土壤中细菌总数的测定实验

1、实验四细菌总数的测定纯种分离一、目的1. 掌握从环境（土壤和活性污泥等）微生物群体中获得纯种微生物的分离和 培养技术。2. 掌握无菌操作技术。二、材料和器皿1. 扭力天平、取土样工具、涂布棒 （接种棒 ）。2. 无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。3. 无菌水。4. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。三、实验操作步骤1、取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取 210cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。土样取回后应尽快投入实验，同时取 10-15g,称重后经105oC烘干8h,置于干燥器中

2、冷却后再次称重，计算含水量。2、倒平板熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。3、编号取5支无菌空试管（15X 150mm依次编号为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。4、分装无菌水按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的 各无菌空试管中。5. 制备土壤稀释液称土样 1g 于盛有 99mL 无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡1020min，使土样中的菌体、芽孢 或孢子均匀分散，此即为 10-2浓度的菌悬液。用无菌移液 管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三 次、摇匀，此即为

3、 10-3浓度。同样方法，依次稀释到 10-7。 稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。环境要求：琼脂平板在工作台暴露 15 分钟，每个平板不得超过 15 个菌落。代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。减少误差：每递增稀释一次即换用 1 支 1ml 灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿 使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。6、培养及计数培养条件：倒置于361 xx箱内培养48士 2h计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0 4C,但不得超过24h。计平皿中菌落数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记

4、下各平板的菌落总数，求出同稀 释度的各平板平均菌落数。规律：不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落 数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现 象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限， 则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落 计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平 板的菌落数乘 2 代

5、表全平板的菌落数。当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于 300 时），但分布很均 匀，可取平板的一半或计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。计数原则：选平均菌落数在 30300 之间者进行计算1. 仅 1 个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数 报告之。2. 若有 2 个稀释度的平均菌落数在 30300之间时，则按两者的菌落总数之 比来决定，若比值小于 2应报告两者的平均数；若大于 2 则报告其中较小的菌落 总数。3. 若所有稀释度的平均菌落数均大于稀释倍数报告之。4. 若所有稀释度的平均菌落数均小于 乘以稀释倍数报告之。5. 若所有稀释度的平均菌落数均不在

6、 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。300，以稀释度最高的平均菌落数乘以30，则应按稀释度最低的平均菌落数30300之间，则以最接近 300或 306. 若所有的菌落数匀为 “无法计数 ”时，应注明水样的最大稀释倍数。7. 在求同稀释度的平均数时，若其中 1 个平板上有较大片状菌落生长时，则 不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状 菌落约为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌 落计数，然后乘以 2 作为整个平板的菌落数。报告原则例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌菌落数报告方式10-110-210-3 落数之比（个/mL）（个/mL）20

7、00 或 1.6 X 104461.000 或 3.8 X 104602.000或 2.7 X1044 无法计数 00或 5.1 X 1055271 15270或 2.7 X 1026 无法计数 305 1200或 3.1 X 1047 无法计数 10-3无法计数7、菌落总数报告方式菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在 1100 时，按实有数字报 告，如大于 100 时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为 了缩短数字后面的零位，可用 10的指数来表示。固体检样以克（g）为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单位报告，表面 涂擦则以平方厘米（cm2）报告。8. 计数选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在30300之间的平皿，霉菌选菌落数在10100