蛋白质含量测定——双缩脲试剂法-试验报告

1、生物化学实验报告姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称蛋白质含量测定双缩脲试剂法实验日期实验地点合作者评分教师签名批改日期指导老师一、实验目的1.1. 掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；1.2. 掌握双缩脲试剂的配制；1.3. 熟悉血清总蛋白的临床意义；1.4. 了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。二、实验原理2.1. 两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（ H2N-OC-NH-CO-NH）2，因分子内含有两 个邻接的肽键，在碱性溶液中可与 Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。2.2. 蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键 （-CO-NH

2、-），同样能在碱性条件下与 Cu2+ 发生双缩脲反应， 生成的紫红色络合物， 且在 540nm处的吸光度与蛋白质的含量在 10 120g/L 范围内有良好的线性关系。三、材料与方法：3.1. 实验材料：3.1.1. 实验试剂：小牛血清； 6.0mol/LNaOH溶液；双缩脲试剂 : 硫酸酮、酒 石酸钾钠、碘化钾；蛋白质标准液（ 70g/L ）； 0.9%NaCl；蒸馏水。3.1.2. 实验器材：试管；烧杯；容量瓶；加样枪；刻度吸管；玻璃棒 ； 1100分光光度计；电子天平；水浴锅3.2. 实验步骤取 3 支试管，做好标记，按下表操作：加入物（ ml）B（空白）S（标准）U（待测）小牛血清（ 1

3、:10 ） - - 0.5蛋白质标准液（ 1:10 ） - 0.50.9%Nacl0.5双缩脲试剂4.0 4.0 4.0a. 各管混匀，观察各试管颜色；b. 将各试管置于 37水浴锅中加热 20min，观察颜色；c. 将试管中的液体倒入比色杯中， 置于 1100分光光度计的样品槽内，在波长 540nm， 以空白管调零，测 S和 U管吸的光度；d. 测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管。血清总蛋白（依据公式算出结果：g/L ） A U 蛋白质标准液浓度（ g/L） AS四、结果与讨论：4.1. 实验现象：选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入 0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清

4、各 0.5ml ，分别命名为 B试管、S 试管和 U试管，再分别向三支试管内加入 4ml 的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状将三支试管放入 37水浴锅中加热 20min，取出后， B试管呈淡蓝色， S试管和 U试管均成浅紫色，且 S 试管的颜色比 U试管的颜色深。（如图一）图二 分光计读数图一 水浴后三支试管颜色4.2. 实验数据测定次数管号0.1850.1840.1850.18470.1520.1510.1520.1517平均吸光度结果计算：代入公式：血清总蛋白（ g/L）=（Au/As）X 蛋白质标准液浓度（ g/L） ，得 出结果：血清总蛋白 =57.493g/L 。4.3. 结果讨论经查

5、阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为 6080g/L ，而小牛血清总蛋白含量比 正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L ，符合情况。4.3.1. 成功原因：本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果： B试管呈淡蓝色， S 试管和 U试管 均成浅紫色，且 S 试管的颜色比 U试管的颜色深。 B试管呈淡蓝色是因为 B试管中没有 发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而 S 试管和 U试管呈浅紫色是因为 试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。吸光度测试后得到的数据， 经计算后得到了预期中的结果， 是因为前面操作严谨。4.3.2. 误差分析三

6、次重复测定过程中出现了一些浮动数据， 可能是因为仪器本身存在的可允许的 误差范围。第一次尝试使用分光光度计的时候得到了负值， 经查明是因为放置在其内的比色 杯将磨面对准了通光面，经调整后，获得了正确的数据。4.4. 课后复习题4.4.1. 什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？ 答：双缩脲试剂是一个用于鉴定蛋白质的分析化学试剂，遇到蛋白质显紫色。它是 一个碱性的含铜试液， 呈蓝色， 由 0.1g/ml 氢氧化钠或氢氧化钾、 0.01g/ml 硫酸铜和酒 石酸钾钠配制。硫酸铜、酒石酸钾钠的碱性溶液中会生成紫红色络合物, 在这种比例的碱性水溶液中，本来形成的 Cu(OH)

7、2会与溶液中多余的 OH-形成 Cu(OH)42- 络离子， 酒石酸钾钠的作用就是保护这种络离子不被析出变为沉淀，向试剂中加入碘化钾 , 可延 长试剂的使用寿命。4.4.2. 试剂配制过程中，为何 NaOH要单独配制，最后加入？答：先单独加入 NaOH溶液是为了营造一个碱性环境 , 在碱性环境下双缩脲试剂 B中 的 Cu2+与蛋白质肽键络合产生颜色反应 . 如果先将双缩脲试剂 A与双缩脲试剂 B 混合, 即 NaOH与 CuSO4溶液混在一起 ,那么就会产生 Cu(OH)2沉淀, 药剂就会失去作用 , 看不到 效果, 也就无法判断是否存在蛋白质 .4.4.3. 简述血清总蛋白测定的临床意义。 答：临床上，当血