制剂的基本生产技术病毒增殖技术课件

1、制剂的基本生产技术病毒增殖技术1 第九讲第九讲 病毒增殖技术 制剂的基本生产技术病毒增殖技术2 一一、病毒的复制、增殖与营养病毒的复制、增殖与营养 制剂的基本生产技术病毒增殖技术3 n吸附：非特异性静电特异性受体吸附：非特异性静电特异性受体 影响因素：温度、阴、阳离子影响因素：温度、阴、阳离子 n侵入：病毒直接进入胞浆；侵入：病毒直接进入胞浆； 细胞吞饮病毒；细胞吞饮病毒； 病毒囊膜与细胞融合病毒囊膜与细胞融合 制剂的基本生产技术病毒增殖技术4 n脱壳脱壳 包括脱膜和脱衣壳、囊膜脂质与细胞膜融合，包括脱膜和脱衣壳、囊膜脂质与细胞膜融合， 裸露的病毒体进入细胞浆内及衣壳被溶酶体消化裸露的病毒体进

2、入细胞浆内及衣壳被溶酶体消化 裂解并释放出核心中的核酸裂解并释放出核心中的核酸 无囊膜病毒仅有脱壳过程无囊膜病毒仅有脱壳过程 疱疹病毒则可能在细胞表面脱去囊膜，而痘病毒疱疹病毒则可能在细胞表面脱去囊膜，而痘病毒 在吞饮泡内脱去囊膜在吞饮泡内脱去囊膜 主要在胞浆和胞核内完成主要在胞浆和胞核内完成 制剂的基本生产技术病毒增殖技术5 n生物合成：细胞浆或细胞核中完成生物合成：细胞浆或细胞核中完成 早期：合成酶类、核苷酸原料早期：合成酶类、核苷酸原料 晚期：合成病毒结构蛋白晚期：合成病毒结构蛋白 n装配：细胞浆或细胞核中完成装配：细胞浆或细胞核中完成 核酸、蛋白质盘曲浓缩多肽包壳核酸、蛋白质盘曲浓缩多

3、肽包壳 细胞膜的脂质、细胞膜的脂质、 糖类和病毒蛋白病毒颗粒糖类和病毒蛋白病毒颗粒 n释放：细胞通道溢出；释放：细胞通道溢出； 细胞死亡自溶释出；细胞死亡自溶释出； 细胞膜出芽；细胞膜出芽； 细胞膨胀破裂放出细胞膨胀破裂放出 制剂的基本生产技术病毒增殖技术6 掌握不同病毒的增殖规律，获得高滴度病掌握不同病毒的增殖规律，获得高滴度病 毒，对研制高质量生物制品十分重要。毒，对研制高质量生物制品十分重要。 制剂的基本生产技术病毒增殖技术7 二、动物增殖病毒技术二、动物增殖病毒技术 n动物的选择：动物的选择： 1 1 大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应 病

4、毒疫苗、青壮年和健康病毒疫苗、青壮年和健康 2 2 对相应病毒易感，并十分敏感对相应病毒易感，并十分敏感 3 3 经隔离饲养和观察检查证明健康经隔离饲养和观察检查证明健康 4 4 家兔、大、小鼠等应符合普通级或清洁级实验家兔、大、小鼠等应符合普通级或清洁级实验 动物标准；鸡应属非免疫鸡或动物标准；鸡应属非免疫鸡或SPFSPF级标准；犬、猫级标准；犬、猫 应品种明确，并符合普通级实验动物标准应品种明确，并符合普通级实验动物标准 5 5 体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大 制剂的基本生产技术病毒增殖技术8 n接种方法接种方法 1 1 皮内接种：注入表皮与真

5、皮之间，小鼠、大鼠、皮内接种：注入表皮与真皮之间，小鼠、大鼠、 地鼠可在背部、尾根部或趾部，豚鼠、兔在耳部，地鼠可在背部、尾根部或趾部，豚鼠、兔在耳部， 猴的结核菌素皮下接种在眼睑部猴的结核菌素皮下接种在眼睑部 2 2 皮下接种：犬、猫多在大腿外侧，豚鼠在大腿皮下接种：犬、猫多在大腿外侧，豚鼠在大腿 内侧，兔在背部或耳根部内侧，兔在背部或耳根部 3 3 肌肉接种：肌肉发达、血管丰富的部位肌肉接种：肌肉发达、血管丰富的部位 制剂的基本生产技术病毒增殖技术9 4 4 静脉接种：大小鼠的尾静脉；兔耳缘静脉；犬、静脉接种：大小鼠的尾静脉；兔耳缘静脉；犬、 豚鼠前肢皮下静脉或后肢小隐静脉；灵长类豚鼠前肢

6、皮下静脉或后肢小隐静脉；灵长类 可用股静脉、隐静脉、前肢皮下头静脉；山可用股静脉、隐静脉、前肢皮下头静脉；山 羊颈静脉，小型猪耳静脉、颈静脉或前大静羊颈静脉，小型猪耳静脉、颈静脉或前大静 脉，鸡翼下静脉，犬舌下小静脉脉，鸡翼下静脉，犬舌下小静脉 5 5 腹腔接种腹腔接种 6 6 脑内接种脑内接种 制剂的基本生产技术病毒增殖技术10 三、禽胚增殖病毒技术三、禽胚增殖病毒技术 n禽胚的选择禽胚的选择 1 SPF1 SPF鸡胚：无鸡的特定的鸡胚：无鸡的特定的2222种病原体种病原体 2 2 非免疫鸡胚：无特定病原的母源抗体非免疫鸡胚：无特定病原的母源抗体 3 3 鸭胚：无干扰抗体的健康鸭胚鸭胚：无干

7、扰抗体的健康鸭胚 制剂的基本生产技术病毒增殖技术11 1 1 卵黄囊卵黄囊 2 2 卵白卵白 3 3 尿囊腔尿囊腔 4 4 羊膜腔羊膜腔 5 5 气室气室 6 6 壳膜壳膜 制剂的基本生产技术病毒增殖技术12 （一）禽胚接种途径与收获（一）禽胚接种途径与收获 n绒毛尿囊膜接种法绒毛尿囊膜接种法 多用于嗜皮肤性病毒的增殖：痘病毒、新城疫和疱疹病毒多用于嗜皮肤性病毒的增殖：痘病毒、新城疫和疱疹病毒 制剂的基本生产技术病毒增殖技术13 1 1 选择选择10101313日龄的鸡胚，划出气室和胚位日龄的鸡胚，划出气室和胚位 2 2 消毒后在气室部位钻一小孔，在鸡胚面避开血消毒后在气室部位钻一小孔，在鸡胚

8、面避开血 管钻一小孔，勿穿透绒毛尿囊膜管钻一小孔，勿穿透绒毛尿囊膜 3 3 用橡胶吸球紧贴气室孔轻轻一吸，使鸡胚面小用橡胶吸球紧贴气室孔轻轻一吸，使鸡胚面小 孔处的绒毛膜下陷造成人工气室孔处的绒毛膜下陷造成人工气室 4 4 在人工气室孔注入在人工气室孔注入0.10.10.2ml0.2ml病毒液，轻摇鸡病毒液，轻摇鸡 蛋使病毒液均匀散布于绒毛尿囊膜上蛋使病毒液均匀散布于绒毛尿囊膜上 5 5 用石蜡封口，用石蜡封口，35353737培养培养 制剂的基本生产技术病毒增殖技术14 1 1 选用选用10101313日龄鸡胚日龄鸡胚 2 2 在气室部位距气室分界线在气室部位距气室分界线3 35mm5mm处

9、打一小孔处打一小孔 3 3 用细针头斜向蛋壳面插入约用细针头斜向蛋壳面插入约5mm5mm，再退出于气室内注射，再退出于气室内注射 4 4 封口后直立，封口后直立，3737，2h2h，不翻蛋，不翻蛋 5 5 常规孵化，每日照蛋常规孵化，每日照蛋2 2次，及时取出死亡胚次，及时取出死亡胚44，12h12h收获收获 消毒后，去除蛋壳和壳膜，用灭菌镊子轻轻夹起绒毛尿消毒后，去除蛋壳和壳膜，用灭菌镊子轻轻夹起绒毛尿 囊膜，并沿气室周围将绒毛尿囊膜全部剪下，取病变明囊膜，并沿气室周围将绒毛尿囊膜全部剪下，取病变明 显部位，经研磨制成病毒悬液显部位，经研磨制成病毒悬液 制剂的基本生产技术病毒增殖技术15 n

10、尿囊腔接种尿囊腔接种 用于新城疫病毒、鸭传染性肝炎病毒和传染性支气管炎病毒用于新城疫病毒、鸭传染性肝炎病毒和传染性支气管炎病毒 制剂的基本生产技术病毒增殖技术16 n接种：接种：911日龄鸡胚，划出气室边界，在胚胎日龄鸡胚，划出气室边界，在胚胎 距气室边界上或距气室边界上或/和下和下23mm处做标记，消毒处做标记，消毒 后，在标记处打孔，注入病毒液，封口，孵化后，在标记处打孔，注入病毒液，封口，孵化 n收获：收获：4放置放置6h或或20 0.51h，消毒，去，消毒，去 除蛋壳，用灭菌吸管插入尿囊腔，取出尿囊液除蛋壳，用灭菌吸管插入尿囊腔，取出尿囊液 和羊水备用和羊水备用 制剂的基本生产技术病毒

11、增殖技术17 n卵黄囊接种法卵黄囊接种法 5 58 8日龄鸡胚，在气室日龄鸡胚，在气室 中心壳上钻一小孔中心壳上钻一小孔 针头沿胚的纵轴插入约针头沿胚的纵轴插入约 30mm30mm，封口，孵化，封口，孵化 主要用于立克次氏体、鹦鹉热衣原体及某些病毒的增殖主要用于立克次氏体、鹦鹉热衣原体及某些病毒的增殖 制剂的基本生产技术病毒增殖技术18 收获：无菌撕破绒毛尿囊膜和羊膜，夹起鸡胚切收获：无菌撕破绒毛尿囊膜和羊膜，夹起鸡胚切 断卵黄带置于灭菌平皿中。如系收获鸡胚则将断卵黄带置于灭菌平皿中。如系收获鸡胚则将 鸡胚低温保存备用；如系收获卵黄囊则将内容鸡胚低温保存备用；如系收获卵黄囊则将内容 物倒入平皿

12、中，用镊子将卵黄囊及绒毛尿囊膜物倒入平皿中，用镊子将卵黄囊及绒毛尿囊膜 分开，用灭菌生理盐水冲去卵黄，取卵黄囊低分开，用灭菌生理盐水冲去卵黄，取卵黄囊低 温保存备用温保存备用 制剂的基本生产技术病毒增殖技术19 n羊膜腔接种法：羊膜腔接种法： 1 1、操作在照蛋灯下进行，取、操作在照蛋灯下进行，取10101212日龄鸡胚直立于蛋盘上，划日龄鸡胚直立于蛋盘上，划 出气室和胚胎位置出气室和胚胎位置 2 2、在气室端靠近胚胎侧的蛋壳上钻孔，将注射器针头轻轻刺向、在气室端靠近胚胎侧的蛋壳上钻孔，将注射器针头轻轻刺向 胚体，当稍感抵抗时即可注入病毒液胚体，当稍感抵抗时即可注入病毒液 将注射器针头刺向胚体

13、，以针头拨动胚体下颚或腿，如胚体随将注射器针头刺向胚体，以针头拨动胚体下颚或腿，如胚体随 针头的拨动而动，说明针头已进入羊膜腔，注射病毒液针头的拨动而动，说明针头已进入羊膜腔，注射病毒液 3 3、封口孵化，收获方法与尿囊腔接种方法同、封口孵化，收获方法与尿囊腔接种方法同 病毒感染鸡胚全部组织，且可以通过胚体泄入尿囊腔病毒感染鸡胚全部组织，且可以通过胚体泄入尿囊腔 制剂的基本生产技术病毒增殖技术20 n脑内接种法脑内接种法 1 1、8 81313日龄鸡胚，划出气室和胎位，在气室靠近日龄鸡胚，划出气室和胎位，在气室靠近 胚胎侧的蛋壳上钻孔胚胎侧的蛋壳上钻孔 2 2、在绒毛尿囊膜上无大血管处切开一小

14、口，用弯头、在绒毛尿囊膜上无大血管处切开一小口，用弯头 镊子通过羊膜夹住鸡胚眼睑固定头部，注射器插入镊子通过羊膜夹住鸡胚眼睑固定头部，注射器插入 鸡胚注入病毒液鸡胚注入病毒液0.010.010.02ml0.02ml 3 3、无菌条件下取出鸡胚，低温保存备用、无菌条件下取出鸡胚，低温保存备用 常用于狂犬病毒的增殖常用于狂犬病毒的增殖 制剂的基本生产技术病毒增殖技术21 n胚体接种法胚体接种法 1 1、接种方法同脑内接种、接种方法同脑内接种 2 2、针头刺入胚体内接种、针头刺入胚体内接种 制剂的基本生产技术病毒增殖技术22 n静脉接种法静脉接种法 1 1、11111414日龄鸡胚，照蛋，选取绒毛尿

15、囊膜上大而直的静日龄鸡胚，照蛋，选取绒毛尿囊膜上大而直的静 脉，并在蛋壳上划一长方形记号，并划出血流方向脉，并在蛋壳上划一长方形记号，并划出血流方向 2 2、用蛋钻在注射部位开一长方形裂痕，除去蛋壳，于蛋壳、用蛋钻在注射部位开一长方形裂痕，除去蛋壳，于蛋壳 内膜上滴一滴灭菌液体石蜡，使静脉透明可见内膜上滴一滴灭菌液体石蜡，使静脉透明可见 3 3、用注射器顺血流方向刺入血管注入、用注射器顺血流方向刺入血管注入0.050.050.2ml0.2ml病毒液，病毒液， 拔出针头可以不封口，孵化，弃掉拔出针头可以不封口，孵化，弃掉24h24h内死胚内死胚 4 4、收获时按脑内接种法沿反血流方向静脉插入针头

16、，可得、收获时按脑内接种法沿反血流方向静脉插入针头，可得 0.050.050.5ml0.5ml血液，或去除气室蛋壳，滴一滴灭菌液体石蜡血液，或去除气室蛋壳，滴一滴灭菌液体石蜡 于蛋膜，通过蛋膜用针头刺破内部大血管，使血液渗出壳于蛋膜，通过蛋膜用针头刺破内部大血管，使血液渗出壳 膜之上，用吸管吸取，可得膜之上，用吸管吸取，可得0.5ml0.5ml血液血液 制剂的基本生产技术病毒增殖技术23 （三）影响禽胚增殖病毒的因素（三）影响禽胚增殖病毒的因素 n种蛋质量：种蛋质量： 病原微生物：病原微生物：污染制品本身，又影响接种病毒污染制品本身，又影响接种病毒 在鸡胚中的增殖在鸡胚中的增殖 母源抗体：母源

17、抗体：影响病毒在鸡胚内的增殖影响病毒在鸡胚内的增殖 抗生素：抗生素：影响病原体的增殖影响病原体的增殖 制剂的基本生产技术病毒增殖技术24 n孵化技术：孵化技术： 温度：温度：3739.5，宁低勿高，宁低勿高 湿度：湿度：鸡胚鸡胚5357水禽比鸡胚高水禽比鸡胚高510 通风：通风：机械通风或定期开启恒温培养箱机械通风或定期开启恒温培养箱 翻蛋：翻蛋：大头向上垂直放置，定期翻蛋，孵化至大头向上垂直放置，定期翻蛋，孵化至47天翻蛋天翻蛋 制剂的基本生产技术病毒增殖技术25 n接种技术：接种技术： 不同病毒有不同的接种途径，同种病毒接种不同不同病毒有不同的接种途径，同种病毒接种不同 日龄的禽胚获得的病

18、毒量也不同；日龄的禽胚获得的病毒量也不同； 尿囊腔接种时，根据病毒培养所需时间选择最恰尿囊腔接种时，根据病毒培养所需时间选择最恰 当的接种胚龄；当的接种胚龄； 严格操作，接种时不应伤及胚体和血管，以免影严格操作，接种时不应伤及胚体和血管，以免影 响其发育。响其发育。 制剂的基本生产技术病毒增殖技术26 n禽胚污染：禽胚污染： 接种时应严格无菌操作接种时应严格无菌操作 定期清扫消毒孵化室，保持空气新鲜定期清扫消毒孵化室，保持空气新鲜 种蛋入孵前要清洗、消毒、晾干种蛋入孵前要清洗、消毒、晾干 制剂的基本生产技术病毒增殖技术27 细胞培养技术 n概念：细胞培养概念：细胞培养 原代细胞、细胞株、传代细胞原代细胞、细胞株、传代细胞 n细胞培养方法细胞培养方法 静置培养、转瓶培养、悬浮培养、微载体静置培养、转瓶培养、悬浮培养、微载体 培养、微囊化细胞培养培养、微囊化细胞培养 n细胞制备：举例细胞制备：举例CEFCEF制备过程制备过程 n细胞的冻存与复苏：慢冻快融法细胞的冻存与复苏：慢冻快融法 制剂的基本生产技术病毒增殖技术28 n细胞培养要素细胞培养要素 培养液、血清、细胞接种量、培养液、血清、细胞接种量、pHpH、温度、温度、 无菌条件、培养器皿清洁度无菌条件、培养器皿清洁度 n细胞培养污染问题细胞培养污染问题 n细菌、真菌、支