采用星点设计_效应面法优化及制备阿霉素白蛋白纳米粒_百解析

1、第28卷第5期2011年5月沈阳 药科大 学学报 Journa l o f Sheny ang Phar m aceutica lU nive rsit yV o l 28 N o 5M ay 2011p 350收稿日期:2010 12 20作者简介：李磊（1981 ,男（蒙古族,黑龙江大庆人,博士研究生,E ma il lil e i 360si na . com;陈大为（1959 ,男（汉族,辽宁海城人,教授,博士,主要从事药物新剂 型与靶向给药系统的研究,T el . 024 23986308, E m ail chenda w ei syphu . edu .cn。文章编号:1006

2、2858（2011 05 0339 06采用星点设计效应面法优化及制备阿霉素白蛋白纳米粒李磊1,陈大为1,赵秀丽1,胡海洋1,乔明曦1,杨春荣2（1沈阳药科大学药学院,辽宁沈阳110016; 2佳木斯大学药学院,黑龙江佳木斯 154000摘要：目的采用星点设计 效应面法优化阿霉素白蛋白纳米粒的制备工艺。方 法采用去溶剂化 固化交联法制备阿霉素白蛋白纳米粒。以白蛋白质量浓度（X 1: 1,g L -1、阿霉素的质量浓度（X 2: 2, gL -1、p H值（X 3及白蛋白理论交联度（X 4, %为考察对象,以纳米粒平均粒径 （Y 1:d , n m、zeta 电位（Y 2:V , mV、载药量（

3、Y 3:w 1, % 和包圭寸率（Y 4:w 2, % 为评 价指标，以四因素五水平的星点设计 效应面法筛选出最佳制备工艺；并采用透射电 镜观察制得纳米粒的形态。结果优化后的处方工艺为：白蛋白质量浓度为17g L-1、阿霉素质量浓度为2g L -1、p H值为9、白蛋白理论交联度为125%。以此条件制 得的纳米粒平均粒径为（151 0 43 n m, zeta电位为-（18 8 0 21 mV,载药量为（21 4 0 70 %,包封率为（76 9 0 21%,均与预测值偏差较小。结论阿霉素白蛋白纳米粒的制备 采用星点设计-效应面法设计并优化是可行的。关键词：阿霉素；白蛋白纳米粒；制备 工艺;效

4、应面法；去溶剂化法中图分类号:R 94文献标志码:A阿霉素（doxor ubic i n , DOX是一种抗肿瘤抗生素，对急性白血病、淋巴瘤、孚L 腺癌、肺癌及多种其他实体肿瘤均有杀灭作用。但其严重的心脏毒性及脊髓抑制等 不良反应，极大地限制了阿霉素广泛应用于临床的抗肿瘤治疗1。目前,减小阿霉素毒性的主要方法是应用药物载体，改变其生物分布，减少它在全身特别是心 脏组织中的分布，提高其在局部肿瘤部位中的含量。白蛋白材料具有安全无毒、无 免疫原性、可生物降解、生物相容性好等特点。而且，与其他胶体载体系统如脂质体相比，白蛋白纳米粒具有更好的存储稳定性和更高的亲水性药物的负载能力，并且释药性能的可控性

5、更好，是一种理想的药物载体2。星点设计（central co mposite desi g n , CCD是国外近年来常用的实验优化方法。在试验设计上，国内大多采用正交设计和均匀设计，这两种方法虽实验次数较少，但二者多用线性数学模型，精度不如星点设计，预测性较差。星点设计方法简便，且在模型建立上采用非线性数学模型拟合，复合相关系数较高,预测值更接近真实值3-4作者采用白蛋白作为载体材料，应用去溶剂化固化交联法制备阿霉素白蛋白纳米粒。利用星点设计效应面法优化制备 工艺,采用粒径、zeta电位、载药量及包封率作为评价指标，着重研究制备过程中不 同工艺条件对制备制剂的影响。从而筛选出制备阿霉素白蛋白

6、纳米粒的最佳优化工-f-p乙。1仪器与材料FA1104电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司，DF 101S集热式恒温加热 磁力搅拌器（巩义英峪予华仪器厂,H L 2恒流泵（上海沪西分析仪器厂，LS320激光 粒度仪（美国Beckm an公司,TGL 16c台式高速离心机（上海菲代尔分析仪器公司, UV 9100紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器厂,J E M 1200EX透射电子显微镜（日 本电子公司,DLESA 440SX型zeta电位测试仪（美国BECKMAN COULTER 公 司。盐酸阿霉素（北京华奉联博科技有限公司,牛血清白蛋白（美国Am resco公司, 无水乙醇（天津大茂化学试剂

7、厂,质量分数50%戊二醛（天津博迪化工有限公司,胰蛋白酶 （美国Amresco公司,其他试剂（分析纯,市售。2方法与结果21阿霉素白蛋白纳米粒的制备将阿霉素1m g与牛血清白蛋白100m g溶解到1mL的蒸馏水中,为了使药物有 效吸附到牛血清白蛋白上,在室温下搅拌2h ;调节p H值至710之间；4mL乙醇以0 5mL m i n -1的速度滴至已经孵化好的药物与白蛋白混合溶液中，继续搅拌,该过程为去溶剂 化过程,纳米粒形成；向纳米粒溶液中滴加质量分数为 8%的戊二醛水溶液20 L ,室 温磁力搅拌1224h ,使纳米粒交联固化，制得固化纳米粒的溶液。将纳米粒溶液以1 5 104r m in

8、-1的转速高速离心，倾去上清液，加水至原体积，超声。洗涤3次后,真空干燥得固 体粉末。22含量测定方法学的建立221检测波长的选择及确定分别将阿霉素水溶液和白蛋白水溶液稀释至一定浓度后用紫外可见分光光光度 计在200500nm内扫描,结果见图1、2。由图1、2可见,空白白蛋白消化液在 289nm附近有干扰，而在480nm处没有干扰，因此选择最大吸收波长480nm ycsqcujic lonmsj ejcc(uuic200300400500A /nmIddi-301pip即!uR Hon?c，VII H即尽CP凹为检测波长200300400500X /nmycsqcwic pniuj Ejcco

9、oureTdd-30i)pifb:VAMrfLcuicruqyipjppiuSvnCP购tionFig . 2 UV sea nogra m of al bum in water soluti on s222标准曲线的制备精密称取真空干燥至质量恒定的阿霉素适量，用蒸馏水溶解定容至50mL制成200m g L-1的储备液。精密量取 0 00、0 50、0 80、1 10、1 40、1 70、2 00mL储备液置于10mL量瓶中,用蒸馏水定容配成标准系列溶液。以蒸馏水为空白 ,在480nm处 分别测定标准系列溶液的吸光度（A ,以质量浓度（对吸光度（A进行线性回归，结果 见图32003004005

10、00A /nmycsqciuic oduj町 Ejcc(wurcJddt-Soilpab:v/jvcucrucxyipjnpiu h。孙VII u8FRcpnraoFig . 3 UV sta ndard curve of doxorub ici n标准曲线回归方程为：A =2 04 10-2+2 89 10-2,r =0 9989,阿霉素质量浓度在1040m g L -1内线性关系良好。2 3阿霉素白蛋白纳米粒粒径及zeta电位的测定利用动态光散射粒度测定仪测定纳米粒的粒径大小；利用DLESA 440SX型zeta电位分析仪测定载药纳米粒的zeta电位。24盐酸阿霉素白蛋白纳米粒载药量及包封

11、率的测定精密称取按21条方法制得的阿霉素白蛋白纳米粒10m g ,加入含100mg L -1胰蛋白酶的生理盐水溶液25mL ,避光,37恒温磁力搅拌至溶液澄清。然后将溶液全部转移至100mL量瓶中，用蒸馏水定容，过滤,取续滤液于480n m处测定吸 光度，代入标准曲线计算药物含量。按下列公式分别计算纳米粒的载药量和包圭寸率。w 1（载药量=（纳米粒中阿霉素的含量 /纳米粒的总质量100%; w 2（包封率=（纳米粒中阿霉素的含量/阿霉素的总质量100%。2 5试验设计在预试验的基础上，选择对阿霉素白蛋白纳米粒的制备影响较显著的4个因素作为考察对象。即白蛋白质量浓度（X 1: 1、阿霉素质量浓度

12、（X 2: 2、pH值（X 3、白蛋白理论交联度（X 4,并确定其用量范围为：1为10 0030 00g L -1、2 为 1 005 00g L -1、X 3为7 59 5、X 4为50%150%理论上,使1 g白蛋白完全交联所需要的戊二醛用量为 87 5 g ,即:使A g白蛋白产生理论交联度为B %所需的戊二醛用量为（87 5 A B 100 g ;作者通过使用不同用量的戊二醛来控制白蛋白的理论交联度。采用四因素五水平的星点设计,以纳米粒平均粒径(Y 1:d、zeta电位(Y2:V、载药量(Y 3:w 1和包封率(Y 4:w 2为指标进行实验考察。因素及水平见表1,实验安排及结果见表2。

13、Tab le 1 Factors and th eir levels in cen tra l co m posite desi gnIn depe ndent v ariab l esSymbo l Coded l eve l-1 732-10+1+1 732 1(a lbu m i n /(g L -1 X 11015202530 2(doxorubic i n /(g L -1 X 212345p HX 37 588 599 5D eg ree o f cro ssli nk i ng of a l bu m i n /%X 45075100125150Tab le 2 E xper i

14、 m en ta l de sig n and results of the cen tral co m posite desi gnA ssay V ariab l esX 1X 2X 3X 4R espo nsesY 1Y 2Y 3Y 41152875645-2 34023 342252875257-10 2315 1363 463154875268- 11 292 2382 624254875261-10 842 8079 495152975128-24 1129 2558 086252975263- 23 834 5157 677154975356-25 836 9973 288254

15、975267-28 386 2980 419152812529314 486 0363 55102528125350-17 465 0079 59111548125296-18 37080 48122548125410-17 3819 2777 51131529125177-27 3815 9173 52142529125191-29 387 4179 14151549125362-25 384 2283 60162549125380-23 455 7683 12171038 5100467-24 5612 3173 91183038 5100411-10 387 0682 51192018

16、5100152-10 8428 2757 80202058 5100197-10 391 7878 27212037 5100585-2 38071 22222039 5100240-10 9423 9572 24232038 550174-39 6822 9077 19242038 5150272-10 3921 3978 26252038 510035010 4916 1074 91262038 5100394-9 3815 9773 93272038 5100380-11 3418 1075 09282038 5100342-8 6222 9080 91292038 5100347-1

17、7223 9181 09302038 5100376-1 7223 1081 292 5 1二次回归模型的建立禾U用 Desi g n ExpertVersi on 7 0实验软件对表2实验数据进行回归分析，得二次多元回归模型为Y 仁364 83-10 75 X 1+16 08 X 2-56 08 X 3+8 75 X 4+13 63 X 1 X 2+18 88 X 1 X3+34 50 X 1 X 4+57 25 X 2 X 3+36 1 X 2 X 4+11 13 X 3 X 4+17 58 X 21- 48 54 X 22+10 96 X 23-36 42 X 24(P0 05, R 2

18、=0 8908; (1Y 2=-7 21+0 69 X 1-0 45 X 2-5 1 X 3+0 92 X 4+0 84 X 1 X 2+0 44 X 1 X 3+0 48X 1 X 4+0 94 X 2 X 3+1 25 X 2 X 4+1 85 X 3 X 4-3 3 X 21- 1 59 X 22- 0 6 X 23- 5 2 X 24(P0 01, R 2=0 7105;(2Y 3=20 01-0 37 X 1-3 69 X 2+3 24 X 3-0 28 X 4+2 49 X 1 X 2-4 15 X 1 X 3+1 31 X 1 X 4-2 X 2 X 3+1 59 X 2 X 4

19、-1 49 X 3 X 4-3 67 X 21-2 34 X 22- 3 1X 23-0 56 X 24(P0 01, R 2=0 7000;(3Y 4=77 87+3 3 X 1+7 63 X 2+1 7 X 3+4 35 X 4-3 80 X 1 X 2-2 39 X 1 X 3-1 59 X1 X 4-2 38 X 2 X 3-5 27 X 2 X 4-0 14 X 3 X 4-0 37 X 21- 2 92 X 22- 1 99 X 23- 0 49 X 24(P0 05, R 2=0 7927。(42 5 2方差分析和显著性检验四个拟合方程的相关系数说明设计模型拟合程度良好，可以用此

20、模型对盐酸阿霉素白蛋白纳米粒的处方进行分析和预测。从表3回归系数的显著性检验可知，模型(1 中 X 2(P0 05、X 3(P0 05、X 1X 3(P0 05、X 21(P0 05、X 23(P0 05项差异显著,其他项不显著；模型(2中X 2(P 0 001、X 4(P 0 05、X 2X 4(P 0 05差异显著,其他项不显著；模型(3中X 3(P0 01、X 2X 3(P0 01、X 22(P0 01差异显著,其他项不显著；模型(4中X 3(P0 01、X 21(P0 05、X 24(P0 01差异显著,其他项不显著。Tab le 3 ANOVA for th e m ode Is p

21、redicted for each resp on seSource Y 1SS DF P va I ue Y 2SS DF P va I ue Y 3SS DF P value Y 4SS DF P va I ue M ode I 1750140 053384140 013 1070 105140 01122 414005X 13 3410 80260 910 052 7735 10310 5011 510 67X 232810 051396 910 0016 208210310 324 910 78X 325210 0569 410 307 5488 10410 01624 910 01X

22、 41 8310 85453 210 051 8375 10310 5920 410 57X 1X 299 110 18231 210 072 9703 10310 4911 210167X 1X32751010591121012351700310310134311410182X 1X427161014740171014211904410510109316610181X 2X363181012890191012351244110410101141110164X 2X 4401610138444151010521088010410108241910153X 3X43516101410132101

23、9411980010310157541610136X213691610105318110180814800103101252991510105X29221491710110233131010761462910410101691410130X 232631310105108191011931294010310147919310169X 24814710167616910174316375104101057401410101R esi dua l 75014158841915819853104159191315LOF 6821110010582115100105817588104100101825

24、100105Pure E rror6813756313252126481035941795Cor T ota l25011229426819294100601052926321521513效应面优化与预测采用 Desi g n2Expert mVersi on 710实验设计软件绘制各指标与影响较显著的自变量的三维曲面图（图4,设计各指标权重,得到优化后处方为Q 1=17g #L -1、Q 2=2g #L -1、X 3=9、X 4=125%。按此处方制备了 3批纳米粒,其粒径、zeta、包封率、载药量见表4。从表4可知,实验观察值和模型预测值都比较接近，模型的预测性良好。.0IMtrSVIut

25、enivu *pHlA Pa rtic l e s i ze(n m o f the DOX2A2NP s show ing i n terac tion bet wee n a m ount o f doxorubic i n and p H; B Ze ta 2potenti a l(mV o f the DOX2A2NP s s how i ng i n teracti on bet w een a m ount of doxo rub i c i n and p H; C Am ount of drug l oadi n g(% of the DOX2A2N Ps show ing i

26、 n terac tio n bet wee n albu m i n concen trati on and a m ount o f doxorubic i n ; D Encapsu lati on effi c i ency (% of the DOX2A2N Ps show i ng i n teracti on bet w een a l bum i n concen trati on and a m ount o f doxorubic i nF i g . 4 Re s pon se surface p l ots for par ticle size , zeta2poten

27、tia, l a moun t of d rug load i ng and en capsu l at i on eff i c iency sho w ing i n teracti ons a mon g represe n tat i ve d ifferen t factors Table 4 Op ti m ization formu lati on of the DOX2A2NPs and th e p red icted and observed resp on ses Eva l uati oni n dex P red i c ted resp onse O bserv e

28、d resp on ses Predicted e rror d /nm 136151? 01431110V /mV-20-1818? 01216100w 1/%21142018? 01702108w 2/%76197514? 01211195216阿霉素白蛋白纳米粒的稳定性考察将采用优化工艺制得的纳米粒，经微孔滤膜过滤后充氮分装在安瓶中保存在4e下，并定期取样测定粒径和包封率，结果见表5。Tab l e 5 Stability of DOX2A2NPs at 4e (n =3 t /mon thd /nm w (EE /%0154? 013879135? 01371159? 41337618

29、9? 01483167? 318974137? 0178结果表明，4e时,随时间延长粒径有所增加，包封率变化不大，认为纳米粒在4e 下放置较稳定。217形态学观察利用JE M 21200EX透射电子显微镜观察载药纳米粒的形态。操作方法为：分别取适量空白白蛋白纳米粒与阿霉素白蛋白纳米粒溶液滴在喷碳铜网表面，使液体尽量铺满整个铜网,以质量分数210%磷钨酸负染3m i n后,于透射电镜下观察形态。 从图5可以看出，阿霉素白蛋白纳米粒溶液大小均一，结构完整，为球形或类球形。 载药纳米粒比空白纳米粒粒径略有增加。3讨论al阿霉素白蛋白纳米粒单因素(白蛋白溶液初始质量浓度、p H值、搅拌速度、乙醇滴入用

30、量及速度、盐酸阿霉素含量、白蛋白理论交联度 考察过程中发现，影响纳米粒性质的因素主要是白蛋344 沈 阳药 科大学学报第 28 卷 F ig. 5 T ransm ission electron m icrograph s of e ty album in nano par tic les( A and op ti al doxorub icin albu in nanop2 mp m m artic les( B白溶液初始质量浓度、阿霉素含量、H值、p白蛋白理论交联度,忽略以上任一因素都无法制备出正常的纳米粒。因此以这4个因素为考察对象，以平均粒 径、zeta电位、载药量及包封率为考察指标

31、进行了四因素五水平的实验设计。b1阿霉素白蛋白纳米粒处 方的优选如果采 用均匀设计法设计本次试验，仅仅能研究单 因素对纳米粒制备的影响。而星点设计作为一种因素水平优化法既较好地保证实验精度，同时可以研 究多种因素交互影响。结果表明，采用星点设 计优选的处方的 理论值和预测值相近，说明所建 立的数学模型的预测性较好6 5验基础。参考 文献：1杨占华，隋道敬,陈思娟，等补气养阴活血 法对阿霉 素减增效作用临床 研究J.中国药学刊，2006 24 , ( 2: 275- 277. 2苏华,胡晋红,李凤前.白蛋白 纳米粒的制 备工艺及 其靶向性研究进展J.中国药学杂志,2005, 40( 9: 641

32、- 644.3郑威威,胡延臣,王曦培,等.洛伐他汀-PLGA纳米粒的制备及其性质J.沈 阳药科大学学 报,2010, 27 ( 4: 259- 264. 4邢传峰，胡海洋，杨春荣，等Box2Behnken效应面法优化长春西汀长循环脂质体处方J.沈阳药科大学 学报，2009, 26( 10: 761- 767. 5 STE I NHAU SER I SPANKUCH B, STREBHARDT K, et , a.l T rastuzum ab2m odified nanopa rtic les: opti ization o f m prepara tion and uptake in can

33、cer cells J. B iom ater i 2 a ls, 2006, 27: 4975-4983. 6何军，奉建芳，庞家忠，等. 星点设计-效应面法优化水飞蓟素固体脂质纳米粒的制备J.中国医药工业杂 志,2005, 36( 1: 18- 21.0 4结论作者采用星点设计2应面法设计并优化了 效阿霉 素白蛋白纳米粒的制备工艺，发现pH值、阿霉素含量、盐酸阿霉 素含量的平方 及p值与盐H酸阿霉素含量交互作用显著影响阿霉素白蛋白纳米粒的制备及其相关性质。实验结果与预测值相差较小，提示采用星点设计2应面法制备阿霉素 效白蛋白纳米粒是可行的。这为作者下一步制备具有主动靶向功能的阿霉素白蛋白纳米

34、粒奠定了实(下转至第354页354 沈 阳药 科大学学报第 28 卷 C SPC Zhongnuo Pharm a ceutica l, Shijiazhuang 050000, China Abstract Objective T o iso late and identify the chem ical con stitue nts from m arine bacteriu P an toea agg lo 2 : m m erans. M ethod s T he com po unds from the ethy l aceta te ex tractsw ere iso lated

35、 by silica ge l co lu n Sepha2 m , dex LH 2 co lum n chrom ato graphy and HPL C tech n iques And these com pounds w ere ident if ied by the 20 . phy sico2chem ica l properties and spectral analy sis. R esu lts T en com pounds w ere iso lated from the ethy l ace2 tate ex tracts of m arine bacteria P

36、an to ea agg lom erans. T hey w ere id en tif ied a s cyc lo ( Phe2 ro ( 1 , cyc lo P ( V a l2 ro ( 2, cyc lo ( A la2 eu ( 3 , cy clo ( T rp2Pro ( 4 , cyc lo ( T rp2 ly ( 5 , cy clo (42hydroxy l2 ro2 P L G P Phe ( 6 , cyc lo ( Pro2 y r ( 7, cy clo ( L eu2 eu ( 8 , cyclo ( P ro2 eu ( 9, cy clo ( V a

37、l2Ile ( 10. Cone lu2 T L L sion sA ll o f th e com pounds are iso la ted from the m arin e bacterium P antoea a gg lom erans fo r th e f irst ti e m . K ey w ords: m arin e bacteriu m; P antoea agglom erans; cyc lo 2dip eptide; che ical constituen; structure m t id entifica tio n (上接第 344页 Opti m iz

38、ation on the preparation of doxorubici n2 loaded album in nan oparticles using cen tral composite desig n2resp onse surface m ethodology L I L ei , CHEN D a2w ei , ZHAO X iu2li , HU H ai2ya ng , Q IAO M in g2x i , YANG Chu n2rong m a cy, Jiam usi U niversity, Jiam usi 154000 C hina , Abstract Ob jec

39、tive T o opt i ize the preparation o f dox orub icin 2lo aded a lbu in nan opartic les using re2 : m m sponse surface m eth odo lo gy ( RS . M ethods A lbum in nan oparticles w ere prepared th rough a deso lvat io n M m ethod and opt i ized in the a id o f centra l com posite desig n. A lb u in conc

40、entra tio n(X 1: Q, g L m m # 1 of doxo rubic in (X 2: Q, g L # 2 -1-1 1 1 1 1 1 2 ( 11Schoo l o f P ha r acy, She nya ng Pharm a ceutica l U niversity, She nya ng 110016 C hina; 21Schoo l o f P ha r2 m , , am oun t , pH va lues(X 3 , and theore tica l deg ree o f cro ssli nk in g o f album in(X 4, % w ere selected as in depe ndent v aria bles a