双缩脲法测定蛋白质含量

1、仅供个人参考实验二十 蛋白质含量测定一一双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。二、实验原理在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红 色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(一CO-NH2)，或与此相似的基团如一CH2-NH2， CS-NH2， C(NH)NH2的任何 化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(CO-NH )，可发生双缩脲反应，且呈色强 度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测

2、定范围为110mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。 主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白 质测定。三、实验试剂和器材试剂1 .双缩脲试剂： 取CuSO4 5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量 蒸馏水溶解，再加2.5mol/L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。 棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。2. 标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA )或标准酪蛋白，配制

3、成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯 度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCI配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。器材1. 试管：15X 150mm试管7只；2. 1ml，5ml 移液管；仅供个人参考3 .坐标纸;4. 721分光光度计四、实验操作取试管7支，编号，按下表操作:试剂管号空白管12345测定管蛋白标准液（10g/L）-0.10.20.30.40.5生理盐水0.510.40.30.20.1-0.4待测样品-0.1

4、双缩脲试 剂3.03.03.03.03.03.03.0相当蛋白质（g/L）01020304050-混匀，37C水浴20分钟，冷却至室温，在分光光度计波长 540nm处，用空 白管调零，读取各管吸光度值。15为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度 为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 以测定管的吸光度，在标准曲线 上求得蛋白质浓度。注意事项1. 双缩脲试剂中，加入酒石酸钾钠， Cu2+形成稳定的络合铜离子，以防止 CuS04 5H20不稳定形成Cu（0H）2沉淀。 酒石酸钾钠与CuS04 5H20之比不低于3： 1，加入KI作为抗氧化试剂。2. 双缩脲试剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳

5、。3. 本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响， 唯一缺点是灵敏度较低。4. 黄疸血清、严重溶血对本法有明显干扰。思考题1 双缩脲法测定蛋白质的原理是什么？其它还有什么方法测定蛋白质的含量？ 2.请用双缩脲法，设计一个测定蛋白质含量的定量方法（除标准曲线法外）。仅供个人参考仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.to员bko gA.nrogeHKO TOpMenob