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文档简介
1、形态学试验常用试剂配置方法4%多聚甲醛多聚甲醛 4g,加蒸馏水 100ml,加热至 60,搅拌并加入 1M NaOH 数滴,调 pH 至 7.0,滤纸过滤,现配现用。0.01MPBS 缓冲液氯化钠 (NaCl)8.50g磷酸氢二钠 (Na2HPO412H2O)3.58g磷酸二氢钠 (NaH2PO42H2O)0.39g加双蒸水至1000ml1M NaOH 调整 pH 至 7.2-7.4,室温存放。一袋独立包装的 PBS(2000ml)加 2000ml 蒸馏水溶解0.01mol/L 枸橼酸缓冲液柠檬酸0.2g柠檬酸三钠1.5g加双蒸水至500ml1M NaOH 调整 pH 至 6.0,现用现配。铬
2、矾明胶液铬矾0.5g明胶5g蒸馏水1000ml以 500-800ml 蒸馏水加温溶解明胶, 待其完全溶解后加入铬矾, 最后加蒸馏 水至 1000ml。载玻片事先以酸、碱洗涤剂洗净,蒸馏水洗,烤干,包被时水温 不超过 70。DAB 试剂的配制(以 DAB 试剂盒为例)在 1.5mlEP管内加入 1-1.5ml 蒸馏水,加入一滴试剂 A,混合均匀,然后将 试剂 B 和试剂 C各一滴加入其中,再次混匀。此溶液必须现配现用,配好后避光保存, 30 分钟内使用,剩余的液体应弃石蜡切片的制备1. 组织块从固定液中取出,流水冲洗 1-2h2. 脱水: 70%酒精 80%酒精 95%酒精 95%酒精无水酒精
3、无水酒精,各级酒精浸泡 30min-1h。3. 透明:彻底脱水后的组织经苯苯,各浸泡 30mim-1h。4. 浸蜡:完全透明的组织放入 56-58石蜡中 2-3h。5. 包埋:被切面向下包埋于石蜡中,冷却后成蜡块。6. 切片:旋转式切片机将蜡块切成 5-10m薄片,贴在经铬矾明胶处理的载 玻片上。7. 58-60烤片 2-4小时。冰冻切片的制备1. 组织块从固定液中取出或者是刚刚取材的新鲜标本放入20%的蔗糖溶液中直至标本沉底(大约需要 12-20 小时);2. 0.01MPBS 缓冲液冲洗, 5min;3. 放入冰冻切片机内进行冰冻固定4. 待组织快固定好后行连续冰冻切片,片厚 5-20m,
4、放入 -20冰箱内保 存。免疫组织化学染色步骤 1将石蜡切片二甲苯脱蜡(二甲苯 20min二甲苯 10min)、入水( 100%酒 精5min100%酒精3min95%酒精 2min80%酒精1min70%酒精 1min), 蒸馏水冲洗后, 0.01M PBS冲洗, 5min3 次; 2枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复,加热使水温达 92-96,维持 10-15min,自 然冷却至室温, 0.01M PBS冲洗, 5min3 次; 33%H2O2溶液, 37, 20 min,以消除内源性过氧化物酶的活性, 0.01M PBS 冲洗, 5min3 次; 4正常羊血清封闭, 37, 30 min; 5倾
5、去多余血清,滴加一抗,372 小时或者 4过夜,0.01M PBS冲洗,5min3 次;6滴加二抗工作液, 37, 30 min,0.01M PBS冲洗, 5min3次;7滴加三抗工作液, 37, 30 min,0.01M PBS冲洗, 5min3次; 8DAB 避光显色,显微镜下控制显色时间;90.01M PBS 终止显色;10梯度酒精脱水( 70%酒精 1min80%酒精 1min95%酒精 1min 95%酒 精 1min无水酒精 10min无水酒精 10min),二甲苯透明(二甲苯 15min 二甲苯 10min;11中性树胶封片。免疫荧光染色步骤(1) 将组织切片脱蜡入水;(2) 抗
6、原微波修复,温度 92-96, 10-15min,自然冷却至室温;(3) 正常羊血清封闭, 37,60 min;(4) 倾去多余血清,滴加一抗, 372小时或者 4过夜, PBS冲洗, 5min3次;(5) 滴加荧光素标记的二抗,避光, 37,60 min,0.01M PBS冲洗, 5min3 次;(6) 防淬灭封片剂封片, 4,避光保存。(7) 荧光显微镜观察拍照。细胞免疫组化染色(培养板中染色)1培养的细胞,弃去培养基,冷的 PBS 洗两次,首先用 4%多聚甲醛( 4 孔板 200)l固定 10min,PBS洗 2次,每次 510 分钟。2在含 0.1% Triton X-100(4孔板
7、200)l的PBS中进行 10min的透膜处理,PBS 洗 2 次,每次 5-10 分钟。手动轻轻晃动数次,吸尽液体。3羊血清用 PBS配制成 4羊血清封闭液,室温封闭( 4孔板 200)l30分钟。 4吸尽液体,勿洗,添加一抗,于 37条件下孵育 1h 或放在 4冰箱过夜, PBS 洗 3 次,每次 5-10 分钟。5去除一抗后,细胞用 PBS 洗三次。 6加入二抗,然后加入相对应的孔,在 37下作用 30-60min。PBS洗 3次,每 次 5-10 分钟。7吸尽液体,加入三抗,在室温条件下作用 30-60min。PBS洗3次,每次 5-10 分钟。同时采用不添加一抗,而仅添加二抗及三抗的
8、细胞作为阴性对照组。8DAB 避光显色,显微镜下控制显色时间; 9PBS终止显色;显微镜下观察拍照。细胞免疫荧光染色(培养板中染色) 1培养的细胞,弃去培养基,冷的 PBS 洗两次,首先用 4%多聚甲醛( 4 孔板 200)l固定 10min,PBS洗 2次,每次 510 分钟。2在含 0.1% Triton X-100(4孔板200)l的PBS中进行 10min的透膜处理,PBS 洗 2 次,每次 5-10 分钟。手动轻轻晃动数次,吸尽液体。3羊血清用 PBS配制成 4羊血清封闭液,室温封闭( 4孔板 200)l30分钟。 4吸尽液体,勿洗,添加一抗,于 37条件下孵育 1h 或放在 4冰箱
9、过夜, PBS 洗 3 次,每次 5-10 分钟。5去除一抗后,细胞用 PBS 洗三次。6滴加荧光素标记的二抗,避光, 37,60 min,0.01M PBS冲洗, 5min3 次; 7防淬灭封片剂封片, 4,避光保存。8荧光显微镜观察拍照。 细胞爬片后的步骤同切片的免疫组织化学及免疫荧光的步骤。HE 染色1. 石蜡切片常规脱蜡入水:二甲苯、各15min100%酒精、 95%酒精、 80%酒精 70%酒精 50%酒精各 1-2min。2水洗:普通水洗 2 次,蒸馏水洗 1 次。3. 苏木素染色 10min。4. 充分水洗:自来水洗 10min。5. 盐酸酒精分色:分色 10-30s,随时镜检分色程度,使不该着色的部分全部褪 去,应着色的部分着色适当。着色标准:胞核为深蓝色,胞质无色或浅灰色。6. 充分水洗:自来水洗 10min。7. 氨水蓝化 2-3min。8. 充分水洗:自来水洗 10-15min,水洗后若染
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