蛋白质含量检查方法验证方案

1、方案批准蛋白质含量检查方法验证方案吉林亚泰生物药业股份有限公司2015 年 10 月题目蛋白质含量检查方法验证方案起草人 部门 职务 起草日期审核人 部门 职务 审核日期批准人 部门 职务 批准日期目录1. 目的 42. 范围和责任3. 人员确定44. 引用标准45. 材料 55.1 仪器设备55.2 器材、用具56. 风险因素分析57内容 57.1 检查法验证简述 57.2 验证方法 57.3 验证步骤 58. 偏差 79. 附录 81. 目的在进行常规的蛋白质含量检查之前，需验证在实际检验条件下，检验用物品及操作程序不得对检验方法造成不良影响。本试验是关于对本公司产品的蛋白质含量检查方法的

2、验证，结果应显示：本公司产品的蛋白质含量的 检查方法符合验证要求。2. 范围和责任2.1. 本验证方案适用于吉林亚泰生物药业股份有限公司人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）纯化原液、精制卡介菌多糖核酸检验方法的验证。2.2. 验证委员会：负责验证方案的审批；验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施；验证数据及结果的审核；负责验证报告的审批。2.3. 质量控制部：负责本验证方案、报告的起草与实施，并做好相应的记录；在验证过程中对验证相关 SOP进行确认。2.4. 验证管理部： 负责验证过程中的组织协调， 负责审核验证方案和验证报告，并对验证全过程进行跟踪和督导2.5. 质量保证部 QA ：参与

3、验证实施，协助验证部门对过程中出现的偏差进行处理。2.6. 质量副总：批准验证文件。3. 人员确定确定参与本次验证的人员并要求所有参与人员签名确认小组职务姓名所在部门签字日期组长孙丽萍质量控制部组员张晶质量控制部组员赵磊验证管理部组员范博质量保证部4. 引用标准4.1. 蛋白质含量测定 SOP4.2. 偏差管理 SOP4.3. 中华人民共和国药典 2015 版 第四部5. 材料5.1 仪器设备5.1.1 紫外分光光度计、电子天平5.2器材用具5.2.1. 比色皿、量瓶、刻度吸管、具塞试管6. 风险因素分析评估项目潜在风险风险级别控制措施是否需要确认专属性不能正确检出被测 物。中进行专属性试验

4、证明辅料等基质 成分对待检成分 检出无影响。低重现性不能准确测定出被 测物含量。中进行重复性试 验证明该方法的 精密度可以满足 试验要求。低线性与范围不能准确测定出被 测物含量。中进行线性试验证 明该物质的浓度 与含量成正比例 关系。低7.内容7.1检查法验证简述蛋白质含量测定系采用福林酚法 （Lowry法），蛋白质分子中含有的肽键 在碱性溶液中与 Cu2+螯合形成蛋白质 - 铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色 氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈 正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测

5、定供试品中蛋白质的 含量。7.2 验证方法 严格按照蛋白质含量检验方法，准备人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）纯化原 液样品、精制卡介菌多糖核酸样品各 3 批和试验材料，并依据检验方法的操 作步骤对样品进行多次检验，验证试验结果均应表明试验的专属性、重现性 及线性与范围均能达到试验要求。7.3 验证步骤7.3.1. 文件检查7.3.1.1. 目的：验证所需的参考文件是完整可用的。7.3.1.2. 测试方法：根据资料清单，逐一检查文件的完整性。7.3.1.3. 可接受标准：所有必需的文件必须是可用的和经过批准的。7.3.1.4. 记录：见附录 1。7.3.2. 培训7.3.2.1. 目的：确认参与验证

6、的人员都经过此方案和相关 SOP 的培训。7.3.2.2. 测试方法：检查培训记录。7.3.2.3. 可接受标准： 验证执行前，参与验证的人员已进行此方案和相关 SOP 的培训。7.3.2.4. 记录：见附录 2。7.3.3. 测试用仪器、仪表检查7.3.3.1. 目的：对测试用仪器、仪表进行确认。7.3.3.2. 测试方法：检查仪表参数和设备登记卡。7.3.3.3. 可接受标准：测试用仪器、仪表符合测试要求。7.3.3.4. 记录：见附录 3。7.3.4. 试剂配制7.3.4.1. 碱性铜试液：取氢氧化钠 10g，碳酸钠 50g，加水 400ml 使溶解，作为甲液； 取酒石酸钾 0.5g ，

7、加水 50ml使溶解，另取硫酸铜 0.25g ，加水 30ml使溶解， 将两液混合作为乙液。临用前，合并甲、乙液，并加水至 500ml。7.3.4.2. 标准品溶液的制备取血清白蛋白 （牛）标准品 1支，至50ml量瓶中，加水稀释至刻度， 用刻度吸 管移取 10ml至 25ml量瓶中，加水稀释至刻度， 摇匀。7.3.4.3. 供试品溶液的制备精密量取供试品溶液 1ml 至具塞试管中。7.3.5. 线性关系考察7.3.5.1. 精密量取对照品溶液 0.0ml 、0.2ml 、0.4ml 、0.6ml 、0.8ml 、1.0ml （对照品 溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整），分别置具塞试管

8、中，各加 水至 1.0ml ，再分别加入碱性铜试液 1.0ml ，摇匀，室温放置 10 分钟，各加 入福林酚试液 取福林试液中的贮备液（ 2mol/L 酸浓度） 1 164.0ml ，立即 混匀，室温放置 30分钟，照紫外 - 可见分光光度法，在 650nm的波长处测定 吸光度。7.3.5.2. 可接受标准 蛋白质浓度和其吸光度在在规定范围内呈线性，相关系数（ R2）0.995。7.3.5.3. 记录：见附录 4.7.3.6. 专属性7.3.6.1. 精密量取空白辅料溶液、 供试品溶液与标准蛋白质溶液各 1ml 置玻璃试管中， 再分别加入碱性铜试液 1.0ml ，摇匀，室温放置 10 分钟，各

9、加入福林酚试液 取福林试液中的贮备液（ 2mol/L 酸浓度） 1 164.0ml ，立即混匀，室温放 置 30 分钟，照紫外 - 可见分光光度法，在 650nm的波长处测定吸光度。7.3.6.2. 可接受标准空白辅料溶液对蛋白质含量测定无干扰； 供试品溶液与标准蛋白质溶液在 650nm波长处有吸收峰；7.3.6.3. 记录：见附录 5。7.3.7. 重现性7.3.7.1. 取供试品人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）纯化原液 3 批，取精制卡介菌多糖 核酸 3批，精确称取 0.1g样品用 10ml水稀释，分别精确量取 1.0ml 样品， 再分别加入碱性铜试液 1.0ml ，摇匀，室温放置 10 分钟

10、，各加入福林酚试液 取福林试液中的贮备液（ 2mol/L 酸浓度） 1 164.0ml ，立即混匀，室温放 置 30 分钟，照紫外 - 可见分光光度法，在 650nm的波长处测定吸光度。7.3.7.2. 可接受标准 每批供试品的平行含量测定结果的相对标准偏差应不得过 2.0%。7.3.7.3. 记录：见附录 6。8. 偏差 当该方案的某一部分无法实施或实际情况无法达到可接受标准时，需要进行 偏差报告。当偏差出现时，参考偏差管理 SOP处理，确保所有的偏差得 到评估和有效的解决。验证过程中产生的偏差记录在附录 7。9.附录9.1.附录 1：文件检查确认记录9.2.附录 2：培训记录9.3.附录

11、3：仪器、仪表校验检查记录9.4.附录 4：线性关系检查记录9.5.附录 5：专属性检查9.6.附录 6：人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）纯化原液含量测定记录9.7.附录 7：精制卡介菌多糖核酸含量测定记录9.8.附录 8：验证偏差附录 1 文件检查确认记录资料名称文件编号存放地点是否可接受蛋白质含量测定 SOPJYT-SOP 03-5-1-033质量保证部是 否偏差管理 SOPJYT-SOP 02-7-0-003质量保证部是 否测试的符合性 合格 不合格备注：无 （如没有，打勾）检查人：日期：审核人：日期：附录 2 培训记录培训课题蛋白质含量检查方法验证方案的培训培训目的使被培训人员掌握蛋白质含

12、量检查方法的验证方法和过程培训内容蛋白质含量检查方法的验证方法培训日期： 培训时间： 共 小时培训师： 培训方式： 培训地点：培训人员签到：姓名签字姓名签字姓名签字赵磊张晶范博测试的符合性 合格 不合格备注：无 （如没有，打勾）检查人：日期：审核人：日期：附录 3 仪器、仪表校验检查记录仪器、仪表名称型号设备编号生产厂家是否接受？（Y/N）紫外分光光度计UV-2401PC03A-032日本岛津是 否电子天平FA22403B-164上海舜宇恒平科学仪器 有限公司是 否测试的符合性合格 不合格备注：无 （如没有，打勾）检查人：日期：审核人：日期：附录 4 线性关系检查记录浓度（ g/ml ）408

13、0120160200A值曲线方程相关系数 r 2测试的符合性合格 不合格备注：无（如没有，打勾）检查人：日期：审核人：日期：附录 5 专属性检查记录样品名称在 650nm处 A 值空白辅料溶液人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）纯化原液精制卡介菌多糖核酸标准品溶液测试的符合性合格 不合格备注：无（如没有，打勾）检查人：日期：审核人：日期：附录 6 人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）纯化原液含量测定记录检品名称：人用狂犬病疫苗（地鼠肾细胞）纯化原液检品来源：检品批号：检验日期： 年 月 日报告日期： 年 月 日检验依据：蛋白质含量测定 SOPJYT-SOP 03-5-1-0331. 仪器设备紫外- 可见分光光

14、度计：型号 编号校验有效期至 2. 检验方法： lowry 法2.1. 标准蛋白质溶液的制备：取蛋白质标准品 1 支，用胶头滴管加注射用水定容至 ml 容量瓶中，摇匀，即得标 准蛋白质溶液贮备液。取标准蛋白质溶液贮备液 ml定容至 ml容量瓶中，即为g/ml标准蛋白质溶液。2.2. 供试品溶液的制备：取供试品，加水制成含蛋白质约 200g/ml的溶液，摇匀，即得供试品溶液。再用刻度吸 管精密量取供试品溶液 1ml。2.3. 标准曲线的制备：用刻度吸管精确量取标准蛋白质溶液（ g/ml ）0.2ml 、0.4ml 、0.6ml 、0.8ml 、1.0ml分别置于试管中，用刻度吸管加水补至 1ml

15、。再用刻度吸管准确量取水 1ml，作空白对照。2.4. 测定：取上述溶液，用刻度吸管加入碱性铜试液 1.0ml ，摇匀，室温放置 10 分钟，各加入福林 酚试液取福林试液中的贮备液（ 2mol/L 酸浓度） 1164.0ml ，立即混匀，室温放置 30 分钟，照紫外 - 可见分光光度法，在 650nm的波长处测定吸光度。标准曲线：标准蛋白质溶液 （ g/ml） 650nm A 值直线方程： r=； Y a+bx 结果计算：用直线回归法计算结果。蛋白质含量（ g/ml ）=样品相当于标准溶液体积数稀释倍数 测定结果：稀释倍数 _ _检品批号吸收值含量（g/ml ）平均值（ g/ml ）测试的符合

16、性合格 不合格备注：无（如没有，打勾）检查人：日期：审核人：日期：此表可根据需要复制附录 7 精制卡介菌多糖核酸含量测定记录检品名称：精制卡介菌多糖核酸检品来源：检品批号：检验日期： 年 月 日报告日期： 年 月 日检验依据：蛋白质含量测定 SOPJYT-SOP 03-5-1-0331. 仪器设备电子天平：型号 编号 校验有效期至 紫外-可见分光光度计：型号 编号校验有效期至 2. 检验方法： lowry 法2.1. 标准蛋白质溶液的制备：取蛋白质标准品 1 支，用胶头滴管加注射用水定容至ml 容量瓶中，摇匀，即得标准蛋白质溶液贮备液。取标准蛋白质溶液贮备液 ml定容至 ml容量瓶中，即为g/

17、ml标准蛋白质溶液。2.2. 供试品溶液的制备：用精度为 0.0001g的电子天平精密称取本品约 0.1000g置 10ml 量瓶中，用胶头滴管加适量 水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。再用刻度吸管精密量取供试品溶液1ml。2.3. 标准曲线的制备：用刻度吸管精确量取标准蛋白质溶液（ g/ml ）0.2ml 、0.4ml 、0.6ml 、0.8ml 、1.0ml分别置于试管中，用刻度吸管加水补至 1ml。再用刻度吸管准确量取水 1ml，作空白对照。2.4. 测定：取上述溶液，用刻度吸管加入碱性铜试液 1.0ml ，摇匀，室温放置 10 分钟，各加入福林 酚试液取福林试液中的贮备液（ 2mol/L 酸浓度） 1164.0ml ，立即混匀，室温放置 30 分钟，照紫外 - 可见分光光度法，在 650nm的波长处测定吸光度。标准曲线： 标准蛋白质溶液 （ g/ml） 650nm A 值直线方程： r=； Y