蛋白质的定量测定试验报告

1、实验名称(Title of Experimetn)蛋白质的定量测定（ Folin - 酚试剂法）实验日期(Date of Experiment)XXXX实验地点( Lab No.)XXXX合作者(Partner)XXXX指导老师(Instructor)XXXX总分(Total Score)教师签名(Signature)批改日期（Date）一、实验预习1.0 实验目的初步了解各种蛋白质含量测定的常用方法。掌握 Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量的原理及熟悉和掌握实验操作技术。掌握用 excel 制作标准曲线和通过标准曲线及标准管方法求样品溶液中待测定物 质含量。1.1 实验原理1.1.1 总体

2、概述Folin- 酚试剂法是经过科学家改进的测定蛋白质含量的方法， Folin 首创这种 方法：利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸- 磷钼酸）起蓝色反应。而后， Lowry 对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂 反应，提高了灵敏度，灵敏度的范围为： 20 : 250 g，故使得实验的精确度大大提高， 但同时也存在着干扰物质多、费时、操作严格计时等问题。1.1.2 双缩脲反应2在碱性溶液中，双缩脲（ H2NOC NH CONH 2）能和 Cu2 作用，发生配位 反应，形成紫色或紫红色的络合物，即为双缩脲反应。由于蛋白质的肽键结构与双缩脲结构相似，故在碱性

3、溶液中，蛋白质的分子中22肽键能和碱性铜试剂中的 Cu2 作用，生成紫红色的蛋白质 - Cu2 复合物。对于蛋白质的 测定来说，这一步是基础，这也是 Folin- 酚法的基础原理。1.1.3 Folin- 酚显色反应Folin- 酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐 - 磷钨酸盐易背酚类化合物2 还原而呈现蓝色。酪氨酸（ Tyr ）含有酚羟基，故蛋白质 - Cu2 复合物含有的酪氨酸或色 氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。在一定的浓度范围内，蓝色的深浅与蛋白质的浓度呈线性关系。故可以利用上 述两种反应通过分光光度法测定待测样品的蛋白质含量。1.1.4 分光光度法测定样品

4、的蛋白质的含量 本实验以上述两个反应原理为基础，再通过设置空白对照组，标准管中设置蛋 白标准液的一系列浓度梯度（ 0.2mL ， 0.4mL ， 0.6mL ， 0.8mL ）通过分光光度计测定 吸光度，从而获取标准曲线，样品管通过测定的吸光度值，在标准曲线中找到较为准确 对应的含量。1.2 实验材料1.2.1 实验样品 血清稀释液（正常人血清稀释 300 倍）1.2.2 实验试剂 200 g/ml 牛血清白蛋白标准液（ BSA ）； 碱性硫酸铜溶液 （组成：碱溶液与硫酸铜溶液按 50:1 混合而成， 使 用时该溶液必须新鲜配制，当日有效） ； Folin- 酚试剂 （配制过程较为复杂） 注：

5、此次实验所用的试剂全部已由老师制备好，所以无配制过程，但需知道配制流程，可查阅实验书 P105。1.2.3 实验仪器及器材 V-1100可见光分光光度计； 恒温水浴箱；试管 6 支、试管架； 加样枪、加样枪架。1.3 实验步骤1.3.1 实验流程1.3.2 实验步骤步骤操作（1）反应体系设置取 6 只洁净的试管，利用加样枪按要求量取相应量的溶液，混合均匀（各试管的需加入的试剂和量见下表） ：试剂空白管标准管样品管123456牛血清蛋白质标准液00.20.40.60.80样品液000000.5蒸馏水1.00.80.60.40.20.5每隔一分钟，依次往 1 号试管到 6 号试管中加入 2mL的碱

6、性2）双缩脲反应 硫酸铜溶液， 摇匀并记录每支试管的加入硫酸铜时间， 室温静置 10min（3）Folin- 酚反应将静置时间达到 10min 中的试管中，加入 0.20mL的 Folin - 酚试剂，快速摇匀（一般在 2s 以内）。在 400C 下水浴加热 10min 钟同样需计时。10min 钟后取出冷却至室温。（4）比色测定转动波长旋钮， 调制 500.0nm，按“mode”键切换到 T 档， 分别将 1-6 号试管中混合液放入比色杯中利用 1 号试管为空 白，校置 100；调至 A 档，依次测定 2-6 试管的吸光度，并读取数据。 重复操作，再读取数据 2 次，并记录。数据表格见表 1

7、（5）绘制标准曲线利用测得的数据，绘制以 A500 值为纵坐标，牛血清清蛋白标 准液浓度为横坐标的准备曲线，具体绘制利用 excel 制作， 结果可见图 2（6）测样品蛋白 质含量根据样品管（ 6 管）的吸光度值，在标准曲线中找到对 应的蛋白质浓度，再乘以稀释倍数（ 300），得出每毫升未稀 释血清含蛋白质的微克数， 即每毫升血清中蛋白质的微克数 （mg/ml） 。血清蛋白浓度 （ g/ml） = 样品蛋白质浓度 2300 参考：正常人血清蛋白浓度范围为 6080 g/L。1.3.3 注意事项试剂要求： 实验所需的试剂必须是新鲜配制，不然会存在被空气及其他物质 氧化还原的情况，干扰实验的测定。

8、控制时间 ：Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。严格按照实验步骤的操作， 规定的时间是多少就多少。 水浴时间也不宜过长。 同时， 在最后从水浴加热后取出冷却后，需及时的进行比色测定。防止混合液中物质发生系列 变化和反应。加入 Folin- 酚试剂后，需要马上混合摇匀，防止磷钼酸 - 磷钨酸试剂被破坏。 干扰物质的影响 ：凡干扰双缩脲反应的基团，均可干扰 Folin- 酚反应。这些 物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加 碳酸钠氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠氢氧化钠浓 度 12 倍，这样即可纠正显色后

9、色浅的弊病。 绘制曲线要求 ：作过原点的直线或光滑连续的曲线，该线表示实验点的平均 变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲 线或直线两侧。 （ 电脑 Excel 绘图，可以不考虑 ） 操作要按照实验步骤，一步一步来，防止操作问题导致的操作误差的出现等。二、实验记录2.1 实验条件材料及试剂： 本次实验的试剂和材料均是实验室配制好的，比例和浓度同实验预习， 故不再赘述。实验时间表：总表实验步骤消耗时间混合溶液未计时滴加溶液静置10min加 Folin- 酚试剂、水浴10min室温冷却27min等待20min比色测定6min附表项目时刻表试管 1试管 2试管

10、3试管 4试管 5试管 6加硫酸铜842”09843”20844”29845”45846”55847”55水浴852”09853”20854”29855”45856”55857”55冷却等待902”09903”22904”29905”45906”55908”00操作技巧：在这一次的实验中，关键的要点在于滴加 Folin- 酚试剂的摇匀，必须快速摇匀， 保证反应优先进行。振荡试管时，振荡的正确方法是用手腕的力左右摆动，使试管中液 体混合均匀且不漏出。最后放入到水浴中加热。 在分光比色的时候，测量一次后重新凋零，不能继续测量等。 操作失误： 全部实验过程中，就出现了一次失误，即在试管 4 加入 F

11、olin- 酚试剂，充分摇匀，在放 入水浴加热之间，部分液体由于磕碰而溅出。其余操作严格按照要求一步步完成，理论 不存在着失误。分析 ：Folin- 酚与液体已经混合均匀并反应，在后面的水浴加热后，只是影响到了 整体的试管 4 的反应后得到的溶液量，而不影响颜色的变化及最后的比色测定，故该失 误不会对实验产生测定的偏差。2.2 实验现象在滴加硫酸铜溶液后，摇匀，产生较多的黏性气泡且附着在液体表面。液体颜色 变化不深。 在滴加 Folin- 酚试剂水浴加热后，除试管 1 为淡黄色外，其余试管均成不同的蓝 色。具体看下图：图一 水浴后各试管的情况图分析：标准液的试管中（ 2-5 ）蓝色不断加深，同

12、实际的标准液的含量多少正相关， 而试管 6的颜色不深，在 1-2 试管之间，根据实验原理初步可以判定的是：该样品液的 蛋白质含量将不会在 60-80g/L 之间，而是在 0-40g/L 。即实验存在一定的问题， 详见结 果的分析与讨论。2.3 实验原始数据本次实验原始数据是在 500nm的波长下，各试管混合液的吸光度值，结果见下表 1表1 500nm波长吸光度值记录测定次数各管吸光度值 A50023 45610.3530.561 0.7440.9380.17220.3500.5620.7440.9380.17230.3510.5620.7430.9380.172各管平均值 A 500三、结果与

13、讨论3.1 数据处理3.1.1 利用原始数据，可得到各管的平均值：2管： A 500 =(0.353+0.350+0.351 )/3=0.3513 ；3管： A 500 =(0.561+0.562+0.562 )/3=0.5617 ；依次得到 4-6 管的吸光度值如下所示：测定次数各管吸光度值 A500234 56各管平均值 A 5000.35130.56170.7437 0.93800.17203.1.2 Excel 绘制蛋白质的标准曲线根据用 Excel 绘制标准曲线 PPt 所示步骤，最终得到如下结果：图 2 标准曲线图2 从图中我们可以看到线性方程： y 0.0062 ? x ， R2

14、 0.9659将样品溶液的吸光度 （即y值）代入方程，可得出样品浓度 （即 x值） ；由相关指数值R2可看出误差大小。 y 0.1720 x 0.1720 0.0062 27.74 g /mL血清蛋白浓度 （ g/ml） = 样品蛋白质浓度 2300故得血清蛋白浓度为 16.65g / L 。3.2 结果由上数据处理可知， 最后的待测样品的蛋白质含量为 16.65g / L 。而真正的正常人血清蛋白浓度范围为 6080 g/L。因此，存在一定问题，具体分析见 3.3 分析与讨论。3.3 分析与讨论首先，我们回顾了整个操作过程，在整个过程中，我们基本都是按照要求操作，并 不存在着明显的操作问题。

15、通过上面水浴加热后的图可以明显看到，结果的确应该在 0-20g/L 之间。同时我们与和我们一样使用试剂的组讨论后发现，他们的结果也是在 10 几左右；同时，很多组测出的结果都偏低，故可以初步判定结果的测量方式上不存在明显问题。其次，回顾全部过程的原理，我们猜测可能存在的造成结果低的情况为：在室温冷却后，实验室没有空余的分光光度计，排队时间应该是全部小组中最长 的，基本花去 30 多分钟。而这也导致了最后的显色增强（其具体的显色原因可能为物 质间的复杂反应导致）从而使得最后的标准曲线的斜率增大，导致测定的标准的样品液 蛋白质含量的下降。即 AB,如图所示：吸光增色反应增强后的标准曲线分光光度计的

16、比色杯清晰不干净，存在蒸馏水的稀释，且稀释的总体效果是使样 品液的含量测定下降 开始实验的试管清洗的不充分，可能存在部分的杂质，导致显色反应的增强。 分光光度计的几个比色杯透明面被碰到， 影响到了液体的吸光度， 吸光度的下降， 使得样品液的测定值偏低。最后，有可能在以后的时间里，可以重新做该实验，从多方面来验证自己的分析。 多和老师同学交流，得到较好的结果3.4 复习思考题参考资料来源：生物化学与分子生物学实验技术王晓华 ，朱文渊 主编1、试述 Folin- 酚试剂法的优点？ 答：根据所学及所查知识，优点总结如下：测定蛋白质灵敏度高，较为准确，可检测最低蛋白质量达 5 g ，通常范围为 ： 20 : 250 g 在生物化学领域应用广泛。操作虽受时间限定， 但是只需加入两种试剂， 即可起作用，总体上说， 操作简单， 原理清晰易懂。 适用性广，除测定蛋白质的含量， 还可特定的适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？答 : 对双缩脲反应有干扰的离子，同样干扰 Lowry 反应，且影响还要大得多。酚类、 柠檬酸、硫酸铵、 Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。原因是： Low