形态学试验常用试剂配置方法

1、形态学试验常用试剂配置方法4%多聚甲醛多聚甲醛 4g，加蒸馏水 100ml，加热至 60，搅拌并加入 1M NaOH 数滴，调 pH 至 7.0，滤纸过滤，现配现用。0.01MPBS 缓冲液氯化钠 （NaCl）8.50g磷酸氢二钠 (Na2HPO412H2O)3.58g磷酸二氢钠 (NaH2PO42H2O)0.39g加双蒸水至1000ml1M NaOH 调整 pH 至 7.2-7.4，室温存放。一袋独立包装的 PBS（2000ml）加 2000ml 蒸馏水溶解0.01mol/L 枸橼酸缓冲液柠檬酸0.2g柠檬酸三钠1.5g加双蒸水至500ml1M NaOH 调整 pH 至 6.0，现用现配。铬

2、矾明胶液铬矾0.5g明胶5g蒸馏水1000ml以 500-800ml 蒸馏水加温溶解明胶， 待其完全溶解后加入铬矾， 最后加蒸馏 水至 1000ml。载玻片事先以酸、碱洗涤剂洗净，蒸馏水洗，烤干，包被时水温 不超过 70。DAB 试剂的配制（以 DAB 试剂盒为例）在 1.5mlEP管内加入 1-1.5ml 蒸馏水，加入一滴试剂 A，混合均匀，然后将 试剂 B 和试剂 C各一滴加入其中，再次混匀。此溶液必须现配现用，配好后避光保存， 30 分钟内使用，剩余的液体应弃石蜡切片的制备1. 组织块从固定液中取出，流水冲洗 1-2h2. 脱水： 70%酒精 80%酒精 95%酒精 95%酒精无水酒精

3、无水酒精，各级酒精浸泡 30min-1h。3. 透明：彻底脱水后的组织经苯苯，各浸泡 30mim-1h。4. 浸蜡：完全透明的组织放入 56-58石蜡中 2-3h。5. 包埋：被切面向下包埋于石蜡中，冷却后成蜡块。6. 切片：旋转式切片机将蜡块切成 5-10m薄片，贴在经铬矾明胶处理的载 玻片上。7. 58-60烤片 2-4小时。冰冻切片的制备1. 组织块从固定液中取出或者是刚刚取材的新鲜标本放入20%的蔗糖溶液中直至标本沉底（大约需要 12-20 小时）；2. 0.01MPBS 缓冲液冲洗， 5min；3. 放入冰冻切片机内进行冰冻固定4. 待组织快固定好后行连续冰冻切片，片厚 5-20m，

4、放入 -20冰箱内保 存。免疫组织化学染色步骤 1将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯 20min二甲苯 10min）、入水（ 100%酒 精5min100%酒精3min95%酒精 2min80%酒精1min70%酒精 1min）， 蒸馏水冲洗后， 0.01M PBS冲洗， 5min3 次； 2枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达 92-96，维持 10-15min，自 然冷却至室温， 0.01M PBS冲洗， 5min3 次； 33%H2O2溶液， 37， 20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性， 0.01M PBS 冲洗， 5min3 次； 4正常羊血清封闭， 37， 30 min； 5倾

5、去多余血清，滴加一抗，372 小时或者 4过夜，0.01M PBS冲洗，5min3 次；6滴加二抗工作液， 37， 30 min，0.01M PBS冲洗， 5min3次；7滴加三抗工作液， 37， 30 min，0.01M PBS冲洗， 5min3次； 8DAB 避光显色，显微镜下控制显色时间；90.01M PBS 终止显色；10梯度酒精脱水( 70%酒精 1min80%酒精 1min95%酒精 1min 95%酒 精 1min无水酒精 10min无水酒精 10min)，二甲苯透明(二甲苯 15min 二甲苯 10min；11中性树胶封片。免疫荧光染色步骤(1) 将组织切片脱蜡入水；(2) 抗

6、原微波修复，温度 92-96， 10-15min，自然冷却至室温；(3) 正常羊血清封闭， 37，60 min；(4) 倾去多余血清，滴加一抗， 372小时或者 4过夜， PBS冲洗， 5min3次；(5) 滴加荧光素标记的二抗，避光， 37，60 min，0.01M PBS冲洗， 5min3 次；(6) 防淬灭封片剂封片， 4，避光保存。(7) 荧光显微镜观察拍照。细胞免疫组化染色(培养板中染色)1培养的细胞，弃去培养基，冷的 PBS 洗两次，首先用 4%多聚甲醛( 4 孔板 200)l固定 10min，PBS洗 2次，每次 510 分钟。2在含 0.1% Triton X-100(4孔板

7、200)l的PBS中进行 10min的透膜处理，PBS 洗 2 次，每次 5-10 分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。3羊血清用 PBS配制成 4羊血清封闭液，室温封闭( 4孔板 200)l30分钟。 4吸尽液体，勿洗，添加一抗，于 37条件下孵育 1h 或放在 4冰箱过夜， PBS 洗 3 次，每次 5-10 分钟。5去除一抗后，细胞用 PBS 洗三次。 6加入二抗，然后加入相对应的孔，在 37下作用 30-60min。PBS洗 3次，每 次 5-10 分钟。7吸尽液体，加入三抗，在室温条件下作用 30-60min。PBS洗3次，每次 5-10 分钟。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗及三抗的

8、细胞作为阴性对照组。8DAB 避光显色，显微镜下控制显色时间； 9PBS终止显色；显微镜下观察拍照。细胞免疫荧光染色（培养板中染色） 1培养的细胞，弃去培养基，冷的 PBS 洗两次，首先用 4%多聚甲醛（ 4 孔板 200）l固定 10min，PBS洗 2次，每次 510 分钟。2在含 0.1% Triton X-100（4孔板200）l的PBS中进行 10min的透膜处理，PBS 洗 2 次，每次 5-10 分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。3羊血清用 PBS配制成 4羊血清封闭液，室温封闭（ 4孔板 200）l30分钟。 4吸尽液体，勿洗，添加一抗，于 37条件下孵育 1h 或放在 4冰箱

9、过夜， PBS 洗 3 次，每次 5-10 分钟。5去除一抗后，细胞用 PBS 洗三次。6滴加荧光素标记的二抗，避光， 37，60 min，0.01M PBS冲洗， 5min3 次； 7防淬灭封片剂封片， 4，避光保存。8荧光显微镜观察拍照。 细胞爬片后的步骤同切片的免疫组织化学及免疫荧光的步骤。HE 染色1. 石蜡切片常规脱蜡入水：二甲苯、各15min100%酒精、 95%酒精、 80%酒精 70%酒精 50%酒精各 1-2min。2水洗：普通水洗 2 次，蒸馏水洗 1 次。3. 苏木素染色 10min。4. 充分水洗：自来水洗 10min。5. 盐酸酒精分色：分色 10-30s，随时镜检分色程度，使不该着色的部分全部褪 去，应着色的部分着色适当。着色标准：胞核为深蓝色，胞质无色或浅灰色。6. 充分水洗：自来水洗 10min。7. 氨水蓝化 2-3min。8. 充分水洗：自来水洗 10-15min，水洗后若染