毕业论文生物催化法生产R扁桃酸及其年产500吨规模的工厂工艺设计24038

1、硕士学位论文 论文题目：论文题目：生物催化法生产生物催化法生产 r-扁桃酸及其年产扁桃酸及其年产 500 吨吨 规模的工厂工艺设计规模的工厂工艺设计 作者姓名作者姓名 沈祝飞沈祝飞 指导教师指导教师 郑裕国教授郑裕国教授 薛亚平副教授薛亚平副教授 学科专业学科专业 生物工程生物工程 所在学院所在学院 生环学院生环学院 提交日期提交日期 2013 年 5 月 biocatalytic synthesis of r-mandelic acid and process design of 500 t/a scale submitted to zhejiang university of techno

2、logy for master degree written by shen zhufei majoring in biological engineering supervised by professor zheng yuguo college of biological and environmental engineering of zhejiang university of technology may, 2013 目目 录录 摘 要.i abstract.iii 第一章 文献综述.1 1.1 简介.1 1.2 r-ma 的工业合成方法.2 1.3 生物催化法合成 r-ma .6

3、1.3.1 脂肪酶法生物催化合成 r-ma .6 1.3.2 氧化还原酶催化合成 r-ma .7 1.3.3 腈水解酶催化合成 r-ma .8 1.4 腈水解酶研究概况.9 1.5 生物制药过程放大研究进展.12 1.5.1 生物制药工艺设计.12 1.5.2 生物工程优化与放大.12 1.5.3 生物反应器设计.14 1.6 本论文的研究目的与内容.15 第二章 生物催化法生产 r-ma 小试试验工艺研究.16 2.1 发酵产酶工段工艺.17 2.1.1 材料和方法.17 2.1.1.1 菌株.17 2.1.1.2 培养基.17 2.1.1.3 菌种培养条件.18 2.1.1.4 生物量测定

4、.18 2.1.1.5 腈水解酶活力测定.19 2.1.2 诱导剂的选择.19 2.1.3 发酵温度优化.20 2.1.4 最优条件下 5l 发酵罐中培养.21 2.1.5 ph 连续调控对产酶的影响.22 2.1.6 补加甘油对产酶的影响.23 2.1.7 小结.24 2.2 不对称水解工段工艺.25 2.2.1 材料与方法.25 2.2.1.1 酶催化剂.25 2.2.1.2 静息细胞制备.25 2.2.1.3 主要试剂.25 2.2.1.4 腈水解酶活力测定.25 2.2.1.5 hplc 分析方法.26 2.2.1.6 薄层色谱层析(tlc) .26 2.2.2 ph 对腈水解酶活性的

5、影响.26 2.2.3 温度对酶活性的影响.27 2.2.4 不同底物浓度对腈水解酶活性的影响.29 2.2.5 金属离子对转化反应的影响.30 2.2.6 助溶剂对催化反应的影响.32 2.2.7 分批补料催化生产 r-ma .33 2.2.8 小结.34 2.3 分离纯化工段工艺.35 第三章 生物催化法生产 r-ma 工艺放大研究.38 3.1 产腈水解酶发酵罐放大工艺研究.38 3.2 3l 催化体系与 100 ml 体系反应结果比较.41 3.3 小试工艺路线修正.42 3.3.1 发酵液中催化反应的研究.43 3.3.2 离子交换层析分离纯化 r-ma .43 3.4 本章小节.4

6、4 第四章 年产 500t r-ma 的工艺设计.46 4.1 概论.46 4.1.1 设计任务.46 4.1.2 设计的技术依据.46 4.1.3 设计原则.46 4.1.4 工艺流程.46 4.2 发酵工段工艺.47 4.2.1 操作流程.48 4.2.2 灭菌操作.48 4.2.3 操作要点.49 4.3 物料衡算.49 4.3.1 生产规模.49 4.3.1.1 生产批量.49 4.3.1.2 各阶段产量.49 4.3.1.3 种子罐公称体积.50 4.3.1.4 罐参数汇总.50 4.3.2 发酵罐进出物料衡算.50 4.3.2.1 发酵培养基原料计算.50 4.3.2.2 发酵罐进

7、出物料.51 4.3.2.3 发酵罐设计.52 4.3.2.4 发酵罐物料平衡图.54 4.3.2.5 发酵罐示意图.56 4.3.3 不对称水解工段物料平衡.56 4.3.4 离子交换树脂 hz 202 计算.57 4.3.5 制备 r-ma 总物料衡算.57 4.4 能耗分析.58 4.4.1 蒸汽耗量分析.58 4.4.1.1 发酵空消与实消.58 4.4.1.2 干燥工段.58 4.4.1.3 蒸发结晶精提取工段.59 4.4.2 冷却水耗量分析.59 4.4.2.1 发酵工段.59 4.4.2.2 双效浓缩器浓缩工段.59 4.5 经济效益分析.60 4.5.1 年经营费用计算.60

8、 4.5.1.1 折旧费和大修费.60 4.5.1.2 原材料、燃料消耗费用.60 4.5.2 利润、利润率、投资回收期计算.61 4.5.2.1 利润.61 4.5.2.2 利润率.61 4.5.2.3 投资回收期.61 4.5.3 生产盈亏平衡点.61 4.6 车间布置.61 4.6.1 车间区域和工艺设备布置原则.61 4.6.2 工艺过程工序划分.62 4.6.3 车间区域布置及其环境设计等级确定.62 4.7 “三废” 处理.62 第五章 结语.64 参考文献.65 附录一：工艺流程图.69 附录二：发酵罐示意图.70 附录三：车间布置平面图.71 致 谢.73 生物催化法生产 r-

9、扁桃酸及其年产 500 吨规模 的工厂工艺设计 摘 要 r-扁桃酸是一种重要的精细化工中间体和手性药物前体，被广 泛应用于制药与化工行业。生物催化法合成手性药物具有条件温和、 催化效率高以及高度选择性等优点，并且无污染和能耗低，是一种 环境友好型的绿色合成方法。腈水解酶作为生物催化法制备 r-扁桃 酸的一种重要工业酶，得到了广泛关注。 本文以腈水解酶产生菌重组 e.coli q196s 为研究对象，优化了 重组腈水解酶的制备工艺，开发了 ph 连续调控工艺和甘油补加工 艺，并在 30 l 发酵罐中经放大验证，产酶水平可提高至 24991 u/l。研究了静息细胞不对称水解扁桃腈的转化条件，以及分

10、批补料 操作生产高浓度的 r-扁桃酸，确定了最优催化工艺条件：菌体浓度 50 g/l，加入 1 mm 的 ba2+和 1%(v/v)异辛醇作为助溶剂，最适底物 浓度 64 mm，ph 7.5，反应温度 45c。经过 9.5 h 的转化时间后，r- 扁桃酸的积累浓度可达到 587 mm，e.e.值 99%。本文还进一步研究 了反应混合液中 r-扁桃酸的分离纯化工艺，在不影响 e.e.值的前提 下得到了高纯度的 r-扁桃酸。 在小试研究基础上，本文经过中试工艺优化及修正，确定了工 艺放大法则采用体积溶氧系数 kla=常数，以及在分离纯化工段使用 离子交换层析代替萃取操作。通过工艺流程设计、物料衡算

11、、能量 衡算、车间布置设计、 “三废处理”及综合利用等内容的设计，完成 了年产 500 吨纯度 99%的 r-扁桃酸工厂工艺设计。 关键词 生物催化，腈水解酶，r-扁桃酸，工艺设计 biocatalytic synthesis of r-mandelic acid and process design of 500 t/a scale abstract r-mandelic acid is the important fine chemical intermediates and chiral prodrug with broad uses in pharmaceutical and chem

12、ical industry. synthetizing chiral drug with biological catalysis method has many advantages, such as mild conditions, high efficiency and high stereoselectivity, etc. in addition, it is non-pollution and low energy consumption, which is an environment friendly green synthesis method. as nitrilases

13、are important industrial enzymes that convert mandelonitrile directly into the r-mandelic acid, they receive extensive attention. this dissertation is devoted to the comprehensive understanding of the fermentation fundamental of nitrilase in the recombinant e.coli q196s, optimizing the preparation t

14、echnics of recombinant nitrilase and developing a novel technology of continuous regulating ph and glycerol fed-batch fermentation. subseguently, the optimum process was verified in 30-l fermenter, and the production of nitrilase was 24991 u/l. the paper investigated the bioconversion conditions of

15、mandelonitrile to r- mandelic acid with resting cells and preparation of r-mandelic acid at high accumulative concentration with fed-batch. the optimal catalysis conditions are as follows: 50 g/l resting cells, 1 mm ba2+, 1%(v/v) isooctanol as co-solvent, substrate 64 mm, ph 7.5 and 45c. after conti

16、nuous reaction for 9.5 h，acquired 587 mm r-mandelic acid and the e.e. value was 99%. afterwards, the separation and purification of r- mandelic acid from the reaction mixture were studied. based on lab experiment, the process conditions were investigated by magnified test and design of industrial pr

17、oduction. after the process revised, kla was the scale-up principle and extraction was replaced by ion exchange chromatography. to obtain process workshop of 500 tons r-mandelic acid per year, several contents, such as process design, material calculation, energy calculation, workshop layout design,

18、 “three wastes” treatment and comprehensive utilization were systematically investigated and designed. key words: biocatalysis, nitrilase, r-mandelic acid, process design 第一章 文献综述 1.1 简介 单一构型手性药物已成为当前国内外新药开发和研究的关注重点，手性技 术在新药研制中逐渐开始受到重视。手性药物在国内外上市销售的药物总数中 所占比例正逐年上升，2005 年全球范围内上市的新药已经有 60%是单一构型药 物1。据报

19、道，手性药物 2000 年销售增长率超过 13%，达到 1330 亿美元， 2008 年销售额已达 2000 亿美元2。自从欧洲爆发的“反应停”惨剧后，人们开 始逐渐意识到消旋药物中的两个对映异构体在人体中的药理毒性、代谢过程以 及药理活性都存在着极大的差异3。所以，美国食品及药物管理局 fda 规定， 使用消旋体申报的新药，需要提供关于消旋体和各对映异构体分别实施的毒理 和药理实验报告，否则会被鉴定为药物中含有 50%的杂质而不予批准，还规定 包含手性分子药物必须以单一对映异构体形式申报。由于存在着巨大的利润还 有市场需求，全球各大制药企业纷纷将工作重点投入到手性药物的研究开发， 掀起了一阵

20、手性药物开发的热潮。 扁桃酸(mandelic acid，ma)又称作苦杏仁酸、苯乙醇酸或 -羟基苯乙酸， 两种对映异构体结构如图 1-1。光学纯 r-扁桃酸(r-ma)是一种重要的精细化工 中间体和手性药物前体4，广泛应用于多种光学活性药物的合成，如头孢菌素 和半合成青霉素等抗生素5, 6、抗肿瘤药物7, 8、减肥药物9、农药10及其他药 物11, 12。以 r-邻氯扁桃酸为中间体的抗血小板聚集药物氯吡格雷居全球最畅销 药品排行榜第二位13，对氯扁桃酸是新型卵菌纲病害杀菌剂双炔酰菌胺的原料 物质14。r-ma 还是重要的手性拆分剂和手性催化剂，而且还能用于测定手性 物质的绝对构型及光学纯度等

21、等。r-ma 被称为“万能”拆分剂15，其对醇胺 类药物的拆分效果优秀16，如止咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物，并且 以 r-ma 为催化剂可将芳香族及脂肪族醛均不对称转化成为相应手性醇17, 18。 hoh oh o r- 乙 乙 乙 oh o hoh s- 乙 乙 乙 图 1-1 s-扁桃酸和 r-扁桃酸结构式 科学家们正在不断开发 r-ma 的新用途，r-ma 的市场需求与此同时也在 日益扩大。据统计，国际上已有部分公司有能力合成光学纯 ma19，主要公司 有日东化学公司、日本山川药品公司以及德国瓦克公司等，但仍然不能满足市 场需求。目前，国内也已经有部分企业能够生产光学纯的扁桃酸，

22、但还没有出 现规模化生产单一构型的报道。因此，加大力度对单一构型扁桃酸的研究开发， 打破国外企业对手性 r-ma 的市场垄断，并寻找出适合我国的工业化生产方法 意义重大。与此同时，研究出新的生产工艺用于 r-ma 和其他手性药物的工业 生产，不仅对满足我国光学活性药物产品市场的需要具有实际意义，而且对解 决手性技术领域所存在的多种问题也具有重大的理论指导意义。 1.2 r-ma 的工业合成方法 最早产生也是国内目前仍在采用的 r-ma 合成方法是先合成外消旋的 ma，然后通过不对称拆分方法得到光学活性的 r-ma。外消旋 ma 的主要合成 路线有三种20，分别是 (1) 以苯甲醛为原料： ch

23、o c h so3na oh nahso3 c h so3na oh nacnc h oh cnna2so3 chcn oh h2ohcl chcooh oh nh4cl (2) 以苯为原料： c o h coohc h oh cooh (3) 以苯乙酮为原料： c o ch3 h ch3cooh , cl2 c o chcl2 c o chcl2 3naoh c h oh coona c h oh coona hcl c h oh cooh 其中，以苯法合成外消旋 ma 水污染严重，三废量大，而且成本较高；以 苯甲醛为原料合成 ma 使用剧毒物氰化钠，而且工艺路线长，投资费用高；以 苯乙酮为

24、原料合成 ma 三废排放量小，工艺路线短，投资省，生产容易控制， 其工艺流程图如图 1-2。 活性炭 成品 苯乙酮氯化水解酸化 回收醚蒸馏 萃取醚 脱色苯热过滤冷却结晶过滤 干燥 回收苯 滤饼(废渣) 母液 盐酸naoh 碎冰 cl2 活性炭 成品 苯乙酮氯化水解酸化 回收醚蒸馏 萃取醚 脱色苯热过滤冷却结晶过滤 干燥 回收苯 滤饼(废渣) 母液 盐酸naoh 碎冰 苯乙酮氯化水解酸化 回收醚蒸馏 萃取醚 脱色苯热过滤冷却结晶过滤 干燥 回收苯 滤饼(废渣) 母液 盐酸naoh 碎冰 cl2 图 1-2 以苯乙酮为原料合成 ma 的工艺流程图21 外消旋 ma 的主要拆分方法有非对映体盐结晶拆

25、分法、色谱拆分法、萃取 拆分法、电泳拆分法和酶催化拆分法。目前工业上应用最广泛的拆分技术还是 非对映体盐结晶拆分法。使用盐结晶法拆分消旋 ma 的拆分剂主要包括生物碱 (辛可宁、吗啡、麻黄碱、士的宁)、手性胺(l-苯乙胺、2-氨基-1-丁醇等)、氨基 酸及其衍生物等。其中生物碱和 2-氨基-1-丁醇拆分效果较好，r-ma 收率可以 达到 75%85%22, 23。在 20 世纪 70 年代时，美国 cyanamid 公司就开始使用(-)- 2-胺基-1-丁醇对消旋 ma 进行拆分，并且对副产物进行了消旋，效果良好24。 另外，美国 kay fries 公司开发了 d-苯甘氨酸丁酯及其盐酸盐作为

26、拆分试剂， 对消旋 ma 进行拆分的技术，但是只得到了一种 ma 的对映异构体25。在此基 础上，臧健等人同样使用 d-苯甘氨酸丁酯及其盐酸盐作为拆分剂，在水反应体 系中制得 r-ma 收率 98.9%，光学纯度 32%；s-ma 收率 90.1%，光学纯度 66.7%26, 27。l-丙氨酸和 l-苯乙胺是当前工业生产手性 ma 的主要拆分剂，采 用 l-丙氨酸拆分一次，重结晶两次可获得 r-ma 收率 98%以上28；以 l-苯乙 胺为拆分剂，重结晶两次后 r-ma 总收率 29.6%，光学纯度 99.5%。后来， eeloc 等人通过比较二元相图，发现(s)-甲基苯乙胺更加适合作为 ma

27、 的拆分 剂29。 色谱拆分法也是较常用的 ma 手性拆分方法，所使用的色谱体系以 hplc 为主。环糊精(-cd)是色谱法所使用的主要手性拆分剂，后来经过各种修饰 - cd 作为固定相的拆分效果有了较大改进。阮源萍等人采用自制的 2,6-二-o-戊 基-环糊精涂渍 symmetry c8 色谱柱，以反相 hplc 模式研究了消旋 ma 的色 谱拆分，分离条件也得到了优化30。研究结果表明，采用优化后的 0.5%三乙胺 -甲醇-乙酸缓冲液或者水-甲醇流动相，ma 的对映异构体能够达到甚至接近基 线分离。色谱拆分法的拆分纯度最高，具有良好的稳定性、选择性以及容量， 但是这种方法消耗和设备费用都太

28、大，成本高，不适合工业规模化生产。近几 年，kaspereit 等人提出了模拟流动床色谱(smb)概念，节约了投资和操作成本 31。smb 打破单一色谱柱分批处理方式，形成连续处理，极大程度地提高了生 产力。malte 等人进一步采用 smb 和选择性结晶相混合的方法，对消旋 ma 进 行拆分，放弃了原本仅有一个操作单元的拆分体系，形成了更多的单元，从而 达到降低成本，提高效率的目的32。 手性萃取拆分法是近几年才提出的手性分离方法，具有相当大的潜力，该 方法的基本原理是：依靠两种对映异构体与手性选择体生成两种非对映异构体 的自由能差，从而将外消旋体分离，若是在足够多的级数下，可实现对映异构

29、体的高纯度分离。唐课文等人研究了以疏水性 l-酒石酸酯作为手性选择体，r- ma 和 s-ma 在水-有机溶剂两相体系，以及以 n-n-十二烷基-l-羟基脯氨酸作 为手性选择体，在含有 n-n-十二烷基-l-羟基脯氨酸手性配体(li)和 cu2+两相体 系中的分配行为33, 34。色谱拆分法虽然潜力很大，但是因为是新方法，所以技 术上并不成熟，有待进一步完善与发展。 毛细管电泳(ce)是一种电迁移技术，由于具有经济、快速、高效等特点， 广泛应用于各种药物对映体的分离。扁桃酸的毛细管电泳拆分,主要有亲和毛细 管电泳(aze)、毛细管电色谱(cec)和毛细管区带电泳(cze)3 种。ce 的原理是

30、 加入手性选择剂与对映体分别结合，根据选择剂和对映体结合的稳定常数差异 进行分离。邱彬等人以羟丙基 -cd 作为手性选择体，tris-h3po4为缓冲溶液， 用 ce 法拆分消旋 ma，得到 r-ma 平均回收率 97.8%，分离度 1.59；s-ma 平 均回收率 101.5%，分离度为 1.6835。毛细管电色谱(cec)是 hplc 和 ce 相结 合的新型液相色谱分离技术，它继承了 hplc 的高选择性和毛细管电泳的高效 率，同时还能有效分离毛细管电泳法不能分离的某些物质。能够应用于 cec 法 的手性选择剂有很多，其中最好的一种是糖肽类抗生素(gas)。salvatore 等人把 大

31、环抗生素 mdl 63,246(hepta-tyr)作为手性固定相，采用反相 hplc 的 cec 法成功对消旋 ma 进行了拆分36。 酶催化拆分法属于动力学拆分方法，该方法的原理是利用酶对特定光学异 构体的专一性，催化某一对映异构体优先反应，再利用物理化学性质差异实现 对映异构体的分离。ganapati 等人在非水介质中，以脂肪酶为催化剂，对 ma 的对映体进行手性分离，认为 candida 的脂肪酶 novozym 435 作为催化剂具有 良好的效果，r-ma 的光学纯度 78%，转化率 19%37。近几年，许多新技术被 用于改进酶催化拆分方法。微生物表面展示技术应用于外消旋有机酸的拆分

32、， 将 pseudomonas fluorescens 脂肪酶展示于 escherichia coli 细胞表面，制作的整 细胞生物催化剂，在拆分消旋 ma 时具有更好的活性和选择性，并在 120 h 重 复 10 次实验均能保持活性38。通过可控制的固定相和介质工程技术，可以调 整脂肪酶的对映异构体选择性39。eiji 等人混合了 pseudomonas 降解 s-ma 制 备 r-ma 体系，以及用 micrococcus propionibacterium freudenreichii 催化苯甲酰 甲酸不对称转化为 r-ma 体系，优化了拆分过程，r-ma 的最终收率达到 60%，化学纯

33、度 90.0%、光学纯度 99.0%40。酶催化拆分法立体选择性强，反 应条件温和，污染少，但是如何提取出活性单一的对映异构体，选育高效、专 一的微生物菌种，提高酶自身稳定性，都是目前亟待解决的问题。 宋航等41人发明了一种 r-ma 工业化连续制备方法。采用光学纯的 d-苯甘 氨酸正丁酯(拆分剂)与外消旋 ma 反应生成两种非对映异构体的盐，然后利用 两对非对映异构体盐在拆分剂和重结晶溶剂中的溶解度差异将它们分离，再通 过重结晶操作将非对映体盐提纯，通过酸化、萃取、蒸发得到 r-ma，将拆分 后的过滤液蒸干用水溶解，酸化、萃取、蒸发得到 s-ma；再将重结晶液浓缩， 加入一定量的外消旋 ma

34、 于浓缩液中进行拆分，水相中的拆分剂通过加入碱液 回收，实现了拆分剂的回收利用。再将光学纯度在 60%70%的 s-ma 通过 l- 苯甘氨酸正丁酯进行拆分，并依照类似方法实现 s-ma 的拆分和拆分剂的回收 利用，最终获得的 r-ma 和 s-ma 光学纯度均在 99%以上。 1.3 生物催化法合成 r-ma 由于生物酶对底物有高度的立体选择性，不仅包括化学选择性和非对映异 构体选择性，还具有严格的区域选择性和对映异构体选择性，可直接将化学合 成的外消旋衍生物、潜手性化合物或前体转化成单一对映异构体的光学活性产 物。生物催化的手性反应还具有效率高、反应条件温和、反应步骤少、产品光 学纯度高等

35、优点，并且生物催化过程能耗低、无毒、无污染，符合 21 世纪“绿 色化学”的要求，被认为是手性药物生产取得突破的关键技术。总结国内外文 献报道，主要通过 3 种酶催化反应合成 r-ma：利用脂肪酶分解扁桃酸甲(乙)酯 制备 r-ma；利用氧化还原酶体系催化制备 r-ma；依赖于腈水解酶，以外消 旋的扁桃腈为底物，制备光学纯 r-ma。 1.3.1 脂肪酶法生物催化合成 r-ma 脂肪酶法以消旋扁桃酸甲(乙)酯为底物，利用脂肪酶优先反应生成 r-ma 这一特点，以控制在反应初期生产具有较高对映过量值(e.e.值)的 r-ma，反应 过程如图 1-3。 ch ho cooch2ch3 h2o li

36、pase ch ho cooh ch ho cooh ch3ch2oh r,s-乙 乙 乙 乙 乙 r-乙 乙 乙s-乙 乙 乙 图 1-3 扁桃酸乙酯转化生成 r-ma42 yadav 等对脂肪酶在非水相介质中催化水解外消旋扁桃酸甲酯制备 r-ma 进行了研究。用离子交换树脂 ira 400 作为催化剂通过酯化作用将外消旋的 ma 与甲醇混合制备外消旋扁桃酸甲酯，再分离得到 r-ma。用 novozym 435 脂肪酶特异性水解 24h 后，光学纯度达 78%，转化率 19%37。高静等在非水体 系中对脂肪酶催化水解扁桃酸乙酯外消旋混合物拆分 r-ma 进行了初步研究。 筛选出脂肪酶 n43

37、5 作为催化剂，叔丁醇作为溶剂，r-扁桃酸乙酯的转化率 41.6%，e.e.值 84%43。随后王垚等对脂肪酶在离子液体中不对称水解扁桃酸乙 酯制备 r-ma 进行了研究，发现脂肪酶 novozym 435 在离子液体bmmbr 中 的活性和立体选择性最高。与在叔丁醇介质中拆分相比，e.e.值有所降低但产率 大幅上升，并且反应时间缩短了 1/4，由于离子液体的循环使用，这种方法更加 符合可持续发展的战略目标44。在最适条件下反应 6 h，产物 r-ma 的 e.e.值可 达 58.78%，产率 65.23%。脂肪酶在对外消旋底物进行对映体选择性水解的时 候，未参加反应的对映体往往会保留，必须对

38、其进行消旋化作用，这样才能从 根本上提高单一异构体的 e.e.值。 1.3.2 氧化还原酶催化合成 r-ma 苯乙酮酸已成为一种廉价、广泛使用的化工原料，对其直接进行不对称还 原，制备高光学纯度的 r-ma，将减少一步酶促反应45。李忠琴等以苯乙酮酸 为底物，筛选出的酵母菌突变株 s.c1-ma16 为催化剂，合成的 r-ma 收率达 99%，e.e.值 99.8%46。黄亚燕等考察了酵母菌株 fd11b，不对称还原苯乙酮酸， 生产 r-ma 的重复使用性能。在持续 6 批次的还原反应中，一直保持着较高的 催化活性，并且 e.e.值均高于 96.5%。最优条件下 30 l 发酵罐，进行分批放大

39、 实验，反应时间 49 h，产物 r-ma 收率达 96.1%，e.e.值 98.5%47。随着游离细 胞转化苯乙酮酸制备 r-ma 的深入研究，也由于固定化细胞有利于操作，储藏 稳定性好等优越性，研究者开始使用固定化酵母细胞，为了增加菌体的稳定性 和利用率。li 等研究了壳聚糖包埋啤酒酵母将苯乙酮酸生物不对称还原为 r- ma，并研究了固定化条件及特性48。xiao 等研究了使用海藻酸钠固定化 saccharomyces cerevisiae fd11b，生物转化苯乙酮酸制备 r-ma 的动力学特征， 建立了有关还原动力学和内扩散的数学模型，分析胞内传递传质的影响49。建 立动力学模型能更好

40、的分析固定化细胞转化，并对其提供理论依据。 1.3.3 腈水解酶催化合成 r-ma 腈水解酶是一类可以将腈转化成相应酸的酶，当以扁桃腈为底物时，腈水 解酶不对称水解成 r-ma，并且它的理论动力学反应产物收率是 100%，本设计 采用的就是腈水解酶法生物催化合成 r-ma。国内许建和团队以乙腈为唯一氮 源，从土壤中筛选获得了一株腈水解酶菌株，并命名为 ecu0401。研究发现 ecu0401 所产生的腈水解酶能有效地催化消旋扁桃腈不对称水解为 r-ma，其 最适 ph 6.5，反应温度 30c，经过 12 h 的催化反应，r-ma 的收率为 41.5%，e.e.值超过 99.9%50。path

41、ak 等还发现大麦、卷心菜、萝卜等多种植物 中富含腈水解酶，这大大扩展了腈水解酶的来源。 提高腈水解酶稳定性，并对其进行回收利用，可以极大地降低生产成本。 kaul 等发现海藻酸盐固定化细胞效果最好，静息细胞只能重复利用 9 次，而海 藻酸盐固定化后的细胞可反复利用 35 次，仍具有 88%的转化活性，e.e.值保持 97%51。近年来快速发展起来的遗传学和基因工程也为进一步高效利用腈水解 酶提供了可行性条件和理论基础。desantis 等建立了一个腈水解酶库，首先从 腈水解酶库中筛选得到有效水解扁桃腈合成 r-ma 的对象，然后对其中产量较 高的腈水解酶进行深入研究，催化反应 3 h 后产率

42、 86%，e.e.值 98%。rey 等则 对由 alcaligenes faecalis atcc 8750 中提取到的腈水解酶进行基因修饰和固定 化发现，该固定化腈水解酶能高效选择性水解消旋扁桃腈生成 r-ma，ph 8.5 时收率和 e.e.值均可高达 99%52。因此，结合固定化和基因重组技术制备 r- ma 应用前景广阔。 banerjee 等将 p.putida 中的腈水解酶基因克隆至 pet 21b(+)，并作为组氨 酸标记蛋白在 e.coli 中过量表达。通过 iptg 诱导 e.coli bl21 细胞，从粗细胞 提取物中纯化得到组氨酸标记蛋白。具有高腈水解酶活性的重组 e.

43、coli 被用于 不对称水解外消旋扁桃腈合成 r-ma。由于催化反应过程中扁桃腈会自发降解 为 hcn 和苯甲醛，伴随着 r-ma 和 nh3的生成，反应液中的扁桃腈浓度不断 降低。反应结束后，单位体积产量(单位体积反应液每小时生成的 r-ma 质量) 为 1.14 g/l/h，催化产量(每克催化剂生成 r-ma 的质量)为 1.36 g/g，与原始菌 株相比均有较大提高。本实验室从土壤中筛选出了一株产腈水解酶菌种，经过 诱变育种技术，得到遗传稳定的高活性菌株 alcaligenes faecalis zjutb10，成功 开发了腈水解酶生物催化制备 r-ma 的工艺，并已在企业完成了生产中试

44、阶段。 目前，腈水解酶作为生物催化剂不对称水解扁桃腈制备 r-ma 的工艺过程如图 1-4。 菌体发酵 制备腈水解酶 细胞固定化 固定化 细胞 扁桃腈水解 静息 细胞 扁桃腈水 催化剂分离脱色 浓缩 r-ma 产品 菌体发酵 制备腈水解酶 细胞固定化 固定化 细胞 扁桃腈水解 静息 细胞 扁桃腈水 催化剂分离脱色 浓缩 r-ma 产品 图 1-4 腈水解酶催化生产 r-ma 工艺过程 1.4 腈水解酶研究概况 腈水解酶最早是由 thman 和 mahadevan 于 1964 年从大麦叶中分离出来， 能够将吲哚乙腈水解成为吲哚乙酸，所以将该酶命名为吲哚乙腈水解酶。但是 在往后的研究中发现，这种

45、纯酶对 26 种不同的腈化合物均具有活性，它的最适 水解底物不是吲哚乙腈，而是 3-氰基吡啶，水解 3-氰基吡啶的酶活是吲哚乙腈 的 8 倍。因此，thman 和 mahadevan 将其命名为腈水解酶(nitrilase,ec 3.5.5.1)。 近年来有学者在拟南芥 ( a.thaliana ) 中分离出四种腈水解酶，包括有 nit1、nit2、nit3、nit4。前三种腈水解酶能将 3-吲哚乙腈转化成 3-吲哚乙 酸，而 nit4 只对 -氰基-l-丙氨酸有催化能力53。根据底物特异性，腈水解酶 普遍被分成三大类：(1)芳香类腈水解酶，主要水解芳香腈，如某些真菌酶和 rhodococcu

46、s rhodochrous j1；(2)脂肪类腈水解酶，主要水解脂肪族的氰基，如 acidovorax faecalis 72w 和 r.rhodohrous k22 菌株产生的腈水解酶；(3)芳基乙腈 水解酶，主要水解芳基乙腈类物质。表 1-1 显示的是来自于不同微生物的腈水 解酶性质比较。 表表 1-1 不同微生物腈水解酶比较不同微生物腈水解酶比较 source molecular mass (kda) optimal ph optimal temperature (c) reference alcaligenes faecalis atcc8750 4607.5404554 alcali

47、genes faecalis jm3 2757.54555 aspergillus niger k10 6508.04556 alcaligenes sp. ecu0401 3768.0404557 bradyrhizobium japonicum usda110 3407.08.04558 fusarium solani o1 5808.0404559 pseudomonas fl uorescens pf-5 1387.04560 pseudomonas putida 4127.04051 根据氨基酸的同源性，腈水解酶属于蛋白超家族，同时也称为腈水解酶超 家族。腈水解酶超家族中的酶都含有一

48、个特定的空间结构，蛋白结构单元由一 个 - 的三明治结构组成53。腈水解酶的这种结构已经通过 x-ray 衍射技术 得到确认，并且其空间结构也通过与超家族内其他成员的同源性比较而推导出 61。腈水解酶的反应机理如图 1-5 所示，腈水解酶的半胱氨酸残基上的巯基具 有很强的亲核性，使整个过程类似于一般化学反应中碱催化下的氰基水解62。 腈水解酶的活性部位不含有金属离子，绝大多数金属离子及金属离子螯合剂， 比如 edta、重氮基和氰基等对酶活力都没有明显抑制作用，但是能与巯基反 应的金属离子，如 ag+和 hg+等却对腈水解酶有较强的抑制作用。由此可知， 腈水解酶半胱氨酸上的巯基在催化水解反应过程

49、中起着关键性作用。brenner 等 将腈水解酶超家族分为 13 个分支，并发现在果蝇及蠕虫中的组氨酸三联体(fhit)， 和腈水解酶(nit)形成融合蛋白共同编码63。实验检测 8 只小鼠，其中有 7 只的 nit 和 fhit mrna 积聚水平相同，由此推测 fhit 的接头分子可能是 nit。根据蠕 虫 nit fhit 晶体结构分析，其活性部位含有 glu-lys-cys 残基，brenner 等人推 测整个腈水解酶大家族的催化活力是由 glu-lys-cys 催化单元主导，glu-lys- cys 三联体残基的结构如图 1-662, 64。 腈水解酶反应的高效性还有温和性，使得其具

50、有重要的工业应用价值，而 且在工业生产上应用成功的例子已有较多报道。例如，lonza 公司筛选出新的 菌株用于 5-羟基-吡嗪-2-甲酸及 5-羟基-吡啶-2-甲酸的生产，利用烟酸羟基化酶 和腈水解酶的协同作用，转化率接近 100%，明显优于传统化学法。杜邦公司利 用 acidovorax facilis 72w 腈水解酶，开发了催化 2-甲基戊二腈制备 1,5-二甲基- 2-哌啶酮的工业化生产过程。 rcn enzsh rc nh senz h2o nh4 rc o senz rc o oh h2o senz 图 1-5 腈水解酶催化反应机理62 图 1-6 腈水解酶超家族三联体结构62 1

51、.5 生物制药过程放大研究进展 1.5.1 生物制药工艺设计 生物药物是世界各国医药产业重点发展的方向，生物制药在制药行业中占 据着重要地位。生物制药工厂工艺设计是生物制药企业基本建设的关键一步， 必将发挥越来越重要的作用。生物制药工厂工艺设计，不仅要具有一般制药工 厂工艺设计知识，如生产工艺流程设计、工艺设备布置设计、管道设计以及制 药过程原料和设备、药物制剂生产工艺、药品生产质量管理规范、化学工程、 药物分离与纯化技术等，而且还要具有生物制药工厂工艺设计的专门知识65。 生物制药工厂工艺设计是一门综合应用型学科，在具体进行生物制药工厂工艺 设计时必须遵循相关国家规范、规定和标准，做到技术上

52、先进，经济上合理。 生物制药工厂工艺设计的要求有： (1) 随着科学技术的发展，生物制药工厂已逐步实现现代化生产，在产品 结构、工艺技术、生产装置、基础理论研究等方面都有较大突破。因此，在进 行生物制药工厂工艺设计时，应反映科学技术的进步，采用先进的工艺技术和 装置。 (2) 设计工作必须认真进行调查研究，加强技术经济的分析工作，设计的 技术经济指标以达到或超过国内同类型工厂生产实际平均先进水平为宜。 (3) 生物制药工厂工艺设计是系统工程，涉及相关的规范、规定等，在应 用时，要给予正确的体现。尤其是要遵循可持续发展的原则，严格执行药品 生产质量管理规范和标准工艺操作规程来指导设计。 (4)

53、生物制药工厂工艺设计要求设计人员应具备一定的工程实践经验和理 论知识，要经常深入生产现场，不断总结提高，绝不能拿设计做实验，不成熟 的技术不能用于设计，以免给建设单位或业主带来重大经济损失。 (5) 生物制药工厂厂房应尽量做到造型简单、简洁，兼顾美观大方。生物 制药工厂厂房应首先做到满足生产工艺，否则会给工艺设计等专业带来极大的 困难或不合理。 1.5.2 生物工程优化与放大 随着生命科学研究的深入发展，对细胞内过程机理的认识越来越清晰，但 是基于单一生理调控机制出发的研究往往只揭示了生理调控的局部和某一时段 的特点，仅靠高度分支化和具体分散的研究难以对整个生物反应器生物过程全 局优化起决定性

54、作用。因此，如何在这些过程信息中寻找对过程全局优化有效 的信息就成为重要问题。 张嗣良等66提出了生物反应器生物过程多尺度问题，试图采用工程学方法 解决以上复杂系统的优化问题。把生物反应器中复杂的生物过程，分解为不同 尺度的特性进行研究，用以了解不同尺度事件之间的关系。每个尺度都有不同 的学科原理和变化规律，研究它们之间的量变到质变，以及由此形成的对复杂 系统总体的影响，采用发酵过程参数相关性的原料与方法，进而在包含多种因 素的庞大数据中，寻找出影响发酵过程全局优化的敏感生理参数。这样才有可 能解决发酵过程优化所面临的局部与整体的关系，由此实现全域性的跨尺度测 量与控制，达到生物过程全局优化的

55、目的。生物过程多尺度分析方法如图 1-7。 heat agitate aeration precursor carbon nitrogenacid gene scale cell scale cell reactor scale bioreactor signal conduction kinetic variables environment variables inner feedback metabolic flux heat agitate aeration precursor carbon nitrogenacid gene scale cell scale cell reactor

56、 scale bioreactor signal conduction kinetic variables environment variables inner feedback metabolic flux gene scale cell scale cell reactor scale bioreactor signal conduction kinetic variables environment variables inner feedback metabolic flux 图 1-7 生物反应器过程多尺度分析66 处于生物反应器中生长的微生物细胞，作为我们研究生物过程放大时的考

57、察对象，微生物细胞受到生物反应器中各种因素的影响，基因型所表现出来的 综合表型即为其生理状态。因此，研究生物过程放大时必须考虑到时刻变化的 菌体代谢和生理特性，与生物反应器体系间的相互影响。不论是从工程角度的 混合、传递传质，还是从发酵环境等出发，反应器中生长的细胞才是最终作用 对象，然而细胞的生长代谢与其局部环境密切相关。储炬等指出在生物过程放 大途中，反应器流场特性会时刻改变，而这种变化又会进一步对细胞的生理代 谢产生影响。因此，研究生物过程放大时，我们应该将反应器流场特性变化与 伴随其改变的细胞生长代谢特性结合考虑。在分析反应器流场特性变化对细胞 生理代谢的影响时，可以借用“规模缩小”方

58、法研究这些影响因素。图 1-8 表 示的是生物过程优化与放大方案示意图。 电泳 光谱 色谱 在线/原位测量 electric tongues artificial noses 芯片实验室技术 生理参数物理参数 影响 分析 综合流体力学 过程描述 模型开发 工艺流程优化 按比例放大参数验证 按比例放大 规模缩小 计算流体力学 化学计量学模型 神经网络 电泳 光谱 色谱 在线/原位测量 electric tongues artificial noses 芯片实验室技术 生理参数物理参数 影响 分析 综合流体力学 过程描述 模型开发 工艺流程优化 按比例放大参数验证 按比例放大 规模缩小 计算流体力

59、学 化学计量学模型 神经网络 生理参数物理参数 影响 分析 综合流体力学 过程描述 模型开发 工艺流程优化 按比例放大参数验证 按比例放大 规模缩小 计算流体力学 化学计量学模型 神经网络 图 1-8 生物过程优化与放大方案67 1.5.3 生物反应器设计 生物反应器的作用是为细胞代谢提供一个适宜的物理及化学环境，使细胞 能更快更好地生长，并得到更多需要的生物量或代谢产物。一个优良的生物反 应器应具备：严密的结构；良好的液体混合性能；较高的传质、传热性 能；配套而又可靠的检测和控制仪表。判断生物反应器好坏的唯一标准是该 装置能否适合工艺要求以取得最大的生产效率。 与化学反应器不同，生物反应器设

60、计应遵循的原则有： (1) 在培养系统的已灭菌部分与未灭菌部分之间不能直接连通。 (2) 尽量减少法兰连接，因设备震动和热膨胀会引起法兰连接处移位，导致 污染。 (3) 防止死角、裂缝等情况。 (4) 某些部分可以单独灭菌。 (5) 易于维修。 (6) 反应器可保持小的正压。 生物反应器设计的主要目标是使产品的质量高、成本低。生物反应器处于 生物过程的中心，是影响整个生物过程的经济效益的一个重要方面，反应器开 发的趋势和未来的方向是多样化、大型化和高度自动化。 1.6 本论文的研究目的与内容 由于市场对 r-ma 的需求与日俱增，并且腈水解酶介导的生物催化法生产 r-ma 具有巨大的工业化应用