实验二、补骨脂黄酮体的提取、分离及鉴定

1、实验二、补骨脂黄酮体的提取、分实验二、补骨脂黄酮体的提取、分 离及鉴定离及鉴定 实验目的和要求实验目的和要求 掌握补骨脂黄酮体的提取分离原理及操 作： 溶剂法提取、聚酰胺柱色谱分离 熟悉黄酮类化合物在聚酰胺上的吸附规 律与结构的相互关系。 不同层析系统原理不同层析系统原理 硅胶硅胶：是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到 分离，硅胶为极性吸附剂，化合物的极性越强， 吸附剂对其吸附能力就越强；洗脱剂的极性越大， 其洗脱能力就越强。 聚酰胺：聚酰胺：由酰胺键聚合形成的高分子化合物。当 所分离化合物的结构与聚酰胺形成氢键的能力越 强，其吸附越强，越难洗脱。其用途比较广，基 本上各种类型化合物都能使用。

2、 聚酰胺具有“双重色谱”性能之故，即其分 子中既有非极性的脂肪链，又有极性的酰胺 基团，当用极性移动相（如含水溶剂系统） 洗脱时，聚酰胺作为非极性固定相，其色谱 行为类似反相分配色谱，因黄酮苷比游离黄 酮极性大，所以苷比游离黄酮容易洗脱。当 用有机溶剂（如氯仿-甲醇）洗脱时，聚酰胺 作为极性固定相，其色谱行为类似正相分配 色谱，因游离黄酮的极性比黄酮苷小，所以 游离黄酮比黄酮苷容易洗脱。 聚酰胺聚酰胺“双重色谱双重色谱”原理原理 正相色谱正相色谱 反相色谱反相色谱 聚酰胺：极性固定相（极性酰胺基团） 非极性固定相（非极性脂肪链） 洗脱剂：有机溶剂（氯仿-甲醇，极性小） 含水溶剂（甲醇-水，极性

3、大） 先洗脱：游离黄酮（苷元，极性小） 苷（极性大）（柱色谱分离） rf值： 苷元 苷 苷元 苷（tlc色谱鉴别） *上述规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层上的行为。上述规律也适用于黄酮类化合物在聚酰胺薄层上的行为。 苷与苷元聚酰苷与苷元聚酰 胺色谱胺色谱 聚酰胺层析系统原理聚酰胺层析系统原理 其酰胺基可与酚羟基、羧基、 羰基、硝基等形成氢键吸附。 聚酰胺是分离黄酮类化合物的比较理想 的吸附剂，其吸附强度主要取决于黄酮 类化合物分子中酚羟基的数目、位置以 及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间 形成氢键缔合能力的大小。黄酮类化合 物从聚酰胺色谱柱上洗脱大致遵循下列 规律： a. 化合物中酚羟基数

4、目越多，被聚酰 胺吸附越牢，越难洗脱。 酚羟基数目 相同时，聚酰胺对邻位羟基吸附弱于间、 对位，容易洗脱。 b. 共轭系统多的形成氢键能力强，因 此黄酮类化合物骨架不同，聚酰胺的吸 附能力也不同，吸附能力从小到大依次 为：异黄酮 二氢黄酮 黄酮 7或4-oh 其他位-oh 5-oh nahco3 +- na2co3+- naoh+ o oh + cl 2.碱性：碱性： -吡喃酮环吡喃酮环1-氧原子氧原子 微弱碱性（孤对电子，接受质子）微弱碱性（孤对电子，接受质子） 仅溶于强的、浓酸仅溶于强的、浓酸 +水水 （浓硫酸）（浓硫酸） 烊烊 盐（呈色）盐（呈色） 应用应用 初步鉴别黄酮母核类型：黄酮、

5、黄酮醇初步鉴别黄酮母核类型：黄酮、黄酮醇 黄黄橙色，并有荧光橙色，并有荧光 二氢黄酮二氢黄酮 橙红（冷）、紫红（热）橙红（冷）、紫红（热） 查耳酮查耳酮 橙红橙红洋红洋红 异黄酮（二氢）异黄酮（二氢） 黄色黄色 橙酮橙酮 红红洋红洋红 显色反应显色反应 1还原显色反应还原显色反应 反应类型反应类型 鉴别特征鉴别特征 鉴别意义鉴别意义 备注备注 盐酸盐酸-镁粉镁粉 黄酮、二氢黄酮、黄酮、二氢黄酮、 红红紫红紫红 黄酮类特征性黄酮类特征性 假阳性假阳性 反应反应 黄酮醇、二氢黄酮醇黄酮醇、二氢黄酮醇 红红紫红紫红 鉴别反应鉴别反应 （花色素）（花色素） （最常用）（最常用） 查耳酮、橙酮、查耳酮、

6、橙酮、 （-） 儿茶素类、异黄酮儿茶素类、异黄酮 （-） 四氢硼钠四氢硼钠 二氢黄酮、二氢黄酮醇二氢黄酮、二氢黄酮醇 红红紫红紫红 二氢黄酮类特有二氢黄酮类特有 还原反应还原反应 其它黄酮类其它黄酮类 （-） 钠汞齐反应钠汞齐反应 黄酮、二氢黄酮黄酮、二氢黄酮 红红 异黄酮、二氢异黄酮异黄酮、二氢异黄酮 红红 黄酮醇类黄酮醇类 黄黄淡红色淡红色 二氢黄酮醇类二氢黄酮醇类 棕黄色棕黄色 2.与金属盐类试剂的络合反应： 三氯化铝反应：4或7，4-oh黄酮显 天蓝色荧光。 补骨脂-化学成份 补骨脂是一些高等生物中发现的杂多环式化合物，补骨 脂主要含黄酮类、香豆素类、单萜酚类等成分。 1.黄酮类 包括

7、补骨脂二氢黄酮(补骨脂甲素、补骨脂 乙素)、补骨脂双氢黄酮甲醚、异补骨脂双氢黄酮、补 骨脂查耳酮、异补骨脂查耳酮、新补骨脂查耳酮、补骨 脂异黄酮、新补骨脂异黄酮、补骨脂异黄酮醛等。 2.香豆素类 包括补骨脂内酯、异补骨脂内酯(异补骨 脂素白芷素)、补骨脂定、异补骨脂定、双羟异补骨脂 定。 3.单萜酚类如补骨脂酚。 4.其他 尚含补骨脂醛、豆甾醇、-谷甾醇葡萄糖苷、 脂肪油、葡萄糖、挥发油、生物碱等。 补骨脂甲素(coryfolin) ：分子量324.36。 无色针状结晶，mp.191192。 补骨脂乙素(isobavachalcone) ：分子 量324.36。黄色片状结晶，mp. 166 1

8、67。 二氢黄酮类：2、3位双键被氢化而成。 o o oh or 补骨脂甲素、乙素结构差异补骨脂甲素、乙素结构差异 o o ho oh 补骨脂甲素 补骨脂乙素 二氢黄酮和查尔酮，异戊烯基取代位置不同使得两者的极性差异二氢黄酮和查尔酮，异戊烯基取代位置不同使得两者的极性差异 补骨脂乙素次生代谢产物转换补骨脂乙素次生代谢产物转换 oh o oh oh oh o ho oh o o ho oh 查尔酮二氢黄酮双键断裂与-oh形成环合 提取分离流程图提取分离流程图 补骨脂粗粉（30g） ch2cl2回流提取（100ml）聚 酰胺(8g)前处理，湿法装柱 药渣ch2cl2液 等体积5%na2co3萃取3

9、次,不振摇 ch2cl2层 （回收） 碱水层 hcl调酸ph4-5, ch2cl2萃取2次，剧烈振摇，每次50ml 酸水层ch2cl2层 回收ch2cl2至干，少量50%甲醇（现配）溶解（超 声、加热助溶），上聚酰胺柱，50% meoh（现配 ）洗脱，至洗脱液呈现黄色 50%甲醇洗脱液(tlc检测) 补骨脂甲素（回收） 80%甲醇（现配）洗脱，至洗脱液颜色变浅 80%甲醇洗脱（tlc检测） 补骨脂乙素（回收） 新购聚酰胺 通常有两种杂质：一种是蜡质（锦纶丝 在制成以后，表面涂有一层蜡）。另一 种是原料单体及其小分子聚合物。 这些杂质必须除去，否则原料单体及其 小分子聚合物可与酚类物质形成复合物。 聚酰胺前处理方法 聚酰胺以90-95%乙醇浸泡，不断搅拌， 除去气泡后装入柱中。 用3-4倍体积的90-95%乙醇洗脱。 再依次用2-2.5倍体积5%naoh水溶液、 1倍体积的蒸馏水、2-2.5倍体积的10% 醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至 ph中性 碱提酸沉法 黄酮类化合物易溶于碱水，难溶于酸 水，因而可用稀碱水溶液提取，酸化使 黄酮类化合物沉淀析出，达到纯化的目 的。注意酸碱的浓度合适，并及时处理 以免苷发生水