血管性痴呆大鼠学习记忆障碍及发病机制

1、血管性痴呆大鼠学习记忆障碍及发病机制【摘要】 目的 研究血管性痴呆 (VD) 大鼠学习记忆障碍及发 病机制。方法 4 血管阻断法制作模型， Morris 水迷宫法检测学习记 忆能力，免疫组化法观察 Bcl 2 和 Bax 表达，流式细胞术检测海 马神经细胞凋亡率， 亚甲蓝比色法检测血清中 H2S 含量。 结果 模型 组大鼠学习记忆能力明显减退。 Bcl 2/Bax 在缺血再灌注 (I/R) 开始 时升高，随后开始下降。模型组大鼠海马神经细胞凋亡率明显增加。 模型组大鼠血清中 H2S 含量明显减少。 血清 H2S 含量与海马神经细 胞凋亡率间呈明显负相关。 结论 VD 可导致学习记忆障碍，海马神

2、 经细胞凋亡和血清中 H2S 含量减少 ;海马神经细胞凋亡程度可能与内 源性 H2S 生成减少有关。【关键词】 血管性痴呆 ;学习记忆 ;免疫组化 ; 流式细胞术 ;硫化氢血管性痴呆 (VD) 是老年期痴呆的主要类型之一， 它是由一系列脑血管因素 (缺血、出血、急慢性缺氧性脑血管病等 )导 致脑组织损害引起的以认知功能障碍为特征的痴呆综合征 1，不仅 给病人带来长期痛苦，严重影响其生活质量，而且给家庭、社会造成 沉重负担， 因此研究 VD 的发病机制以指导其防治具有很高的社会价 值和现实意义。 H2S 是第三类气体信号分子，广泛参与机体的多种 生理和病理过程，为进一步了解其在 VD 发病中的作

3、用，本研究观察 大脑缺血 /再灌注 (I/R) 不同时间对大鼠学习记忆能力的影响、血清中 H2S 含量改变及海马 CA1 区神经细胞凋亡情况，从行为学、细胞凋 亡及内源性 H2S 表达量及其相互关系等方面， 探讨 VD 的发病机制，为其防治提供理论依据。1 材料与方法 1.1 动物与分组 健康 Wistar 雄性大鼠 64 只，体重 300 350 g（由河北省实验动物中心 提供），随机分为 8组，正常组，假手术组和 VD 模型组， VD 模型组 又分为大脑 I/R 2 ，8，24，72，168 和 720 h 组，每组 8 只动物。 1.2 动物模型制备 4 血管阻断法 （4 VO 法）2建

4、立 VD 大鼠模型。 假手术组麻醉及手术过程与 VD 模型组相同，但不电凝双侧椎动脉， 不阻断双侧颈总动脉。术后按再灌注的不同时间分别将动物处死,经主动脉依次灌注生理盐水 100 ml 和 4%多聚甲醛 500 ml ，取出脑组 织，石蜡包埋切片，用于免疫组化显示 Bcl 2、Bax 及苏木素 红（HE）染色。 1.3 学习记忆能力的测定 Morris 水迷宫检测 3： 实验开始于 VD 术后 4 w，预先将迷宫任意分为 4 个象限。平台放入 上述 4 个象限中随机选择的 1 个象限中，在大鼠游泳池边标记 4 点 作为大鼠的入水点，记录 120 s 内大鼠从入水到爬上平台所需的时 间，即逃避潜

5、伏期。记录各组大鼠的逃避潜伏期，作为学习记忆能力 检测指标。 1.4 取材 大鼠 10%水合氯醛 （3 ml/kg 体重）腹腔注射 麻醉后，快速开胸暴露心脏，心尖取血 45 ml，分离血清，用于血 清 H2S 含量测定 ; 然后断头处死，并立即在冰台上开颅，迅速分离大 鼠海马，用 70% 酒精固定， 4冰箱保存过夜， 用于流式细胞术检测。 1.5 HE 染色 切片常规脱蜡至水 1%盐酸酒精分化伊红染色 2 min 切 片常规梯度酒精脱水二甲苯二甲苯中性树胶封固。 1.6 免疫组 化染色（SP 法） Bax 兔抗鼠多克隆抗体， Bcl 2 兔抗鼠多克隆抗体 （Santa Cruz 公司生 产）。

6、 1.7 流式细胞术检测 采用美国1.8Beckman Coulter 公司生产的 Epics XL 型流式细胞仪 血清中 H2S 含量的检测 亚甲蓝分光光度法。 1.9 统计学处理 用 SPSS13.0 统计软件，采用单因素方差分析， 两两比较采用 SNK 法。 2 结 果 2.1 学习记忆能力检测结果 各组大鼠在迷宫各入水点 搜索平台的结果见表 1，随着训练天数的增加，各组大鼠的逃避潜伏 期均缩短，第 2 天 I/R 720 h 组与正常组和假手术组比较逃避潜伏期 明显延长 (P0.01);正常组和假手术组逃避潜伏期差异不显著 (P0.05) 。 2.2 VD 大鼠病理形态学结果 HE 染

7、色后，神经细胞胞浆呈淡红色， 核呈蓝黑色。假手术组大鼠海马 CA1 区神经元排列整齐、密集，细 胞完整，结构正常，胞浆丰富，胶质细胞无增生 ;细胞核呈圆形、椭 圆形，无变性， 无固缩或溶解现象。 VD 模型组海马 CA1 区神经元排 列紊乱，神经元变性，体积变小，胞核与胞浆界限不清，核固缩成三 角形或不规则形，而且随 I/R 时间的延长，变性神经元数目越多，见 图 1 。 表 1 各组逃避潜伏期比较 2.3 凋亡蛋白表达结果 2.3.1 VD 大鼠模型海马 CA1 区 Bcl 2 表达 VD 模型组 I/R 2 h Bcl2 蛋白平均 OD 值开始明显上调， I/R 8 h 达到高峰， 之后随

8、 I/R 时 间的延长开始下降，但 I/R 24 h 组仍高于假手术组。假手术组与 I/R 不同时间点组间， Bcl 2 的表达情况均有显著差异 (P0.01)( 表 2)。 2.3.2 VD 大鼠模型海马 CA1 区 Bax 的表达 I/R 早期 Bax 在海马 CA1 区的表达明显增强， 随着再灌注时间的延长， 其表达量不断增加， I/R 72 168 h 达高峰。假手术组与 I/R 不同时间点组之间， Bax 的表达 均有显著差异 (P0.01)(表 2)。2.3.3 Bcl 2/Bax 比率变化 随 I/R 时间的延长， Bcl 2/Bax 的比率逐渐降低 (表 2)。表 2 VD 大

9、鼠 Bcl2、Bax 的表达水平与假手术组比较： 1)P0.05 ，2)P0.012.4 流式细胞术检测海马神经细胞凋亡率结果 随着 I/R 时间的延长，大鼠 海马神经细胞凋亡率逐渐增高，其中 I/R 2 h 组凋亡率最低， I/R 168 h 组凋亡率最高。 VD 模型各时间组与假手术组比较，海马神经细胞 凋亡率明显增加 (P0.01);I/R 不同时间组间两两比较， 各组间海马神经 细胞凋亡率均差异显著 (P0.01) ，见表 3。 2.5 血清 H2S 含量检 测结果 随着 I/R 时间的延长，大鼠血清 H2S 含量呈现直线降低趋势， 其中 IR 2 h 组血清 H2S 含量最高， I/

10、R 168 h 组血清 H2S 含量最低。 VD 模型各时间组与正常组和假手术组比较， 血清 H2S 含量明显减少 (P0.01);I/R 不同时间组间两两比较，血清 H2S 含量均差异显著 (P0.01); 正常组和假手术组血清 H2S 含量无显著差异 (P0.05) ，见表 3。2.6 血清 H2S 含量与海马神经细胞凋亡率相关分析 随着血清 H2S 含量的降低，海马神经细胞凋亡率逐渐升高，两者呈现明显 的 负 相 关 ， 回 归 方 程 为 ： y=-0.135x+12.068 ， 相 关 系 数 r=-0.861(P0.01) ，提示内源性 H2S 可能具有保护神经细胞的功能。 表 3

11、 各组海马神经细胞凋亡率及血清 H2S 含量 (各组间两两比较： 1)P0.01 3 讨 论 目前认为， I/R 后神经元死亡的机制是损伤 级联反应，脑缺血性损伤级联反应大多以能量衰竭和兴奋性氨基酸毒 性开始，以细胞凋亡结束。本实验中用 HE 染色观察到海马 CA1 区 大量细胞呈现明显的凋亡特征， VD 模型组大鼠海马 CA1 区可见神经 元排列紊乱，神经元变性，体积变小，核固缩成三角形或不规则形，胞核与胞浆界限不清。流式细胞术检测海马神经细胞的凋亡率发现VD 模型各组与假手术组相比海马神经细胞凋亡率明显增加，而且随 着 I/R 时间的延长，大鼠海马神经细胞的凋亡率逐渐增加。 在参与调控神经

12、元凋亡的基因和蛋白质产物中，一类是抗凋亡蛋白， 包括 Bcl 2， Bcl xL ，BclAl 等 ;另一类是促凋亡蛋白，包括Bax 、Bak 、Bad 等 4。体外研究显示 5：Bcl 2 保护细胞免 于各种损伤。本实验结果显示 VD 模型组 I/R 2 h 后 Bcl 2蛋白平 均光密度值开始明显上调， IR 8 h 达到高峰，之后开始下降，但 IR 72 h 仍高于假手术组 ; 而 Bax 蛋白在 I/R 早期在海马 CA1 区的表达明显 增强，且随着再灌注时间的延长，其表达不断增加。 Bcl 2 蛋白家 族中促凋亡和抑凋亡两类蛋白的比例即 Bcl 2/Bax 的比率决定细胞 在受到凋亡

13、信号刺激后是否发生凋亡 6，本次研究显示 Bcl 2/Bax 的比率随 I/R 时间的延长逐渐降低，而大鼠海马神经细胞的凋亡率则 逐渐增加，这也从另一方面证实了 Bcl 2 蛋白的抗凋亡作用。 VD 主要表现为学习记忆能力的降低， 而海马是学习记忆的重要结构， I/R 损伤后海马区的神经细胞凋亡势必对学习记忆功能产生重要的影 响。本研究利用 Morris 水迷宫技术对 VD 模型大鼠的空间学习记忆 能力进行测试，发现 I/R 720 h 组较正常组和假手术组的逃避潜伏期 明显延长，表明 VD 可造成大鼠学习记忆功能障碍， 其机制可能是 I/R 损伤引起海马神经细胞凋亡，从而导致海马学习记忆功能

14、障碍。H2S 是继一氧化氮 (NO)和一氧化碳 (CO) 之后被发现的另一种具有神 经调节作用的新型气体信号分子 7， H2S 不仅在神经系统发挥重 要的生理作用， 而且还可作为一种内源性的抗氧化剂， 在氧化应激时 能够清除羟自由基等活性氧簇 8，9，具有抗氧化、恢复认知功能、 调节脑血流量等作用，也提示 H2S 可能也参与老年痴呆动物或病人 神经元的保护 10。本研究结果显示随着大脑 I/R 时间的延长，各 组大鼠血清 H2S 含量均减少， 而海马 CA1 区凋亡神经细胞数逐渐增 加 ;随着血清 H2S 含量的降低，海马神经细胞凋亡率逐渐升高，两者 间呈现明显的负相关关系，提示内源性 H2S

15、 对脑 I/R 损伤中的神经 细胞具有保护作用，可以减少细胞凋亡的发生。关于 H2S 发挥保护 作用的机制尚不十分清楚，有研究表明，对于体外培养的心肌细胞， H2S 可通过直接清除 H2O2 和 O 2 而减少脂质过氧化产物 MDA 的生成 11 ;对于神经细胞， H2S 可抑制过氧亚硝酸盐介导的细胞 毒性作用， 抑制细胞内蛋白质分子的氧化和硝基化 8，或者通过促 进还原型谷胱甘肽的产生而对抗氧化应激损伤 9，H2S 被证实可 激活 ATP 敏感的 K 通道(KATP) 12，从而起到细胞保护作用。综 上所述，I/R 损伤可引起内源性 H2S 含量降低， 从而导致海马神经细 胞凋亡率升高 ;I

16、/R 损伤后大鼠学习记忆功能障碍是海马神经细胞凋 亡的必然结果。因此，提供外源性 H2S 或 H2S 供体以降低海马神经 细胞凋亡率可能是治疗 VD 的新方法。【参考文献】1 李 梨，周岐新，石京山 . 血管性痴呆研究概况 J.中国老 年学杂志， 2005;25(10) ： 1269.2 Pulsinelli WA, Brierley JB. A new model of bilateralhemispheric ischemia in the unanesthetized rat J . Stroke, 1979;10(3) ：26772.3 高晓兰，宋焱峰，候一平，等 . 植物雌激素对血管

17、性痴呆大鼠 学习记忆及海马神经肽 Y的干预效应J.中国临床康复，2006;10(6) ： 52.4 Gross A, McDonnell JM, Korsmeyer SJ. Bcl 2 family members and the mitochondria in apoptosis J . Genes Dev, 1999;13(15) ：1899 911.5 田金洲 . 血管性痴呆 M. 北京：人民卫生出版社， 2003 ： 271.6 刘亚君，崔 鹤，谢东萍，等 . Bcl 2 和 Bax 在缺血预处理保 护海马神经元缺血再灌注损伤中的作用 J. 山东大学学报 (医学版 )， 2006;44

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