液相色谱法检测苯甲酸山梨酸糖精钠的疑难详细讲解-不能不看的精华-

1、液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解- 不能不看的精华 _.txt16 生活，就是面对现实微笑，就是越过障碍注视未来；生活，就是用心灵之剪，在人生之路上裁出叶绿的枝 头；生活，就是面对困惑或黑暗时， 灵魂深处燃起豆大却明亮且微笑的灯展。 17 过去与未来， 都离自己很遥远，关键是抓住现在，抓住当前。液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的 疑难详解不能不看的精华液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标，苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/T5009.29-2003 ，糖精钠的检测参照 GB/T 5009.28-2003 ，即可开展实验。

2、苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目，但是要得到一个准确可靠的结果，也存在 一定的难度，许多新手常出现因对方法理解发生偏差而检测出错的事故。笔者根据自己多年 该方面工作的实际经验出发， 以苯甲酸、 山梨酸为着重点， 从样品前处理、 检测仪器的选择、 超标时的判断等几个易出问题的方面，进行了详细的阐述。2 样品前处理的注意事项GB/T5009.28-2003 和 GB/T5009.29-2003 在文字结构上有缺陷， 在涉及用仪器法测定苯甲酸、 山梨酸、糖精钠时，只讲述了液体样品的前处理方法，没有涉及对固体样品的前处理。食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质，对提取极为不利；如处理不干净也会污

3、染色谱柱， 影响检测工作。这类样品处理的关键在于如何找到一种较理想的沉淀剂，尽量排除待测样品 中的油脂、蛋白质，且不影响待测物组分的回收率。GB/T5009.29-2003 使用 5硫酸铜溶液沉淀蛋白，对于蛋白质含量较低的食品尚可，对于豆 粉、奶粉、 月饼等高油脂、 高蛋白样品则沉淀效果不理想。 如用 10钨酸钠溶液作为沉淀剂， 效果好些； 如用 10亚铁氰化钾溶液和 20醋酸锌溶液则效果更理想 （这是笔者目前用过最 理想的沉淀剂） 。具体操作步骤如下：取一定量样品， 捣碎，利用四分法原理称取样品 5.0 克于 50ml比色管中， 加水 20ml，浸泡、 振荡均匀，加入氢氧化钠溶液 (1mol

4、/L)1.0 ml ，加入 9.5mL10%亚铁氰化钾溶液， 9.50mL 20% 乙酸锌溶液， 定容，振荡使其充分混匀后 , 用滤纸初滤除去沉淀物 , 初滤液过 0.45 m微孔滤 膜, 收集滤液于样品瓶中，样品处理液和标准有溶液各进样5uL 测定。用这种方法简单易行，接触有机试剂少，重复性和回收率都令人满意；缺点是一定要用液相 色谱法检测，有一定局限。3 检测仪器的选择虽然液相色谱仪操作起来比气相色谱仪要复杂，但笔者建议如条件许可仍尽量用液相色谱法 检测。原因如下：3.1 液相色谱法所用的样品处理方法远比气相色谱法简单，且不需使用有机试剂。尤其对于 高油脂样品(如月饼)若采用碱化排油酸化提

5、取挥干溶解等步骤，再上气相色谱 仪检测，工作量大，试剂毒性也大，且结果由于处理步骤太多而难以保证准确。3.2 用液相色谱法还可同时完成糖精钠项目的检测，而气相色谱法只能做苯甲酸、山梨酸的 检测。3.3 液相色谱仪所用的紫外检测器比气相色谱仪的氢火焰检测器灵敏，可进行更低含量的检 测。如用二极管阵列检测器，还可辅助定性，这更是气相色谱氢火焰检测器不可比拟的。4 选用气相色谱仪时的注意事项GB/T5009.29 所用的气相色谱柱为 5 DEGS 1磷酸固定液的 6080目 Chromosorb WA W，。这种柱有性能稳定、重复性好、保留时间稳定的优点，但同时也有稳定时间较长的缺点。该柱的适用的样

6、品提取溶剂为石油醚或乙醚，如果用甲醇或乙醇，则溶剂峰拖尾效应较大， 对山梨酸的测定有影响。如用毛细管柱，能取得更好的峰形和灵敏度，但其稳定性及特异性不如填充柱。一般可用非极性毛细管柱， 0.530mm径， 10 15m长度。色谱条件可能需用程序升温。在气相色谱仪上的出峰次序为先出山梨酸，后出苯甲酸。糖精钠不能直接用气相色谱进行检测，必须衍生化后才能汽化进样。5 选用液相色谱仪的注意事项按照 GB/T5009.29 ，流动相应为 5：95的甲醇： 0.02M 醋酸铵溶液， 但是这个比例仅是个参考 值，我们在工作中应根据实际情况进行调节。为什么用甲醇溶液？甲醇有两个作用， （ 1）防腐，液相色谱柱

7、最怕流动相长菌，尤其霉菌。 甲醇可使蛋白质变性，有杀菌作用。 （ 2）调节流动相极性，这是最重要的一点。甲醇在溶液 中比例的较小变化都会使苯甲酸、山梨酸、糖精钠的保留时间发生明显的改变，因此可以通 过改变流动相中甲醇含量，以调节这几个组分的出峰和分离，以得到较理想的色谱图。5： 95 是一个通用的比例，如减少甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间变慢，扩 散效应增大，峰形较差，但这三组分的分离情况较好。如增加甲醇含量，苯甲酸、山梨酸、 糖精钠的出峰时间提前，扩散效应较小，峰形尖锐，但这三组分的分离情况可能受影响，产 生重叠。在选择条件时，只能通过实验手段，如配制3：97， 4： 96，5：

8、95，6： 96，7：93的流动相，综合考虑分离效果和分离时间选择最佳比例。不同柱的最适比例不同，举例来说，色谱科公司的液相柱最适比例为4： 96，而岛津公司液相柱的最佳比例为 7： 93。就是同一根柱，一年前和一年后的极性也会有变化，需调节溶液 配比。为什么使用 0.02M 醋酸铵溶液？加入醋酸铵是为了调节离子强度，使待测物的峰形不致于变坏。如果单独检测苯甲酸和糖精钠，加不加醋酸铵没有什么关系，都可以得到较好的峰形； 但是检测山梨酸时流动相一定要加醋酸铵，否则得不到一个完整的色谱峰，峰形呈破裂状。醋酸铵溶液浓度不需严格控制， 0.01M、0.02M、0.04M 均可。苯甲酸、山梨酸、糖精钠在

9、液相上的出峰次序很有特点。在流动相5：95 及以下比例时，次序是苯甲酸、山梨酸、糖精钠（注意一下气相的出峰次序） ，逐步增大甲醇含量，苯甲酸、山 梨酸的出峰时间逐步提前，而糖精钠是出峰时间迅速提前，随着甲醇比例的逐步增大（15 30），原先在最后出峰的糖精钠集次和前面的山梨酸、山梨酸重叠， 并位于最前面， 其次序变为糖精钠、苯甲酸、山梨酸。再提高甲醇浓度，次序不变。用高甲醇比例条件 （甲醇 15以上） 做出的三种标准物质色谱图峰形较好， 出峰时间也较快， 但做实际样品时干扰较大；因此建议尽量使用低甲醇比例条件（甲醇5左右）。6 苯甲酸、山梨酸超标时的判断苯甲酸、山梨酸超标的样品较多，由于它们往

10、往牵涉到一批货物是否合格，因此责任重大。由于该方法定量较准确，因此遇到超标样品时应将精力集中于定性方面。如同时有气相色谱仪和液相色谱仪，建议用这两种性质相差较大的仪器进行对照，如定量结 果差不多，即可确认。如只有气相色谱仪，应利用其在填充柱保留时间稳定的特性，同时进五针标准液和五针样品液（注： 峰面积应差不多， 否则需对一方按比例稀释） ，如标准和样品液的保留时间相差时间 超过 1 秒，可认为不是。 （如进针的技术不过关，请不要做此实验）如用液相色谱仪，当检测器为二极管阵列检测器时，根据保留时间和紫外吸收图结合定性， 当只有紫外检测器时，改检测波长为220nm， 230nm， 250nm，重复

11、进标准和样品液，由标准和样品在不同波长的峰高比值看是否吻合。如有微生物检测手段，可加样品于有菌培养基中，观察有无抑菌现象，如无抑菌现象则无防 腐剂。不是很推荐用双柱法，因为有时柱极性相差不大，反而会影响最终判断。7 糖精钠超标时的判断当检测糖精钠超标时，除了采用二极管阵列检测器或波长验证，还可以利用糖精钠的荧光特 性， 用荧光检测器进行验证。 荧光条件是激发波长为 277nm，荧光波长为 410nm。只有当用荧 光检测器和用紫外检测器做出的定量结果相差不多，才可以判断为是。还有一个简单粗糙、却也行之有效的验证方法，即感官法。糖精钠是一种甜味剂，用舌头可以感觉到它的甜味，如果含量超标，一定能尝出

12、来。如用8 标准溶液的配制贮存问题苯甲酸、山梨酸、糖精钠的标准溶液如用水、乙醇作基体，一般几个月后会严重降解，甲醇溶解再放于冰箱冷冻层，可保持稳定一两年。因此推荐用甲醇作溶剂。在配制标准溶液时，初学者常犯的错误多为用甲醇溶解苯甲酸钠，用水溶解苯甲酸，晃了半 天才发现怎么也不没溶解。应该用弱碱性水溶解苯甲酸钠、山梨酸钾，用甲醇溶解苯甲酸、 山梨酸。9 苯甲酸、山梨酸的应用围首先应注意到，并不是所有食品都需要加入防腐剂，只有那些富含营养物质，且需要长时间暴露于空气的才有这样的需要，否则对厂家来说会增加不必要的成本。酱油、酱料、咸菜、浓缩果汁等由于后不可能短期吃完，月饼等需在货架上摆放，如不加防 腐剂很快会发霉变质，有添加防腐剂的必要。而利乐装或易拉罐装的饮料由于很快可以食用 完毕，即在细菌大量繁殖前己被消化了，因而没有添加的必要。苯甲酸、 山梨酸如果要起到防腐的作用， 含量就不能太低。 如果我们检测样品时只有几个 ppm 的浓度，有可能是从原料中带来的或由其它添加剂转化来的，而不是厂家出于防腐目的加入 的。苯甲酸、 山梨酸也只是防腐剂中的两种。 并不是所有需要加入防腐剂的食品都会添加苯甲