提RNA+逆转录+qRT-PCR步骤知识分享

1、【一、提 RNA】一、实验准备：1、试剂： 75%乙醇、 Trizol 、1.5mL 进口 EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头 （RNA专用 ）、2、配 75%乙醇（DEPC水+无水乙醇 ） ，放-20 冰箱预冷；3、预冷离心机 （1.5mL EP 管用的 ） ；4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩；二、操作步骤：01、弃上清（不回收，直接倒去）；02、 1mL/孔 PBS 洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200L枪吸尽 PBS）；03、每孔加 500 L Trizol ，轻晃，随后室温放置 2min 左右； 04、枪头吹打，吸出放入 1.5mL 进口 EP 管；05、加入 100L氯

2、仿（即 1/5 体积的 trizol） ；06、 4离心机， 12000g， 15min；07、吸 200L（可减少）上清放入新的 1.5mL 进口 EP管中（注意：只能吸到上清）； 08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min（15min） ；09、 4离心机， 12000g， 10min；10、倒掉液体，加入 1mL预冷的 75%乙醇剧烈混匀；11、4离心机， 7500g， 5min；12、倒掉上清，加入 1mL预冷的 75%乙醇，混匀；13、4离心机， 7500g， 5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上， 5-10min ，用针头或者 200 微升枪头去掉管壁上的水珠；

3、15、每管中加入 40L（40-60L）的 DEPC水，吹打溶解；16、测浓度（先知楼 21楼测 RNA浓度，带 DEPC水、灭菌的 dd 水、10 微升枪和枪头）；三、注意事项01、如果当时不测 RNA浓度，可暂时把 RNA放在-20 冰箱。但长时间 （24h） 保存，需要放 在-80 冰箱；02、异丙醇作用是沉淀 RNA，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、测 RNA浓度】一、实验准备：01、先知楼 21楼-2109 教室，一个冰盒 +DEPC水+10微升枪、灭菌 dd H2O、10L 枪头（RNA 专用 ） 、本子 +笔；二、操作步骤：01、登记；02、打开电脑

4、 =打开“ N”软件 =点击“ Nucleic acid ” =选择“ OK” =选择“ RNA”； 03、灭菌 dd H2O 清洗 2-3 遍，擦干；04、 DEPC水 校零：即加 DEPC水一滴，点击“ Blank ”，擦干；05、测 RNA：加样品一滴，点击“ measure”，擦干，随后加下一个样品； 06、记录数据，包括 RNA浓度（ 0.1 。（请注意，这个值跟仪器 无关， 核酸的吸光度必需大于 0.1 ，其值才有效和可靠， 因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的 干扰通常会对光有一定吸收，其值 0.1 ）；2. A280nm、 A270nm 是蛋白最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸

5、样品纯度评估：纯DNA 的A260/A280 比值为 1.8 ，纯 RNA为 2.0 。 如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污 染，需要纯化样品。比值 =1.5 相当于 50蛋白质 /DNA溶液. 酚的最大吸收峰在 270nm。3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估： 纯 DNA 和 RNA的 A260/A230 比值为 2.5 。若比值小于 2.0 标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂 污染，需要纯化样品。 A230 产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A2

6、30 的负值会被校正。4. A320nm 或 A340nm 为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近 0.0 。如果不是， 标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。纯样品的 A320 一般是 0。5. A260/A280 和 A260/A230 是核酸纯度的指示值。纯度好的 DNA或 RNA，在 pH7-8.5 下 A260 / A280 的比值应该在 2.0 或 2.5 。纯净的样品比值大于 1.8 （ DNA）或者 2.0 （ RNA）。如果比值低 于 1.8 或者 2.0 ，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。 A230 表示样品中存在一些污染物，如 碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核

7、酸 A260/A230 的比值大于 2.0 。当 0.5 BSA蛋白质污 染时，蛋白污染会导致 260 和 280 的数值都下降，其净结果是 260/280 比值下降，但 260/280 的比值变化并不显著， 正如分子克隆 3所说。但蛋白残留会导致 230 的数值显著上升， 显著影响 260/230 的比值。也就是说，如果 RNA样品的 260/280 1.7 ，260 /230 0.5 ，那么就应该考虑 污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留.用分光光度计测量 RNA时，用水而不是用 TE 缓冲液稀释 RNA样品会造成 A260/A280 比值下降。 原因是低离子强度和低 pH 溶液会增加 28

8、0 nm处的光吸 收值。加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多，那样就很容易被蛋白污染，所以现在一般取 400ul 左右。6. 当 260/2301 时，只有两种情况。一是胍盐污染，二是蛋白污染。三、逆转录】、实验准备： 01、进口 10L枪头 （qRT-PCR专用） 、冰盒一个、 200L进口 EP管；02、冰上融化 1、2、4、2号试剂 （提前半小时 ）；03、二、操作步骤：试剂盒： 1. 22. 0.53. 0.54. 0.5RNA 1000ngDEPC 水10LL( 最后加入 )LL L 体系01、 200L进口管子： EP管加相应 DEPC水=加 1号试剂（ 2L）=加 3号试剂（0.

9、5 L)=加 4号试剂 (0.5 L)=加 2号试剂(0.5 L)=加 RNA=离心=上机； 02、上机： OPEN=点 击“ User ”菜单下的“ clx ”，点击“ Accept ”=选择“ run ”下面的 到“ exp001 rt ”=修改体系“ 10L”（默认为 25微升）=点击“ Start ”，进入界面； 03、 37.0 15min=85.0 5s=4.0 60min ；04、 4冰箱 保存；三、注意事项01、加液尽量无气泡，枪不要打到底；02、严格冰上操作，防止 RNA降解；qRT-PCR】、实验准备： 01、试剂： Roche 的 SyBr Green(rox)02、 1

10、.5mL EP管、 0.2mL EP管、 96孔板/八连冠； 10L、20L、100L、200L、2.5 L、 1000L 枪；03、冰盒一个、 Rox化冻 (避光) 、引物化冻( GAPD)H 、 cDNA、 DEPC水；、操作步骤：01、Rox10L+ dd H2O6 L；+ P1(F)1+P2(R)1+cDNA220 L 体系02、计算：每个样， X个抗体 (至少包括 GAPDH内- 参,还有目的 ) ，三个副孔。即如果六个样， 2 个抗体 (GAPDH,PLK1)，三个副孔。 6*1*3=18 20(PLK1) ，6*1*3=18 20(GAPDH)；1234567891011126/

11、 PLK16/ PLK16/ PLK15/ PLK15/ PLK15/ PLK16/GAP6/GAP6/GAP5/GAP5/GAP5/GAP4/ PLK14/ PLK14/ PLK13/ PLK13/ PLK13/ PLK12/ PLK12/ PLK12/ PLK11/ PLK11/ PLK11/ PLK14/GAP4/GAP4/GAP3/GAP3/GAP3/GAP2/GAP2/GAP2/GAP1/GAP1/GAP1/GAPPLK1Rox： 10*20=200 LDEPC水： 6*20=120 LF：1*20=20 LR： 1*20=20 LGAPDHRox： 10*20=200 LDEPC水

12、： 6*20=120 LF：1*20=20 LR： 1*20=20 L03、稀释 cDNA 10倍(18L DEPC水+2 L)=配置 Mix(Rox+ DEPC水+F+R)=加样 (一横排 先加 18L mix(GAPDH)，随后加入 18L mix(PLK1) 。随后六个孔加同一个 cDNA； 06、去除气泡：加好样后，观察有无气泡。如果有气泡，弹开，随后2000rpm 离心，时间不定 (5s 即可 ) ； 07、上机 +设置程序：A 、双击打开程序“ StepOne Software v2.1 ” =点击“ OK ” =点击“ Ignore & Continue Startup ” =点

13、击“ Advanced Setup ” =进入“ Experment Properties 界 面”；B、 Experment Properties 界面 ：将 Expriment Name 从 Untitled 修改为“日期，如 2015-12-17 ” ，将 User Name(Optional) 修改为“ CZL”；Which instrument are you using to run the experiment ?中选择“ 96 wells ”，一般无需修改；What type of experiment do you want to setup ? 中 选 择 “ Quanti

14、tation-Comparative CT( CT)”；Which reagents do you want to use to detect the target sequence ?中选择“ SYBR Green Reagents ”；Which ramp speed do you want to use in the instrument run ?中选择“ Fast(40 minutes to complete a run) ”；C、 Plate Setup 界面 -Define Targets and Samples界面：Define Targets 栏中：如果有 GAPDH、PLK

15、1、Akt 、PI3K 三个引物， 则点击“ Add New Target ”三下，出现“ Target1 、 Target2 、Target3 、 Target4 ”三个 =将其重命名；Define Samples 栏中：如果有 6 个样品 (N;1.5;3;6;9;12) ，则点击“ Add New Sample ”，出现“ Sample 1 、Sample 2 、 Sample 3 、Sample 4 、 Sample 5 、 Sample 6”六 个=将其重命名；Plate Setup界面 - Assign Targets and Samples界面 ：GAP/1GAP/1GAP/1G

16、AP/2GAP/2GAP/2GAP/3GAP/3GAP/3GAP/4GAP/4GAP/4Plk1 /1Plk1 /1Plk1 /1Plk1 /2Plk1 /2Plk1 /2Plk1 /3Plk1 /3Plk1 /3Plk1 /4Plk1 /4Plk1 /4Akt/1Akt/1Akt/1Akt/2Akt/2Akt/2Akt/3Akt /3Akt /3Akt/4Akt/4Akt/4PI3K/1PI3K/1PI3K/1PI3K/2PI3K/2PI3K/2PI3K/3PI3K/3PI3K/3PI3K/4PI3K/4PI3K/4GAP/5GAP/5GAP/5GAP/6GAP/6GAP/6Plk1 /5Plk1 /5Plk1 /5Plk1 /6Plk1 /6Plk1 /6Akt/5Akt/5Akt/5Akt/6Akt/