水处理生物学实验

1、水处理生物学实验水处理生物学实验 实验要求实验要求 上课准时、不得无故缺席，实验报告要及时上交。上课准时、不得无故缺席，实验报告要及时上交。 实验期间不得大声喧哗、服从老师的安排、注意安全。实验期间不得大声喧哗、服从老师的安排、注意安全。 实验器材实验器材专人专用专人专用，对仪器要爱护，损坏实行赔偿制度。，对仪器要爱护，损坏实行赔偿制度。 维护好实验室的环境卫生，实行值日生制度。维护好实验室的环境卫生，实行值日生制度。 实验报告要求实验报告要求 统一用统一用A4纸手写实验报告纸手写实验报告 封面格式封面格式 1、实验课程名称、实验课程名称 2、实验项目名称、实验项目名称 3、学生所在的专业、班

2、级、姓名、学号、学生所在的专业、班级、姓名、学号 4、实验日期、实验日期 5、同组者姓名、同组者姓名 实验报告格式实验报告格式 1、实验目的、实验目的 2、实验原理、实验原理 3、实验仪器、溶液试剂、实验仪器、溶液试剂 4、实验步骤、实验步骤 5、实验结果（如绘图、列表等）、实验结果（如绘图、列表等） 6、思考题、思考题 实实 验验 内内 容容 显微镜的使用及酵母菌、曝气池中微生物等形显微镜的使用及酵母菌、曝气池中微生物等形 态观察态观察 放线菌、霉菌的形态观察放线菌、霉菌的形态观察 油镜的使用、细菌的单染色和革兰氏染色油镜的使用、细菌的单染色和革兰氏染色 微生物大小测定、显微镜直接计数法微生

3、物大小测定、显微镜直接计数法 培养基的制备及灭菌培养基的制备及灭菌 水体中细菌总数测定与大肠菌群生理生化反应水体中细菌总数测定与大肠菌群生理生化反应 实验一 （一）显微镜的构造、性能和使用方法（一）显微镜的构造、性能和使用方法 一、目的要求一、目的要求 了解普通光学显微镜的构造、基本原理、维护和保养的方了解普通光学显微镜的构造、基本原理、维护和保养的方 法法 学习并掌握普通光学显微镜的正确使用方法学习并掌握普通光学显微镜的正确使用方法 二、显微镜的基本结构二、显微镜的基本结构 （一）机械装置（一）机械装置 镜座镜座 镜臂镜臂 镜筒：单筒和双筒两种镜筒：单筒和双筒两种 物镜转换器物镜转换器 载物

4、台载物台 载物台转移器载物台转移器 调焦装置调焦装置 粗调节器粗调节器 细调节器细调节器 （二）光学系统（二）光学系统 接目镜（目镜）接目镜（目镜） 接物镜（物镜）接物镜（物镜） 低倍镜（低倍镜（10） 高倍镜高倍镜（40） 油镜（油镜（100） 聚光镜聚光镜 虹彩光圈虹彩光圈 反光镜反光镜 增加显微镜的分辨率增加显微镜的分辨率 显微镜的放大倍数显微镜的放大倍数=物镜放大倍数物镜放大倍数目镜放大倍数目镜放大倍数 显微镜的分辨率：显微镜的分辨率：显微镜能辨显微镜能辨 别两点之间的最小距离的能力。别两点之间的最小距离的能力。 D=/2NA=/2nsin(/2 ) D：分辨率：分辨率 NA：物镜的数

5、值孔径值：物镜的数值孔径值 ：可见光的波长（平均：可见光的波长（平均 0.550.55 m) m) n: n: 物镜和被检标本间介物镜和被检标本间介 质的折射率质的折射率 ：镜口角（即入射角）：镜口角（即入射角） 四、显微镜的使用方法四、显微镜的使用方法 观察前的准备观察前的准备 显微镜的安置显微镜的安置 光源调节光源调节 根据个人情况，调节双筒显微镜的目镜根据个人情况，调节双筒显微镜的目镜 右眼看清右眼看清 调节左目镜的视度调节圈调节左目镜的视度调节圈 扳动镜管，调节至瞳孔间距扳动镜管，调节至瞳孔间距 显微观察显微观察 低倍镜观察低倍镜观察 高倍镜观察（高倍镜观察（同焦现象同焦现象） 油镜观

6、察油镜观察 在待观察的样品区域滴加香柏油，从侧面注视，用在待观察的样品区域滴加香柏油，从侧面注视，用 粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中。粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中。 显微镜用毕后的处理显微镜用毕后的处理 上升镜筒，取下载玻片；上升镜筒，取下载玻片； 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸沾取少量用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸沾取少量 二甲苯擦去镜头上残留的油迹，最后用干净的擦镜纸二甲苯擦去镜头上残留的油迹，最后用干净的擦镜纸 擦去残留的二甲苯；擦去残留的二甲苯； 用擦镜纸清洁物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属用擦镜纸清洁物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属 部件

7、；部件； 将镜体各部分复原将镜体各部分复原。 五、思考题五、思考题 使用使用显微镜显微镜时哪些地方须特别时哪些地方须特别？ 二、酵母菌、曝气池中微生物等形态观察二、酵母菌、曝气池中微生物等形态观察 目的要求目的要求 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式；观察酵母菌的形态及出芽生殖方式； 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；学习区分酵母菌死活细胞的实验方法； 观察观察曝气池中曝气池中的的微生物微生物形态形态 基本原理基本原理 美蓝是一种无毒性染料美蓝是一种无毒性染料.氧化型呈现蓝色氧化型呈现蓝色, ,还原还原 型呈现无色型呈现无色.用美蓝对酵母的活细胞进行染色用美蓝对酵母的活细胞进行染色, ,代谢代谢

8、活力强的细胞具有较强的还原能力活力强的细胞具有较强的还原能力, ,能使美蓝由蓝色能使美蓝由蓝色 的氧化型变为无色的还原型的氧化型变为无色的还原型.因此因此, ,具有还原能力的具有还原能力的 酵母活细胞为无色酵母活细胞为无色, ,死细胞或代谢能力弱的衰老细胞死细胞或代谢能力弱的衰老细胞 为蓝色为蓝色. 实验器材实验器材 菌种菌种 红酵母红酵母 啤酒酵母啤酒酵母 曝气池活性污泥混合液曝气池活性污泥混合液 溶液或试剂溶液或试剂 0.1%吕氏碱性美蓝染色液吕氏碱性美蓝染色液 仪器或其他用具仪器或其他用具 显微镜，盖玻片，载玻片，滤纸，擦镜纸。显微镜，盖玻片，载玻片，滤纸，擦镜纸。 （一）酵母菌的形态观

9、察及死活细胞的鉴别（一）酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别 制片制片 在载玻片中央加一滴在载玻片中央加一滴0.1%美蓝美蓝取菌少许取菌少许混匀混匀盖盖 上盖玻片上盖玻片静置静置3min或或0.5h 观察观察 用高倍镜观察酵母的形态和出芽生殖用高倍镜观察酵母的形态和出芽生殖 根据颜色鉴别死活细胞根据颜色鉴别死活细胞 活细胞：无色；死细胞：蓝色活细胞：无色；死细胞：蓝色 （二）曝气池中微生物的形态观察（二）曝气池中微生物的形态观察 在载玻片中央加一滴活性污泥曝气池混合液在载玻片中央加一滴活性污泥曝气池混合液打散混匀打散混匀 盖上盖玻片盖上盖玻片低倍镜观察低倍镜观察高倍镜观察高倍镜观察绘出所观察到的绘

10、出所观察到的 微生物形态微生物形态 实验结果实验结果 绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。 分别绘出你在低倍镜、高倍镜观察到的菌胶团、原生动物、分别绘出你在低倍镜、高倍镜观察到的菌胶团、原生动物、 藻类等的基本形态。藻类等的基本形态。 吕氏碱性美蓝染色液作用时间不同，对酵母菌死细胞数量吕氏碱性美蓝染色液作用时间不同，对酵母菌死细胞数量 有何影响？试分析其原因。有何影响？试分析其原因。 思考题思考题 实验二、放线菌、霉菌的形态观察实验二、放线菌、霉菌的形态观察 目的要求目的要求 学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的基本方法；学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的基本

11、方法； 初步了解放线菌的形态特征；初步了解放线菌的形态特征； 了解四类常见霉菌的基本形态特征。了解四类常见霉菌的基本形态特征。 实验器材实验器材 菌种菌种 细黄链霉菌，曲霉、青霉、根霉、毛霉细黄链霉菌，曲霉、青霉、根霉、毛霉 培养基培养基 高氏高氏号琼脂培养基号琼脂培养基 察氏琼脂培养基察氏琼脂培养基 溶液或试剂溶液或试剂 0.1%美蓝染色液，乳酸石碳酸棉蓝染色液美蓝染色液，乳酸石碳酸棉蓝染色液,50% 乙醇乙醇 仪器或其他用具仪器或其他用具 显微镜，盖玻片，载玻片，接种环，解剖针等。显微镜，盖玻片，载玻片，接种环，解剖针等。 扦片法扦片法 倒平板倒平板取孢子划线接种取孢子划线接种无菌操作将灭

12、菌的盖玻片无菌操作将灭菌的盖玻片 以大约以大约45扦在接种线上扦在接种线上28倒置培养倒置培养3-5d 取培取培 养后的盖玻片直接镜检或用养后的盖玻片直接镜检或用0.1%美蓝对盖玻片染色美蓝对盖玻片染色 后观察后观察 观察基内菌丝、气生菌丝、孢子丝的卷曲状况，以及观察基内菌丝、气生菌丝、孢子丝的卷曲状况，以及 分生孢子的形状，并绘图说明分生孢子的形状，并绘图说明。 （一）放线菌的形态观察（一）放线菌的形态观察 （二）霉菌的形态观察（二）霉菌的形态观察 直接制片观察法直接制片观察法 在载玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液；在载玻片中央加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液； 用解剖针挑取少量已产孢子的霉菌菌

13、丝，先用用解剖针挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先用50乙乙 醇洗去脱落的孢子，再放在载玻片的染液中醇洗去脱落的孢子，再放在载玻片的染液中(青霉、曲青霉、曲 霉取菌丝时需连同培养基一起挑取霉取菌丝时需连同培养基一起挑取)； 用解剖针小心分散菌丝，盖上盖玻片；用解剖针小心分散菌丝，盖上盖玻片； 置低倍镜或高倍镜下观察。置低倍镜或高倍镜下观察。 绘图说明四种霉菌的形态特征绘图说明四种霉菌的形态特征(有无横隔有无横隔)。 根霉：假根、匍匐菌丝、孢囊梗、孢子囊及孢子囊孢子根霉：假根、匍匐菌丝、孢囊梗、孢子囊及孢子囊孢子 毛霉：菌丝、孢囊梗、孢子囊及孢子囊孢子毛霉：菌丝、孢囊梗、孢子囊及孢子囊孢子 青霉：菌

14、丝、分生孢子梗、帚状分支小梗及分生孢子青霉：菌丝、分生孢子梗、帚状分支小梗及分生孢子 曲霉：菌丝、足细胞、分生孢子梗、初生小梗、次生小梗、顶囊、分曲霉：菌丝、足细胞、分生孢子梗、初生小梗、次生小梗、顶囊、分 生孢子生孢子 实验结果实验结果 绘图说明你所观察到的放线菌和霉菌的形态特征。绘图说明你所观察到的放线菌和霉菌的形态特征。 思考题思考题 镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？镜检时，你如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？ 你主要根据哪些形态特征来区分四种不同的霉菌？你主要根据哪些形态特征来区分四种不同的霉菌？ 实验三实验三 油镜的使用、细菌的单染色及革兰氏染色油镜的使用、细菌的单染

15、色及革兰氏染色 （一（一)、油镜的工作原理、油镜的工作原理 增加照明强度增加照明强度 当光线由反光镜通过玻片当光线由反光镜通过玻片 与镜头之间的空气时，由与镜头之间的空气时，由 于空气与玻片的密度不同，于空气与玻片的密度不同， 有些光线会因折射或全反有些光线会因折射或全反 射，不能进入镜头，降低射，不能进入镜头，降低 了视野的照明度；若中间了视野的照明度；若中间 的介质是一层油（的介质是一层油（其折射其折射 率与玻片的相近率与玻片的相近），则几），则几 乎不发生折射，增加了视乎不发生折射，增加了视 野的进光量，从而使物象野的进光量，从而使物象 更加清晰。更加清晰。 增加显微镜的分辨率：增加显微

16、镜的分辨率： D=/2NA=/2nsin(/2 ) D：分辨率：分辨率 NA：物镜的数值孔径值：物镜的数值孔径值 ：可见光的波长（平均：可见光的波长（平均 0.550.55 m) m) n: n: 物镜和被检标本间介物镜和被检标本间介 质的折射率质的折射率 ：镜口角（即入射角）：镜口角（即入射角） 显微观察显微观察 低倍镜观察低倍镜观察 高倍镜观察高倍镜观察 油镜观察油镜观察 在待观察的样品区域滴加香柏油，从侧面注视，用在待观察的样品区域滴加香柏油，从侧面注视，用 粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中。粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中。 显微镜用毕后的处理显微镜用毕后的处理 上

17、升镜筒，取下载玻片；上升镜筒，取下载玻片； 用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸沾取少量用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸沾取少量 乙醇乙醚洗液擦去镜头上残留的油迹，最后用干净的乙醇乙醚洗液擦去镜头上残留的油迹，最后用干净的 擦镜纸擦去残留的乙醇乙醚洗液；擦镜纸擦去残留的乙醇乙醚洗液； 用擦镜纸清洁物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属用擦镜纸清洁物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属 部件；部件； 将镜体各部分复原。将镜体各部分复原。 （二）简单染色法（二）简单染色法 目的要求目的要求 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单 染色法；染色法

18、； 初步认识细菌的形态特征；初步认识细菌的形态特征； 巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。 基本原理基本原理 借助物理因素（如：细胞及细胞物质对染料的毛细现借助物理因素（如：细胞及细胞物质对染料的毛细现 象、渗透、吸附作用等）和化学因素（如：正负离子象、渗透、吸附作用等）和化学因素（如：正负离子 之间的相互吸引等）的作用而进行的。之间的相互吸引等）的作用而进行的。 实验器材实验器材 菌种菌种 大肠杆菌大肠杆菌约约24h营养琼脂斜面培养物营养琼脂斜面培养物 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌12-18h营养琼脂斜面培养物营养琼脂斜面培养物 藤黄八叠球菌藤

19、黄八叠球菌约约24h营养琼脂斜面培养物营养琼脂斜面培养物 染色剂染色剂 草酸铵结晶紫染液草酸铵结晶紫染液 番红染液番红染液 仪器或其他用具仪器或其他用具 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、无菌水等。显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、无菌水等。 操操 作作 步步 骤骤 涂涂 片片 干干 燥燥 固固 定定 染染 色色 镜镜 检检 水水 洗洗 干干 燥燥 实验结果实验结果 根据观察结果，绘出细菌形态图。根据观察结果，绘出细菌形态图。 思考题思考题 你认为在制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环你认为在制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环 节？节？ 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？为什么要求制片

20、完全干燥后才能用油镜观察？ 如果你的涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如如果你的涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如 果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？ （三）革兰氏染色法（三）革兰氏染色法 目的要求目的要求 学习并初步掌握革兰氏染色法；学习并初步掌握革兰氏染色法； 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重 要性。要性。 实验器材实验器材 菌种菌种 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌12-18h营养琼脂斜面培养物营养琼脂斜面培养物 大肠杆菌大肠杆菌约约24h营养琼脂斜面培养物营养琼脂斜面培养物 藤黄八叠球菌

21、藤黄八叠球菌约约24h营养琼脂斜面培养物营养琼脂斜面培养物 染色剂染色剂 草酸铵结晶紫染液草酸铵结晶紫染液 卢戈氏碘液卢戈氏碘液 95%乙醇乙醇 番红染色液番红染色液 仪器或其他用具仪器或其他用具 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、无菌水等。显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、无菌水等。 操操 作作 步步 骤骤 藤黄八叠菌纯培养的镜下形态（革 兰氏染色） 大肠杆菌纯培养的镜下形态（革兰 氏染色） 实验结果实验结果 列表说明你所观察到的细菌形状、颜色和革兰氏染色列表说明你所观察到的细菌形状、颜色和革兰氏染色 反应。反应。 思考题思考题 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其你认为哪些环节会影响

22、革兰氏染色结果的正确性？其 中最关键的环节是什么？中最关键的环节是什么？ 现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请 你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金你鉴定其革兰氏染色反应。你怎样运用大肠杆菌和金 黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的 染色结果正确性。染色结果正确性。 你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响 最终结果？在什么情况下可以采用？最终结果？在什么情况下可以采用？ 实验五实验五 微生物大小的测定、显微镜直接计数法微

23、生物大小的测定、显微镜直接计数法 目的要求目的要求 学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法 明确血细胞球计数板计数的原理。明确血细胞球计数板计数的原理。 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 实验原理实验原理 镜台测微尺为中央部分刻有精确等分线的载玻片，将镜台测微尺为中央部分刻有精确等分线的载玻片，将 1mm等分等分100格，每格长格，每格长0.01mm。只用于校正目镜。只用于校正目镜 测微尺。测微尺。 目镜测微尺是可放入目镜内的圆形小玻片，精确等分目镜测微尺是可放入目镜内的圆形小玻片，精确等分50 小格或小

24、格或100小格。由于不同显微镜或不同目镜和物镜组合小格。由于不同显微镜或不同目镜和物镜组合 放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不 一样。因此，测量前需先用镜台测微尺进行校正。一样。因此，测量前需先用镜台测微尺进行校正。 球菌以直径表示大小；杆菌用宽球菌以直径表示大小；杆菌用宽长表示。长表示。 实验器材实验器材 菌种：啤酒酵母菌种：啤酒酵母 仪器：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板仪器：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、血球计数板 （一）酵母菌大小的测定（一）酵母菌大小的测定 安装目镜测微尺安装目镜测微尺 校正目镜测微尺校正目

25、镜测微尺 将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。 分别在低、高倍镜、油镜下用镜台测微尺校正目镜测微尺分别在低、高倍镜、油镜下用镜台测微尺校正目镜测微尺 计算计算 镜台测微尺：将镜台测微尺：将1mm等分为等分为100小格，每小格长小格，每小格长0.01mm （即（即10m）。）。 目镜测微尺每格长度（目镜测微尺每格长度（m）=（两重合线间镜台测微尺格（两重合线间镜台测微尺格 数数10）/两重合线间目镜测微尺格数两重合线间目镜测微尺格数 菌体大小测定菌体大小测定 取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，在高倍镜下测定取下镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，在高倍镜

26、下测定 酵母菌的长和宽。酵母菌的长和宽。 选择有代表性的选择有代表性的10个细胞进行测定，取平均值。个细胞进行测定，取平均值。 实验结果记录实验结果记录 1）将目镜测微尺校正结果填入下表）将目镜测微尺校正结果填入下表 接目镜放大倍数：接目镜放大倍数： 接物镜接物镜接物镜倍数接物镜倍数目镜测微目镜测微 尺格数尺格数 镜台测微镜台测微 尺格数尺格数 目镜测微尺每格代表的目镜测微尺每格代表的 长度长度 /um 低倍镜低倍镜 高倍镜高倍镜 油油 镜镜 2）将啤酒酵母测定结果填入下表）将啤酒酵母测定结果填入下表 测测 定定 次次 数数 目镜测微尺目镜测微尺 每格代表的每格代表的 长度长度/um 宽宽 长

27、长菌体大菌体大 小范围小范围 /um 目镜测微目镜测微 尺格数尺格数 宽度宽度 /um 目镜测微目镜测微 尺格数尺格数 长度长度 /um 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 （二）酵母菌的显微镜直接计数（二）酵母菌的显微镜直接计数 血球计数板的构造血球计数板的构造 血球计数板是一块特制的载玻片，其上由血球计数板是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成条槽构成3个平台；中个平台；中 间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各有一个间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各有一个 方格网。每个方格网共分方格网。每个方格网共分9个大方格，中间的大方格即为计数室。个大方格，中间的大方

28、格即为计数室。 计数室的刻度有两种规格：一种是一个大方格分成计数室的刻度有两种规格：一种是一个大方格分成16个中方格，个中方格， 而每个中方格又分成而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成个小方格；另一种是一个大方格分成25个个 中方格，而每个中方格又分成中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论哪种规格，每个小方格。但无论哪种规格，每 个大方格都由个大方格都由400个小方格组成。个小方格组成。 每个大方格边长为每个大方格边长为1mm，则每个大方格的面积为，则每个大方格的面积为1mm2，盖上盖，盖上盖 玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1

29、mm，所以计数室的容，所以计数室的容 积为积为0.1mm3。 制制 备备 适适 当当 浓浓 度度 的的 菌菌 悬悬 液液 取取 洁洁 净净 的的 血血 球球 计计 数数 板板 盖盖 上上 盖盖 玻玻 片片 静静 置置 5 分分 钟钟 用用 高高 倍倍 镜镜 计计 数数 加加 样样 品品 设设5个中方格的总菌数为个中方格的总菌数为A，菌液稀释倍数为，菌液稀释倍数为B 计数板为计数板为25个中方格：个中方格： 1ml菌液的总菌数菌液的总菌数=A/525104B 计数板为计数板为16个中方格：个中方格： 1ml菌液的总菌数菌液的总菌数=A/516104B 注意事项注意事项 取样时先要摇匀菌液；取样时

30、先要摇匀菌液； 加样时计数室不可有气泡；加样时计数室不可有气泡； 一般样品稀释度要求每小格内约有一般样品稀释度要求每小格内约有5-10个菌体为宜；个菌体为宜； 每个计数室选每个计数室选5个中格（个中格（4个角和中央）计数；个角和中央）计数； 位于格线上的菌体一般数上不数下，数右不数左；位于格线上的菌体一般数上不数下，数右不数左； 若芽体大小达到母细胞的一半，则作为两个菌体计数。若芽体大小达到母细胞的一半，则作为两个菌体计数。 血球计数板使用完毕，用水冲洗干净，切勿用硬物洗血球计数板使用完毕，用水冲洗干净，切勿用硬物洗 刷，以免损坏网格刻度；洗净后自行晾干或吹风机吹刷，以免损坏网格刻度；洗净后自

31、行晾干或吹风机吹 干。干。 实验结果实验结果 测定你所制备的样品的含菌量。测定你所制备的样品的含菌量。 A表示五个中方格中的总菌数；表示五个中方格中的总菌数；B表示菌液稀释倍数表示菌液稀释倍数 各中格中菌数各中格中菌数 A B二室平均值二室平均值菌数菌数 /um12345 第一室第一室 第二室第二室 思考题思考题 为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜为什么更换不同放大倍数的目镜或物镜时，必须用镜 台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？台测微尺重新对目镜测微尺进行校正？ 在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的 物镜来测定同一细菌的大小时

32、，其测定结果是否相同？物镜来测定同一细菌的大小时，其测定结果是否相同？ 为什么？为什么？ 根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要根据你的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要 来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？来自哪些方面？应如何尽量减少误差、力求准确？ 实验五 培养基的制备与灭菌 一、培养基的制备一、培养基的制备 目的要求目的要求 明确培养基的配制原理明确培养基的配制原理 通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的 一般方法和步骤一般方法和步骤 按培养基的用途分按培养基的用途分 基础培养基基础培养基 鉴别培养基鉴别培养基 选择培养基选择

33、培养基 按培养基的物理状态分按培养基的物理状态分 固体培养基固体培养基 半固体培养基半固体培养基 液体培养基液体培养基 按成分不同分按成分不同分 天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基 半合成培养基半合成培养基 基本原理基本原理 四种培养基的配方四种培养基的配方 牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白 胨琼脂培养胨琼脂培养 基（一种天基（一种天 然培养基，然培养基， 用于分离和用于分离和 培养细菌）培养细菌） 配方：配方： 牛肉膏牛肉膏 3g 蛋白胨蛋白胨 10g 氯化钠氯化钠 5g 琼脂琼脂 20g 水水 1000ml pH 7.2-7.4 灭菌灭菌 121 20min 乳糖蛋白胨培乳糖蛋白胨培 养液（一

34、种液养液（一种液 体培养基，用体培养基，用 于大肠菌群的于大肠菌群的 生理生化鉴定）生理生化鉴定） 配方：配方： 牛肉膏牛肉膏 3g 乳糖乳糖 5g 氯化钠氯化钠 5g 蛋白胨蛋白胨 10g 水水 1000ml 1.6溴甲酚紫乙醇溶液溴甲酚紫乙醇溶液 1ml 先将药品溶解于先将药品溶解于1升水中，后调升水中，后调pH7.2 7.4，加入，加入1.6溴甲酚紫乙醇溶液溴甲酚紫乙醇溶液 1ml， 充分混匀，分装入有小倒管的试管中，充分混匀，分装入有小倒管的试管中， 11520min灭菌灭菌 产硫化氢培养产硫化氢培养 基，一种半合基，一种半合 成培养基，用成培养基，用 于肠道细菌的于肠道细菌的 生理生

35、化鉴定。生理生化鉴定。 配方：配方： 柠檬酸铁胺柠檬酸铁胺 4g 蛋白胨蛋白胨 20g 氯化钠氯化钠 5g 硫代硫酸钠硫代硫酸钠 0.5g 琼脂琼脂 20g 水水 1000ml pH 7.2 灭菌灭菌 115 15min 伊红美兰培养伊红美兰培养 基（一种鉴别基（一种鉴别 培养基，用于培养基，用于 大肠菌群的生大肠菌群的生 理生化鉴定）理生化鉴定） 配方：配方： 磷酸氢二钾磷酸氢二钾 2g 乳糖乳糖 10g 蛋白胨蛋白胨 10g 琼脂琼脂 20g 水水 1000ml 2伊红水溶液伊红水溶液 20ml 0.5美蓝水溶液美蓝水溶液 13ml pH 7.27.4 灭菌灭菌 115 20min 器材器

36、材 l 溶液或试剂溶液或试剂 4mol/L NaOH，1mol/L HCl，牛肉膏蛋白胨培养基、，牛肉膏蛋白胨培养基、 乳糖蛋白胨培养液乳糖蛋白胨培养液 、产硫化氢培养基的配方药品。、产硫化氢培养基的配方药品。 l 仪器或其他用具仪器或其他用具 试管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，药匙，电磁炉，试管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，药匙，电磁炉， 高压蒸气灭菌锅，高压蒸气灭菌锅，pH试纸试纸(pH5.59.0)，硅胶塞，棉，硅胶塞，棉 花，报纸，记号笔等。花，报纸，记号笔等。 操作步骤（一）操作步骤（一） 1 1 计算 ：根据配方按照用量计算。 2. 2. 称量： 3 3溶解：如有琼脂，要不断搅拌避

37、免糊底。 4 4、调节pH：用1mol/L NaOH或1mol/L HCl调节， 以pH试纸或pH计测定。 5 5过滤：趁热用四层纱布过滤。 操作步骤（二）操作步骤（二） 6.分装 试管：固体不超过试管高度的 1/5；液体、半固体不超过试 管高度的1/4或1/3 。 三角烧瓶：总体积的一半为限。 管口或瓶口不得沾有培养基 操作步骤（三）操作步骤（三） 7.加塞 1.正确；正确；2.管内部分太短，外部太松；管内部分太短，外部太松；3.外部过小外部过小 操作步骤（三）操作步骤（三） 8.包扎：注明培养基的名称。 9.灭菌 ：按各自培养基灭菌的温度、时间灭菌。 10.搁置斜面 (1/3l/2，不能超

38、过，不能超过1/2)。 11.无菌检查 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸 汽灭菌法的原理及其使用方法。汽灭菌法的原理及其使用方法。 目的要求目的要求 二、消毒与灭菌 灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽 孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生 物的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭物的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭 菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照 射和使用化学药品等方法。射和使用化学药品等方法。 基本原理基本原理 干热灭菌干热灭

39、菌 火焰灼烧法火焰灼烧法 干热灭菌法干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法）（烘箱内热空气灭菌法） 湿热灭菌法湿热灭菌法 加压蒸汽灭菌法加压蒸汽灭菌法 紫外线灭菌法紫外线灭菌法 微孔滤膜过滤除菌微孔滤膜过滤除菌 火焰灼烧法火焰灼烧法 直接在火焰上灼烧灭菌直接在火焰上灼烧灭菌 主要用于实验室接种针主要用于实验室接种针( (环环) )、试管口、三角瓶口和金属小、试管口、三角瓶口和金属小 工具等的灭菌。工具等的灭菌。 干热灭菌法干热灭菌法 设备：电热烘箱设备：电热烘箱 适用于耐高温器皿，适用于耐高温器皿，160-170，维持，维持2小时小时 注意事项：注意事项： 1.温度不可超过温度不可超过180，以防玻璃

40、器皿上的棉塞及包装纸烤焦着火。，以防玻璃器皿上的棉塞及包装纸烤焦着火。 2.灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。 3.灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。 4.电烘箱内温度电烘箱内温度70时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃 器皿炸裂。器皿炸裂。 2.湿热灭菌(一） l高压蒸汽灭菌法 ：是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内 0.1MPa0.1MPa，121121保持保持151530min30min进行灭菌，从而导

41、致进行灭菌，从而导致 菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。时间的长菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。时间的长 短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化， 以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、 橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。 在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。 原因一：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝原因一：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝 固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。固，因蛋

42、白质含水量增加，所需凝固温度降低。 卵白蛋白含水量卵白蛋白含水量/%/%3030分钟内凝固所需温度分钟内凝固所需温度/ / 5056 257480 188090 6145 0160170 蛋白质含水量与凝固所需温度的关系蛋白质含水量与凝固所需温度的关系 原因二：湿热的穿透力比干热大。原因二：湿热的穿透力比干热大。 原因三：湿热的蒸气有潜热存在。原因三：湿热的蒸气有潜热存在。 l间歇灭菌法： 应用于不易于高压蒸汽灭菌的培应用于不易于高压蒸汽灭菌的培 养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基 等。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，等。此法是用阿诺氏流动蒸

43、汽灭菌器进行灭菌， 每天加热每天加热10030min10030min、连续三天，可彻底灭菌。、连续三天，可彻底灭菌。 l煮沸消毒法：注射器和解剖器械等可用煮沸消注射器和解剖器械等可用煮沸消 毒法。一般煮沸消毒时间为毒法。一般煮沸消毒时间为101015min15min。 l超高温杀菌： 此法指在温度和时间标准分别为此法指在温度和时间标准分别为 135135150150和和2 28s8s的条件下对牛乳或其他液态的条件下对牛乳或其他液态 食品进行处理的一种工艺。食品进行处理的一种工艺。 2.湿热灭菌(二） l高压蒸汽灭菌法（以手提式高压蒸汽灭菌锅为（以手提式高压蒸汽灭菌锅为 例）例） 操作步骤（三）

44、 全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅 1. 1.装锅先向外层锅内加入适量的水，放入内锅，装入待灭先向外层锅内加入适量的水，放入内锅，装入待灭 菌物品。菌物品。 2.2.加盖 将盖上的排气软管插入内层灭菌锅的排气槽内。再将盖上的排气软管插入内层灭菌锅的排气槽内。再 以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。 3.3.灭菌 加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后，加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后， 关上排气阀，升温至关上排气阀，升温至l21l21时维持时维持1520min1520min。 4.4.降温取物

45、 灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至 0 0时，打开排气阀，开盖取物。时，打开排气阀，开盖取物。 操作步骤操作步骤（三（三） 加压蒸汽灭菌法加压蒸汽灭菌法 0.1MPa，121，20min灭菌灭菌 注意事项：注意事项： 1.切勿忘记加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂切勿忘记加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂 事故。事故。 2.锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。 3.压力一定要降到压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。时，才能打开排气阀，

46、开盖取物。 4.灭菌全程必须有人看守。灭菌全程必须有人看守。 紫外线灭菌法紫外线灭菌法 适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭 菌。菌。 紫外线灯距照射物以不超过紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。为宜。 若紫外线照射与若紫外线照射与3%5%的石炭酸溶液或的石炭酸溶液或2%3%的的来苏尔来苏尔 等化学消毒剂结合使用，可加强灭菌效果。等化学消毒剂结合使用，可加强灭菌效果。 注意事项：注意事项： 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不 能直视紫外线灯光，更不能在

47、紫外线灯光下工作。能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。 过滤除菌法过滤除菌法 适用于不耐热的液体物质（如维生素、血清、酶等热敏性适用于不耐热的液体物质（如维生素、血清、酶等热敏性 物质）。物质）。 滤膜孔径：滤膜孔径：0.22m 缺点：无法去除培养液中的病毒和噬菌体。缺点：无法去除培养液中的病毒和噬菌体。 思考题思考题 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的 培养基是无菌的？培养基是无菌的？ 在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题？为什么？在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题？为什么？ 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高

48、，时间长？请设为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高，时间长？请设 计干热灭菌和湿热灭菌效果比较方案。计干热灭菌和湿热灭菌效果比较方案。 在高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？在高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？ 灭菌完毕后，为什么待压力降低灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，时才能打开排气阀， 开盖取物？开盖取物？ 实验六实验六 水体中细菌总数测定与大肠菌群水体中细菌总数测定与大肠菌群 生理生化反应生理生化反应 （一）（一）水体中细菌总数测定水体中细菌总数测定 目的要求目的要求 1.了解水样的采取方法了解水样的采取方法 2.应用平板菌落计数法测定水样细

49、菌总数应用平板菌落计数法测定水样细菌总数 基本原理基本原理 通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液 （使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞在），（使样品中的微生物细胞充分分散，成单个细胞在）， 再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特再取一定量的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特 定的选择性培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数定的选择性培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数 计算出每克或每毫升样品中的微生物数量。计算出每克或每毫升样品中的微生物数量。 实验器材实验器材 菌种：大肠杆菌菌悬液菌种：大肠杆菌菌悬液 培养基：牛肉膏蛋白

50、胨培养基培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 仪器或其他用具：仪器或其他用具：1mL无菌吸管，无菌平皿，盛有无菌吸管，无菌平皿，盛有 4.5mL无菌水的试管、吸耳球、培养箱等。无菌水的试管、吸耳球、培养箱等。 操作步骤（一）操作步骤（一） 水样的采集（了解）水样的采集（了解） 1.自来水：水龙头火焰灼烧自来水：水龙头火焰灼烧3min放水放水5min用灭菌三用灭菌三 角瓶接水角瓶接水分析分析 2.池水、河水或湖水：池水、河水或湖水： 将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水面下将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水面下10-15cm 处处翻转过来，除去玻璃塞翻转过来，除去玻璃塞取水取水盖好瓶塞，取出盖好瓶塞，取出冰

51、冰 箱中保存或立即检查箱中保存或立即检查 操作步骤（二操作步骤（二) 细菌总数测定（细菌总数测定（两种方法两种方法） 倾注法（本次实验采用）倾注法（本次实验采用） 涂布法涂布法 1.编号编号：取无菌平皿：取无菌平皿9个，分别表明个，分别表明10 3、 、10-4、10-5 （稀释度）各三套。另取无菌水（稀释度）各三套。另取无菌水5支，依次标明支，依次标明10 1、 、 10-2、10 3、 、10-4、10-5 10-3 10-4 10-5 原样 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml 0.2ml0.2ml0.2ml 2.2.稀释稀释: :放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只 接触一个稀释度。 3.取样取样 4.倒平板倒平板：倒入融化后冷却至45的培养基15ml，置水 平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。 5.培养培养：37倒置培养1824h 实验结果记录实验结果记录 稀释度稀释度10-310-410-5 平板平板123123123