第三章基因组文库的构建

1、第三章第三章 基因组基因组文库的构建文库的构建 在基因文库中存在两类基本的基因序列。在基因文库中存在两类基本的基因序列。 基因组基因组文库文库(genomic library)(genomic library)即即基因文库基因文库( (gene bank)gene bank)。 构建构建基因文库：基因文库： 一是构建一是构建dnadna文库文库。dnadna文库是含有某种生物体全部基因的文库是含有某种生物体全部基因的 随机片断的重组随机片断的重组dnadna克隆群体克隆群体。其中可能含有基因外显子、。其中可能含有基因外显子、 内含子、基因内含子、基因5端调控区、端调控区、3端的尾随序列以及基因

2、间的端的尾随序列以及基因间的 间隔区。间隔区。 二是构建二是构建cdna文库文库。cdna文库是克隆的重组文库是克隆的重组cdna的总的总 和，通常是建立在细菌或酵母中。和，通常是建立在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特这些克隆代表从某个特 定物种或器官的所有定物种或器官的所有mrna制备得到的制备得到的cdna。它是以细。它是以细 胞中的胞中的mrna为模板，用反转录酶合成的双链为模板，用反转录酶合成的双链dna。 组织 载体 ( 选择一种) mrna dna cdna 部分或完全 消化的 dna 甲基化，加接头 的双链 dna 大小分级 可供克隆的 dna 片段 连接 dna 片段和载体

3、重组载体 dna 导入 e.coli (体外包装或转化) 基因库的鉴定与效价测定 筛选目的基因 扩增文库长期保存 构建基因组 dna 和 cdna 文库的流程示意图 用用噬菌体置换型载体构建基因文库。用限制噬菌体置换型载体构建基因文库。用限制 性酶消解性酶消解噬菌体载体，切除了中央的片段，噬菌体载体，切除了中央的片段， 再用相同的限制性酶剪切外源基因组再用相同的限制性酶剪切外源基因组dna，将，将 约约15kb的酶切片段随机地和的酶切片段随机地和噬菌体载体的两噬菌体载体的两 臂连接，形成线性的重组的串联体。用体外包臂连接，形成线性的重组的串联体。用体外包 装系统将串联体中单个的基因组装系统将串

4、联体中单个的基因组dna分别包装分别包装 入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌体颗入不同噬菌体头部，形成不同的重组噬菌体颗 粒。用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬粒。用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬 菌斑。每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一菌斑。每一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一 个克隆。各个克隆带有不同的细胞个克隆。各个克隆带有不同的细胞dna片段。片段。 体外包装体外包装 重组重组噬菌体载体的体外包装有两种不同的策略。一是利噬菌体载体的体外包装有两种不同的策略。一是利 用与编码包装蛋白的基因的突变体。野生型噬菌体的的包用与编码包装蛋白的基因的突变体。野生型噬菌体的的包 装需要装需要e

5、 e、d d、a a等基因的产物，这些基因中的任何一个发等基因的产物，这些基因中的任何一个发 生突变噬菌体都不能顺利包装，从而在宿主的细胞中积累生突变噬菌体都不能顺利包装，从而在宿主的细胞中积累 了大量的前头部蛋白。了大量的前头部蛋白。bhb2688bhb2688和和 bhb2690bhb2690两种菌株正是这两种菌株正是这 两种突变菌株，前者是两种突变菌株，前者是e e的突变体，后者是的突变体，后者是d d 基因的突变体。基因的突变体。 噬菌体感染这两种菌株时均不能产生噬菌体颗粒，但将噬菌体感染这两种菌株时均不能产生噬菌体颗粒，但将 这两种裂解液合并在一起，由于基因的互补作用，可以产这两种裂

6、解液合并在一起，由于基因的互补作用，可以产 生成熟的噬菌体颗粒。利用这个原理可以进行体外包装。生成熟的噬菌体颗粒。利用这个原理可以进行体外包装。 另一种思路是利用包装信号的突变体。另一种思路是利用包装信号的突变体。噬菌体的噬菌体的 包装是通过头部蛋白上的包装是通过头部蛋白上的a a蛋白蛋白识别识别coscos区，对由滚区，对由滚 环复制产生的串联体环复制产生的串联体dnadna加以剪切，正好将一个基加以剪切，正好将一个基 因组的因组的dnadna切下，包装成噬菌体颗粒。如制备切下，包装成噬菌体颗粒。如制备coscos位位 点的突变体，使噬菌体可以合成完整的外壳蛋白，点的突变体，使噬菌体可以合成

7、完整的外壳蛋白， 但却不能包装，而重组质粒上装有正常的但却不能包装，而重组质粒上装有正常的coscos区，区， 从而能被包装成噬菌体颗粒。这两种策略都是从而能被包装成噬菌体颗粒。这两种策略都是 噬菌体突变体的溶原菌，来制备包装抽提物。噬菌体突变体的溶原菌，来制备包装抽提物。 噬菌体克隆文库的构建噬菌体克隆文库的构建 (a)将外源基因组的将外源基因组的dna片段克隆到片段克隆到噬菌体载体噬菌体载体 中来构建基因组中来构建基因组dna文库。菌苔上的噬菌斑中文库。菌苔上的噬菌斑中 含有大量不同的重组噬菌体，每一个噬菌斑来含有大量不同的重组噬菌体，每一个噬菌斑来 自单个感染噬菌体的一个克隆。各个克隆带

8、有自单个感染噬菌体的一个克隆。各个克隆带有 不同的细胞不同的细胞dna片段。现在的难题是用探针与片段。现在的难题是用探针与 带有目的基因的克隆进行杂交来鉴别携带着特带有目的基因的克隆进行杂交来鉴别携带着特 殊基因的克隆。殊基因的克隆。 (b) 噬菌斑的模式被转移到尼龙膜上，而噬噬菌斑的模式被转移到尼龙膜上，而噬 菌体的蛋白被溶解，和重组体菌体的蛋白被溶解，和重组体dna分开，分开， dna吸附到膜上。再将此膜与带有放射吸附到膜上。再将此膜与带有放射 性同位素标记的探针进行分子杂交，可性同位素标记的探针进行分子杂交，可 以杂交的便是目的基因。带有此以杂交的便是目的基因。带有此dna的的 克隆可通

9、过放射自显影而显现出来。这克隆可通过放射自显影而显现出来。这 样阳性克隆可从培养基中分离出来，再样阳性克隆可从培养基中分离出来，再 转接到新鲜的宿主菌中，使目的因得到转接到新鲜的宿主菌中，使目的因得到 扩增。扩增。 重组噬菌体 细胞 基因组 噬菌体 尼龙膜 膜 与放射性探针 进行分子杂交 膜 用放射自显影 定位阳性克隆 阳性克隆 用限制性 酶剪切 提取dna 用限制性酶剪切 用连接酶 连接 重组体dna 细菌 感染裂解释放噬菌体 噬菌斑中的 噬菌体克隆 菌苔 噬菌体克隆文库 感染新鲜 的宿主菌 扩增外 源基因 cdna文库文库(cdna library) ： 克隆的重克隆的重 组组cdna的集

10、合，通常是在细菌或酵母中。的集合，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有有mrna制备得到的制备得到的cdna。 cdna分子克隆分子克隆(cdna clone) ：将：将 cdna片段装在载体上转化细菌片段装在载体上转化细菌,扩增出多扩增出多 克隆的过程，最终可建立克隆的过程，最终可建立cdna文库。文库。 建库的目的：建库的目的： 1.从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；从复杂的基因组中分离单拷贝的基因； 2.是从来源复杂的总是从来源复杂的总mrna的的cdna文库中文库中 分离稀有的分离稀有的cdna克隆。克隆。 建库的关键：建

11、库的关键： 如何产生足够数量的重组如何产生足够数量的重组dna 建库应注意：建库应注意： 1.保证载体保证载体dna和靶和靶dna均不被外源均不被外源dna 序列污染；序列污染； 2.尽可能用尽可能用“ 电话克隆电话克隆”。 第一节 dna克隆片段的产生与分离 一一.基因组基因组dna的片段化的片段化 1.用限制酶片段化用限制酶片段化: 用限制酶消化用限制酶消化dna，不经凝胶电泳分部分离，不经凝胶电泳分部分离,直接和载直接和载 体连接的克隆方法叫鸟枪法体连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach) 存在的问题：存在的问题： 所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段所形成的

12、重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入的混合群体。以每个载体可插入13kbdna计算，计算， 基因库至少含基因库至少含1030万个重组质粒。从中筛出目的基万个重组质粒。从中筛出目的基 因工作量是很大的。因工作量是很大的。 目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个 基因分载在基因分载在 几个重组质粒上，筛出完整基因更不容几个重组质粒上，筛出完整基因更不容 易易。 2.随机片段化：随机片段化： 超声波超声波：可产生：可产生300bp的短片段。的短片段。 高速搅拌高速搅拌：1500转转/分分30分分 可切可切 平均长度平均长

13、度 8kb的分子群体。的分子群体。 3.双酶消化双酶消化 单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考虑到载单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考虑到载 体容量，如体容量，如 噬菌体插入片段不超过噬菌体插入片段不超过25kb,为此可为此可 选用识别选用识别4bp的限制酶的限制酶(切割平均长度为切割平均长度为256bp) , 识别识别6bp的限制酶切割平均长度的限制酶切割平均长度4096 bp. 双酶切产生的双酶切产生的dna片段平均大小不超过片段平均大小不超过 1kb,但如采用双酶部分消化，产物的分但如采用双酶部分消化，产物的分 子量可达子量可达1030 kda,它们存在着随机序它们存在着随机序 列

14、重叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可列重叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可 将这些片段群体按大小分开，可得到的将这些片段群体按大小分开，可得到的 分子量大小约为分子量大小约为20kda的随机的随机dna片段片段 群体。群体。 二二. dna片断大小的分部分离：片断大小的分部分离： 如已知含目的基因克隆片段的大小范围，如已知含目的基因克隆片段的大小范围， 可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝 胶电泳将胶电泳将dna群体按大小分部分离。群体按大小分部分离。 三三.目的基因克隆片段的富集。目的基因克隆片段的富集。 四.克隆数的确定 任一任一dna序列在文库中出现的概率：序列在

15、文库中出现的概率： n:该序列需要克隆的总数；该序列需要克隆的总数； p:待克隆待克隆dna序列在文库中设定的出现概率，序列在文库中设定的出现概率， 一般为一般为99； i：待克隆：待克隆dna片段的长度，假定为片段的长度，假定为17kb; g: 基因组基因组dna的总长度，如人类为的总长度，如人类为3109bp )/1ln( )1ln( gi p n 将数据代入上式将数据代入上式 = 8.1105 n的含义是克隆大小为的含义是克隆大小为17kb17kb的人类的人类dnadna时，所时，所 构建的基因文库数必须在构建的基因文库数必须在 8.18.110105 5个以上克个以上克 隆时，才能以隆

16、时，才能以9999的概率得到此克隆。的概率得到此克隆。 alu散在元件 限制性 酶切位点 探针1 探针2 探针3 5kb 启动子启动子启动子外显子 mrna mrnamrna (a) (b) 一个典型的基因组文库含有带有重叠基因片段的多拷一个典型的基因组文库含有带有重叠基因片段的多拷 贝克隆。贝克隆。 (a)用从原有的克隆用从原有的克隆dna片段制备的放射性探针能片段制备的放射性探针能 从典型的基因组文库中能分离各种基因片段。用探针从典型的基因组文库中能分离各种基因片段。用探针1 可用来筛选文库，从文库中分离重组可用来筛选文库，从文库中分离重组dna片段。用探片段。用探 针针2和和3来获得与上

17、述片段部分重叠的来获得与上述片段部分重叠的dna序列。罕见序列。罕见 的酶切位点和重复的酶切位点和重复dna序列序列(如如alu分散元件分散元件)可作为界可作为界 标，用来排列分离的基因组标，用来排列分离的基因组dna克隆。克隆。 (b)从文库中分离的单个的克隆片段含有最小的重从文库中分离的单个的克隆片段含有最小的重 叠叠dna片段的复合位点。在图中表示已克隆的片段的复合位点。在图中表示已克隆的50kb的的 基因组基因组dna中含有三个转录的基因。中含有三个转录的基因。 第二节 构建文库的载体 一一. .噬菌体载体噬菌体载体 基础：裸露的噬菌体重组基础：裸露的噬菌体重组dnadna转化宿主细胞

18、转化宿主细胞 或包装后转染宿主细胞。或包装后转染宿主细胞。 载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。 重组筛选：重组筛选： 插入载体插入载体通过可见标记的插入失活通过可见标记的插入失活( (cici 基基 因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈；因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈； 现代的载体携带现代的载体携带laczlacz 基因，以兰基因，以兰- -白斑筛白斑筛 选选) )。 供体供体dnadna的大小的大小： 插入载体：插入载体：0 010kbp;10kbp; 置换载体：置换载体：9 923kbp23kbp。 插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生插入大小范围

19、被有效形成噬菌斑的野生 型基因组型基因组 75-10575-105所限制。所限制。 主要应用主要应用： 插入载体插入载体:cdna:cdna克隆和表达文库克隆和表达文库; ; 噬菌体展示。噬菌体展示。 置换载体置换载体: :基因组基因组dnadna克隆。克隆。 general method for plating 5105 recombinants from an amplified dna library onto agar plates. e. coli cells are grown in lb broth containing maltose to induce expression

20、of the maltose receptor which promotes phage attachment as described in chapter 2. the bacteria are harvested during log phase growth and resuspended in mgs04 to enhance infection further. predetermined amountsof phage stock and bacterial culture are mixed and aliquoted into portions that correspond

21、 to 30,000 phagelplate. this plaque density is optimized so that each plaque is 1 mm in diameter and theentire plate is covered with closely packed, but distinct, plaques. after the phage and bacteria have beenincubated on ice in mgs04 to allow phage attachment to the bacteria, a small amount of mol

22、ten agarose (4550 ) is added to each tube and then the mixed contentsare poured onto a large le agar plate. thetop agarose solidifies at room temperature, fixing the position of the uninfected and infected bacterium inthe agarose layer. 将硝酸纤维膜 铺在平板上 用针在膜 上作标记 取下膜,编号 将第二 张膜铺 在平板 上 按胶上孔的位 置,在膜上扎孔 取下膜,

23、编号 将母板保 存在4 plaque lift hybridzations are used to screen a library using radioactive dna probes. (a)the first step in phage library screening is to place carefully a sheet of nitrocellulseom embrane directly onto the top agar of each agar master plate. registration marks are made by piercing the mem

24、brane with a syringe needle. the membrane is then peeled off to remove a portion of the phage in each plaque. a second membrane is placed onto the same master plate and registration marks are made to generate a replica filter. 在naoh溶液 中dna变性 在nacl/tris 溶液中中和 用紫外线 照射,使 dna交联 到膜上 用放射性探 针和膜杂交 洗脱非特异 性标记

25、探针 (b) the phage dna on the filters is denatured with naoh, neutralized, and then covalently attached to the filter by uv crosslinking.the methods for probe labeling and filter hybrrdization are the same as those used for southern blots . once the positive signal on the autoradiographic film is prop

26、erly aligned with the agar master plate, a glass pipette is used to isolate an agar core from the precise position corresponding to a positive hybridization signal on the aligned film. 限制性酶消解用来构建克隆dna的物理图谱。通过琼脂糖凝胶电泳来 分析限制性酶消解所产生的一些片段为制作限制性图谱提供信息。根据 单酶切和双酶切的结果，用酶（kpn和 hind ）来剪切载体，能构 建一个sal插入片段的不完全酶切图

27、谱。在插入dna序列中的这些被 克隆的限制性酶切片段缺少了载体的附加序列。m：标记泳道，是含有 已知不同长度的dna，用来衡量样本dna的分子大小。1：sal- kpn；2：hind；3：sal-hind；4：kpn-hind；5：ecor； 6：sal- ecor；7： kpn- ecor；8：hind- ecor 4. digestion - restriction map 二. 粘粒粘粒( (cosmid) )载体载体 基础：包含噬菌体cos位点的质粒； 导入宿主：经体外包装，再转染宿主细胞； 载体筛选：类似于质粒 重组筛选：可见标记插入失活和小片段插入 的阳性筛选； 供体dna大小：3

28、0-45kbp。插入大小范围被有 效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105所 限制。 主要应用：基因组文库构建。 真核基因组 dna 取代型噬菌体载体 cos charon 4a 机械剪切 ecori ecori 酶切 加人工接头 酶切 连接 cos cos 体外包装 转染 e.coli 三.质粒载体构建cdna文库 双链质粒 dna 5 3 aaaaaan 加锚定引物(寡聚 t) pbr322 5 3 aaaaan 3 5 tttt rt 酶 限制酶 用 naoh 降解 mrna 用 klenow 酶合成第二链 si 酶降解发夹结构 末端转移酶 dgtp 末端转移酶加寡聚 c ccc ccc

29、 ggg ggg 连接 转化 e.coli 扩增 以质粒为载体构建 cdna 文库 四.大容量克隆载体 基因组作图中使用的高容量人工染色体克隆载体的比较基因组作图中使用的高容量人工染色体克隆载体的比较。 载体系统克隆容量评价 yac(酵母人工染色体)酵母着丝粒,复制起始 点和端粒 200kb2mbp嵌合发生率高(在基因组 中不相连的连续片段)； 不稳定(自发缺失)； 很难与酵母染色体分离； pac(p1 人工染色体)细菌噬菌体 p1100300kb bac(细菌人工染色体)f 质粒300kb 稳定，但在细菌外难以维 持 macs(哺乳类人工染色 体) 基于 epstein-barr 病 毒的游

30、离载体 300kb 人类人工游离染色体(human artificial episomal chromosome,haechaec)是一类发展 中的 macs,它来自于 epstein-barr 病毒 五. cdna文库 一一. .概况概况: : cdna文库是通过反转录文库是通过反转录mrna，并制备双链并制备双链 cdnacdna(double stranded cdna)来构建的。来构建的。 构建构建cdna文库的策略是取决于：文库的策略是取决于： (1)(1)目的目的mrnamrna的相对丰度；的相对丰度； (2)(2)筛选方法：筛选方法： 除简单的分子杂交法外还可对表达产物用各种方法

31、除简单的分子杂交法外还可对表达产物用各种方法 进行鉴定。进行鉴定。 cdna文库的优点 (1)用用rna病毒可建立文库；病毒可建立文库； (2)因克隆数比基因组文库少得多，易于因克隆数比基因组文库少得多，易于 筛选；筛选； (3)从分化特异的细胞的从分化特异的细胞的cdna文库中可文库中可 分离到特异表达的基因。分离到特异表达的基因。 (4)建库时已排除了其它的建库时已排除了其它的rna，使假阳，使假阳 性率减低。性率减低。 (5) cdna文库可在细菌中表达，可用多文库可在细菌中表达，可用多 种策略进行筛选。种策略进行筛选。 但应注意： (1) (1) 细胞中不同细胞中不同mrnamrna的

32、的丰度不同，丰度不同，低丰度低丰度的的mrnamrna要要 求很高的克隆数求很高的克隆数( (要用公式来计算要用公式来计算) )。 (2)(2)有的基因表达具有严格的有的基因表达具有严格的时空性时空性，要获得其，要获得其 mrnamrna并非易事。并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞用不同发育阶段，或不同组织细胞 中的中的mrnamrna制备的制备的cdnacdna文库会包含一些共同和特异序文库会包含一些共同和特异序 列。这可用于分离差异表达的基因。列。这可用于分离差异表达的基因。 (3)cdna(3)cdna文库的文库的dnadna无内含子、调节元件和基因间无内含子、调节元件和基因间 d

33、nadna。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因 经不同的剪接可产生不同的部分重叠的经不同的剪接可产生不同的部分重叠的cdnacdna克隆。克隆。 2.制备cdna文库 分离代表细胞中主要分离代表细胞中主要mrna(rrnamrna(rrna和和trnatrna因其因其 丰度和大小的一致性，可以通过分级直接丰度和大小的一致性，可以通过分级直接 分离分离) )。mrnamrna的提取可以通过多胸腺嘧啶的的提取可以通过多胸腺嘧啶的 柱子分离。然后被反转录。柱子分离。然后被反转录。cdnacdna第一链的第一链的 合成用合成用oligo(dtoligo(dt

34、) )引物，因为长的引物，因为长的mrnamrna没有没有 被完全反转录被完全反转录, ,因此中部可加另一引物。因此中部可加另一引物。 第二链第二链cdnacdna的合成是用自身引物的，一的合成是用自身引物的，一 个更有效的方法是在个更有效的方法是在cdnacdna第一链加尾第一链加尾( (如如 多聚胞嘧啶多聚胞嘧啶) )，然后用，然后用oligo(goligo(g) )为引物起为引物起 始第二链的合成。这样产生的双链始第二链的合成。这样产生的双链cdnacdna 可以通过加接头或同聚尾巴插入载体。可以通过加接头或同聚尾巴插入载体。 aaaaaaa mrna (a) 随机六碱基 (b)寡聚(d

35、t)引物 第一条 cdna 的合成 an an nnnnnn tn (c)发夹引物 (d)同聚物加尾反应 第二条 cdna 的合成 tttttt gggggg tttttt cccccc 加接头 1 tttttt gggggg tttttt aaaaaa cccccc aaaaaa 切除发夹 通过以下途径将 cdna 插入载体 a. 平端克隆 tttttt b. 加接头 aaaaaa c. 进一步进行同聚物加尾反应 加接头 2 tttttt aaaaaa 经酶切进行定向克隆 cdna 克隆 第三节克隆克隆dna序列的体外突变序列的体外突变 一一. .缺失突变缺失突变 二二. .寡核苷酸定向诱变

36、寡核苷酸定向诱变 克隆克隆dna序列的体外突变序列的体外突变 (1)(1)缺失突变缺失突变 hind hind hind ecor ecor ecor banh banh banhkpn pst pst p s t pst pst bg/ banh bgapa hind缺失 bg/ banh缺失 pst缺失 kpnecor/ 外切酶缺失 kpn apa/ 外切酶 缺失 bg/外切酶 bal31缺失 用限制性酶和外切核酸酶来产生缺失突用限制性酶和外切核酸酶来产生缺失突 变。根据质粒中插入变。根据质粒中插入dna的酶切图谱，的酶切图谱， 可以确定从克隆片段的中部或末端删除可以确定从克隆片段的中部或

37、末端删除 掉一些核苷酸。掉一些核苷酸。bg和和bamh剪切的剪切的 结果产生互补的黏性末端结果产生互补的黏性末端(gatc)。但如。但如 果此果此dna末端仅含有末端仅含有5突出端或是一个突出端或是一个 平端，而没有延伸的平端，而没有延伸的3突出端的话，外突出端的话，外 切酶切酶从从3端消解端消解dna的一条链。的一条链。 这些特点可被通过两种限制酶的剪切，这些特点可被通过两种限制酶的剪切， 产生非定向的缺失。一种剪切产生非定向的缺失。一种剪切55突出端突出端 ( (ecoecor r或或banbanh h)而另一种剪切而另一种剪切33突出突出 端端( (kpnkpn或或 apaapa)。外切

38、酶。外切酶-缺失缺失dnadna 必须用剪切单链的核酸酶必须用剪切单链的核酸酶s1s1来切除未被来切除未被 消解的消解的55端。外切酶端。外切酶balbal3131消解双链消解双链dnadna 产生两端缺失，此不需要用核酸酶产生两端缺失，此不需要用核酸酶s1s1处处 理就可用于平端连接。理就可用于平端连接。 接头分区诱变接头分区诱变 接头分区接头分区 诱变（诱变（linker scanning mutations）能用）能用 于产生一系列小的内部缺失和一簇点突变。产生的于产生一系列小的内部缺失和一簇点突变。产生的 5 和和3 端缺失的集合，每一个都含有端缺失的集合，每一个都含有8个碱基的个碱基

39、的 限制性酶切位点和末端相连，例如，在限制性酶切位点和末端相连，例如，在xhol接头接头 (gctcgagg)中含有一个回文中含有一个回文xhol识别序列识别序列 (ctcgag)。 通过消解选择性缺失带有通过消解选择性缺失带有xhol的片段，然后的片段，然后 连接，这样在靶连接，这样在靶dna(lsl -ls3 和和ls-2-ls-4) 上能产生嵌套上能产生嵌套(nested)点突变。但并不是在点突变。但并不是在 连接区中所有的核苷酸的取代都产生突变，连接区中所有的核苷酸的取代都产生突变， 对于某些位点的碱基对偶然地和野生型靶序对于某些位点的碱基对偶然地和野生型靶序 列相匹配。内部的缺失突变

40、也能通过连接两列相匹配。内部的缺失突变也能通过连接两 个不相邻的序列个不相邻的序列(ls2-ls3)而产生。而产生。 ttcgagttcggttcgagttcggcattgccacattgccatagtag aagctcaagccaagctcaagccgtaacggtgtaacggtatcatc ttcgagttcggttcgagttcgggcgc aagctcaagccaagctcaagcccgcga ag gc ct t ttcttcg gc c aagaagc cgagctgagct tctcg gaggaggtagtag ccccatcatc ttcgagttcggttcgagttcg

41、ggcgct tc cg gaggaggtagtag aagctcaagccaagctcaagcccgcga ag gc ctcctccatcatc ttcttcg gctcgactcgaggggcattgccatagcattgccatag aagaagc cgagctgagctccccgtaacggtatcgtaacggtatc ttcttcgctcgagctcgaggggtagtag aagaagcgagctcgagctccccatcatc 靶dna野生型 末端缺失 接头分区突变 tcgatcgaggggcattgccatagcattgccatag ccccgtaacggtatcgtaac

42、ggtatc 内部缺失 ls1 ls2 ls3 ls4 ls1-ls3 ls2-ls4 ls2-ls3 xhol接头 (gctcgagg) 连接后剪切 在需要产生定点突变的在需要产生定点突变的dna区域先删除区域先删除8 个碱基，使一段个碱基，使一段dna序列变成缺失了序列变成缺失了5 和和3 的端的的端的dna片段，再在断裂端分别片段，再在断裂端分别 接上同一个限制性酶切位点作为接头。接上同一个限制性酶切位点作为接头。 酶解后通过黏性末端连接，在这个片段酶解后通过黏性末端连接，在这个片段 中，接头正好取代原序列中的中，接头正好取代原序列中的8bp碱基碱基, 这样既没有改变周围核苷酸的距离，又

43、这样既没有改变周围核苷酸的距离，又 能产生嵌套能产生嵌套(nested)点突变点突变。 m. smith美美 1984年建立核年建立核 酸的定点突变酸的定点突变 技术技术 19931993年获得了年获得了 诺贝尔化学奖诺贝尔化学奖 寡核苷酸寡核苷酸 定向诱变定向诱变 寡核苷酸引物诱导突变 g c g g 突变体 a atp a kleanow 转化 ligase e.coli 4dntps t a 野生型 2.kunkel 定点诱变法 由由kunkel t.a.1985年建立年建立 (1)将已插入目的将已插入目的dna的的m13 (rf)转化入转化入 e.coli(dut-ung-)进行复制进

44、行复制,子链中掺入了子链中掺入了u； (2)与突变引物退火与突变引物退火:取正链取正链m13与突变引物退火与突变引物退火; (3)制备异源双链：用制备异源双链：用kleanow酶，和酶，和t4连接酶连接酶 在在体外合成体外合成异源双链；异源双链； (4)将异源双链转化入野生型将异源双链转化入野生型e.coli中，尿嘧啶脱中，尿嘧啶脱 糖苷酶糖苷酶(ung)降解含降解含u的模板，仅含突变的模板，仅含突变dna的的 模板可得到扩增。模板可得到扩增。 g g g u g a a m13 将已插入目的dna的m13 (rf)转化e.coli(dut-ung-) 进行复制,子链中掺入了u 取正链m13与

45、 突变引物退火 a 用kleanow酶和 t4连接酶在体外 合成异源双链 将异源双链转化入野生 型e.coli中尿嘧啶脱糖苷 酶(ung)降解含u的模板 仅含突变 dna的模板 可得到扩增 u u u u u u u u g a u u u u uu u u a e.colie.colidutpasedutpase，它能使，它能使dutpdutp变成变成dumpdump，dumpdump是不能是不能 作为作为dnadna合成的底物，这样它就不再能加入合成的底物，这样它就不再能加入dnadna中。中。 尿嘧啶尿嘧啶n-n-糖苷酶（糖苷酶（uracil n-glycosylaseuracil n-

46、glycosylase），它可），它可 以切断混合尿苷的糖苷键，形成无以切断混合尿苷的糖苷键，形成无pupu和和pypy位点位点 （apurinic or apyrimidinicapurinic or apyrimidinic ，apap），再由），再由apap内切内切 酶在酶在apap位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。 3.硫代磷酸诱变法 已知有一些核酸内切酶已知有一些核酸内切酶( (banbanii,ii,hindhindiiii, , pst psti,i,ncincii i等等) )不能切割不能切割硫代磷酸硫代磷酸dnadna分子。分子。 此

47、方法的步骤是：此方法的步骤是： (1)(1)将突变的寡核苷酸引物与将突变的寡核苷酸引物与m13m13重组体退火；重组体退火； (2)(2)在具有在具有硫代磷酸硫代磷酸的条件下，加入的条件下，加入dna poldna pol合成新链。合成新链。 如此产生的异源双链分子中，突变体链是硫代磷酸如此产生的异源双链分子中，突变体链是硫代磷酸 化的化的dna;dna; (3)(3)经连接酶封口后经连接酶封口后, ,用用ncincii i消化异源双链。那么被切消化异源双链。那么被切 割的将是非硫代磷酸化的亲本链。割的将是非硫代磷酸化的亲本链。 硫代脱氧胞苷三磷酸硫代脱氧胞苷三磷酸(dctp s) 一种硫代核

48、苷酸的分子结构一种硫代核苷酸的分子结构 nh2 n o o s o n hopopopoch2 | | | o oh oh oh h h h h h oh 硫代磷酸诱变法 g g g ncii 位点 a atp a a kleanow ncii ligase 外切酶 硫代 核苷酸 g g c kleanow 转化 ligase 筛选突变体 4.pcr诱变法 以上方法的缺点是突变位点仅限于靶dna 的5端，而我们也希望在中心部位进行诱变 欲 达此目的可用pcr法。因pcr产生的单个错配 碱基经扩增会掺入到模板序列中，最终产生突 变体的双链。 后 higuchi,r等又建立了重组pcr，此法 可在

49、dna序列的任何部位产生突变位点。 混合,变性,退火 靶dna片段 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 引物b 引物c 不能扩增 能扩增 dna pol 用引物b和c进行pcr 3 3 3 5 5 5 5.大引物诱变法 重组pcr诱变法需4种引物，三轮扩增， 步骤繁琐。于是后人又提出大引物诱变法。 pcr法的缺点是： (1)扩增的产物常需要连接到载体上，然后 才能对突变的基因进行表达，研究。 (2)dna的保真度低，产物需要测序。 53 pcr 多次循环 大引物 大引物诱变法 pcr

50、 pcr 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 3 实例实例3基因编码序列的丙氨酸扫描诱变基因编码序列的丙氨酸扫描诱变 研究目标研究目标 凋亡（apoptosis）是指在胚胎发生或在成体 组织细胞更新时，在特定的时间内，在各 种组织中细胞的程序性死亡。一位细胞生 物家发现一个小的分泌蛋白能通过和fas蛋 白结合并使其失活，从而阻断凋亡。fas蛋 白存在于某些特定细胞表面的一种膜结合 受体。这位科学家将她新发现的20 kda“抗 -凋亡”蛋白命名为“青春之泉”（fountain of youth ，foy）。 细胞凋亡的特点是细胞凋亡的特点是dna降解产生约为降解产

51、生约为180- 200bp的整倍数的整倍数dna片段，而这正好是缠片段，而这正好是缠 绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体dna 恰好是在核小体与核小体的连接部位被切恰好是在核小体与核小体的连接部位被切 断，这种断，这种dna的有控降解是一种内源性核的有控降解是一种内源性核 酸内切酶在核小体连接部位切断染色体酸内切酶在核小体连接部位切断染色体 dna，在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的，在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的 梯状梯状ladder图谱，而坏死呈弥漫的连续图图谱，而坏死呈弥漫的连续图 谱谱。 细胞凋亡的过程细胞凋亡的过程 大致可分为以下几个阶段：大致可分为以下几个

52、阶段： 接受凋亡信号接受凋亡信号 凋亡调控分子间的相互作用凋亡调控分子间的相互作用 蛋白水解酶的活化蛋白水解酶的活化半胱天冬蛋白酶半胱天冬蛋白酶 （caspase） 进入连续反应过程进入连续反应过程 细胞凋亡的膜受体通路：细胞凋亡的膜受体通路： fas是一种跨膜蛋白，它与是一种跨膜蛋白，它与 fasl结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。 首先配体诱导首先配体诱导受体三聚体化受体三聚体化，然后在细胞膜上形成，然后在细胞膜上形成 凋亡诱导复合物，通过凋亡诱导复合物，通过fas分子启动致死性信号转分子启动致死性信号转 导，最终使细胞死亡。导，最终使细胞死亡

53、。 fas普遍表达，可出现于多种细胞表面，但普遍表达，可出现于多种细胞表面，但 fasl通常只出现于活化的通常只出现于活化的t细胞和细胞和nk细胞，因而细胞，因而 已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够以凋亡途径已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够以凋亡途径 置靶细胞于死地。置靶细胞于死地。 fas分子胞内段带有特殊的死亡分子胞内段带有特殊的死亡 结构域（结构域（dd, death domain）。）。 她用她用“抗抗- foy抗体抗体”从分泌表达的从分泌表达的cdna文库文库 中分离了中分离了foy cdna。通过。通过foy编码序列编码序列缺失作缺失作 图图鉴别出一个鉴别出一个60个氨基酸个氨基

54、酸的小区域，此区域对的小区域，此区域对 测定测定fas蛋白的失活蛋白的失活是绝对需要的。是绝对需要的。 另一位结构生物学家用家用另一位结构生物学家用家用x-衍射结晶学衍射结晶学 解析了解析了foy的蛋白结构。在此基础上她决定用的蛋白结构。在此基础上她决定用 寡核苷酸寡核苷酸-定向诱变在定向诱变在60个氨基酸的个氨基酸的foy功能域功能域 的不同位点上系统地改变残基，以此获得另一的不同位点上系统地改变残基，以此获得另一 个功能性资料。个功能性资料。 可利用的信息和试剂可利用的信息和试剂 （1）将含有）将含有185 氨基酸氨基酸的的 foy 可读框（可读框（open reading frame ，

55、orf） 的的650 bp foy cdna克克 隆到隆到e. coli 表达载体中，用来产生毫克量的功表达载体中，用来产生毫克量的功 能性能性foy蛋白。在组织培养基中加蛋白。在组织培养基中加1 ng/ml 可溶可溶 性重组性重组foy ，来阻止在检测中，来阻止在检测中fas介导的凋亡。介导的凋亡。 在细菌中表达的相同来源的在细菌中表达的相同来源的foy 蛋白用于蛋白用于蛋白蛋白 质结构的测定质结构的测定和基因和基因 foy-fas体外结合的研究体外结合的研究。 （2）人类）人类fas基因定位于基因定位于10q23，其，其cdna长为长为 2534bp，编码，编码325个氨基酸残基组成的个氨

56、基酸残基组成的36kd的跨膜的跨膜 蛋白：蛋白：其其膜外膜外n端区为端区为155个氨基酸，含有信号肽个氨基酸，含有信号肽 和膜受体部分，能与其配体和膜受体部分，能与其配体fasl结合启动凋亡的信结合启动凋亡的信 号传导系统。号传导系统。中部为跨膜区，由中部为跨膜区，由15个氨基酸残基个氨基酸残基 构成。构成。膜内的膜内的c端区含有端区含有145个氨基酸残基，其中个氨基酸残基，其中 的的80个氨基酸称为个氨基酸称为“死亡功能域死亡功能域”(death dormain)， 在传导凋亡信号中起重要作用。在传导凋亡信号中起重要作用。 155aa含信号 肽和受体 15aa 膜内c端区145aa 死亡功能域 80aa fas蛋白的结构 （3）已知）已知foy功能域相应的核苷酸序列有功能域相应的核苷酸序列有10个密码子所个密码子所 编码的氨基酸是带电荷的氨基酸（编码的氨基酸是带电荷的氨基酸（lys、arg、glu和和 asp），可能是丙氨酸（），可能是丙氨酸（ala）取代的一个很好的靶点。）取代的一个很好的靶点。 她设计了她设计了6个寡核苷酸的引物，用个寡核苷酸的引物，用丙氨酸丙氨酸取代所有的取代所有的10 个带电荷的氨基酸个带电荷的氨基酸。 （4）用一个）用一个foy 细菌表达载体细菌表达载体pet