（略）图 5TC-BSA的 HPLCmap图（略）图 6TC-sBSA的 HPLCmap图（略）2.4TC-BSA和 TC-sBSA偶联比计算图 8 为各样品的紫外扫描吸收光谱分 析。分析中所用 TC的浓度为 50