生物分离工程第二章

1、1 第二章第二章 细胞分离与破碎细胞分离与破碎 2 总体学习目的和要求总体学习目的和要求 通过本章学习，要求掌握通过本章学习，要求掌握细胞分离细胞分离 和和目标产物目标产物释放的释放的原理原理和方法，熟知各和方法，熟知各 种方法的种方法的优缺点优缺点和应用范围。和应用范围。 3 收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物 （细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和（细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物和 它们的絮凝体等）。它们的絮凝体等）。 收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相。收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相。 固液分离的目的固液分离的目的 4 2

2、.1 2.1 细胞分离细胞分离 重力沉降重力沉降 离心沉降离心沉降 过滤过滤 5 重力沉降重力沉降 重力沉降是化工过程中常用的气固、 液固和液液分离手段，在生化分离过程 中亦有一定程度的应用。 6 以液固沉降为例，重力沉降过程中固体颗粒受 到重力、浮力和摩擦阻力的作用。考虑球形的 固体颗粒，则当浮力、摩擦阻力和重力达到平 衡时，固体颗粒匀速沉降，沉降速度为 上式为球形粒子的Stokes沉降速度， 、 、 和 分别表示粒径、固体颗粒密度、液 体密度和重力加速度， 为重力沉降速度， 为液体粘度。 L LSp g gd 18 )( 2 p d s L g g L 7 菌体和动植物细胞的重力沉降虽 然

3、简便易行，但菌体细胞体积很小， 沉降速度很慢。因此，实用上需使菌 体细胞聚并成较大凝聚体颗粒后进行 沉降操作，提高沉降速度。 8 提高重力沉降的途径提高重力沉降的途径 加入中性盐：加入中性盐：双电层排斥电位降低双电层排斥电位降低 加入高分子絮凝剂：加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝团架桥作用形成大絮凝团 引入外力引入外力 9 离心沉降离心沉降是利用沉降设备使流体和颗粒旋转，是利用沉降设备使流体和颗粒旋转， 在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度 差，所以颗粒沿径向与流体产生相对运动，从而差，所以颗粒沿径向与流体产生相对运动，从而 使颗粒和流体分离

4、。使颗粒和流体分离。 离心沉降离心沉降 10 应用应用 1878年年 瑞典瑞典 牛奶牛奶奶油奶油 1896年年 用于回收酵母用于回收酵母 离心分离技术在生工方面主要用于：分离心分离技术在生工方面主要用于：分 离离DNA、大分子、菌体、动植物细胞、大分子、菌体、动植物细胞、 胞内产物。胞内产物。 11 离心沉降速度 离心设备的一个重要技术指标是其所能达到的离心 力与重力的比值，称为分离因数。分离因数是衡量 离心程度的参数，用Z表示 式中，r为离心半径，即从旋转轴心到沉降颗粒的距 离，N为离心机的转数(s-1) 。 g rN Z 22 4 12 离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，因 此，将

5、式(1)中的g用Zg代替，可得离心沉降速度Vs 为 或 L LSP s rNd 9 )(2 222 Sr dt dr s N.2 13 即： 2 L 18 )( 2 r d v LS P s 14 提高离心沉降速度的主要措施提高离心沉降速度的主要措施 d 颗粒直径；颗粒直径； S 固体颗粒密度；固体颗粒密度； L 液体介质密度；液体介质密度； L 液体介质粘度；液体介质粘度； 旋转角速度；旋转角速度； r 转轴中心到颗粒中心距离转轴中心到颗粒中心距离 增大增大dp 增大增大S 提高离心机转数提高离心机转数N 提高离心半径提高离心半径r 降低液体粘度降低液体粘度 2 L 18 )( 2 r d

6、v LS P s 15 离心分离法 差速离心 区带离心 16 差速离心分级 1. 差速离心(Differential centrifugation)是生化工业 中最常用的离心分离方法。以菌体细胞的收集 或除去为目的的固液离心分离是分级离心操作 的一种特殊情况，即为一级分级分离。 2. 操作中，根据实际物料的特点(目标产物和其他 组分的性质和相互作用等)、分离的目的和所需 分离的程度，选择适当的操作条件(离心转数和 时间)，可使料液中的不同组分得到分级分离。 17 差差 速速 离离 心心 18 19 主要菌体和细胞的离心分离主要菌体和细胞的离心分离 离离心心力力 菌菌体体、细细胞胞 大大小小/m

7、 实实验验室室 工工业业规规模模 大肠杆菌 24 1 500g 13 000g 酵母 27 1 500g 8 000g 血小板 24 5 000g 红血球 69 1 200g 淋巴球 712 500g 肝细胞 2030 800g 20 区带离心 区带离心(Zonal centrifugation)是生化 研究中的重要分离手段，根据离心操作条件 不同，分为 1. 差速区带离心(Rate zonal density gradient sedimentation) 2. 平衡区带离心(Isopycnic density gradient sedimentation) 21 梯度梯度 离心离心 22

8、23 1. 两种区带离心法均事先在离心管中用某种 低分子溶质(如蔗糖、甘油等溶液)调配好密 度梯度，在密度梯度之上加待处理的料液 后进行离心操作。 2. 区带离心的密度梯度一般可用蔗糖配制。 事先调配不同浓度(密度)的蔗糖溶液，然后 在离心管中依浓度从大到小层层加入即可。 将一定浓度的蔗糖溶液经一定时间的高速 离心后可制成连续的蔗糖密度梯度。 3. 区带离心法可用于蛋白质、核酸等生物大 分子的分离纯化，但处理量小，一般仅限 于实验室水平。 24 密度梯度离心（密度梯度离心（density gradient） 生物大分子及颗粒的沉降不仅生物大分子及颗粒的沉降不仅 决定于它的大小，而且也取决于决定

9、于它的大小，而且也取决于 它的密度。颗粒在具有密度梯度它的密度。颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大的介质中离心时，质量和密度大 的颗粒沉降的快，并且每种蛋白的颗粒沉降的快，并且每种蛋白 质颗粒沉降到与自身密度相等的质颗粒沉降到与自身密度相等的 介质密度梯度时，即停止不前，介质密度梯度时，即停止不前， 最后各自在离心管中被分离成独最后各自在离心管中被分离成独 立的区带。分成区带的样品可以立的区带。分成区带的样品可以 在管底刺一个小孔逐滴放出，分在管底刺一个小孔逐滴放出，分 步收集。常用的介质有步收集。常用的介质有蔗糖蔗糖、氯氯 化铯等。化铯等。 滴加样品滴加样品 蔗糖浓度蔗糖浓度

10、离离 心心 管管 蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度 25 密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的应用密度梯度沉降平衡法在核酸研究中的应用 1、核酸密度的测定、核酸密度的测定 = o + 4.2 2( 2- 02) 10-10 2、测定、测定DNA中中G-C之含量之含量 Rolfe-Meselson公式：公式： = 0.100 xG-C + 1.658 3、溶液中核酸构象的研究、溶液中核酸构象的研究 ：单链：单链DNA 双链双链DNA 蛋白质蛋白质 双链双链DNA RNA 4、核酸的制备、核酸的制备 氯化铯密度梯度超离心氯化铯密度梯度超离心 经染料经染料-氯化铯密度梯氯化铯密度梯 度超离心后，质粒度超离心后，

11、质粒DNA 及各种杂质的分布及各种杂质的分布 超螺旋超螺旋 DNA 闭环质粒闭环质粒 DNA 开环质及开环质及 线型线型DNA 蛋白质蛋白质 石蜡油石蜡油 26 *差速和平衡区带离心异同差速和平衡区带离心异同 区带离心种类区带离心种类 差速区带离心差速区带离心 平衡区带离心平衡区带离心 共同点共同点 事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度 梯度介质梯度介质 常用蔗糖常用蔗糖 常用氯化铯常用氯化铯 密度梯度密度梯度 最大的密度梯度低于最大的密度梯度低于 最大密度的沉降样品最大密度的沉降样品 最大的密度梯度大于最大的密度梯度大于 最大密度的沉降样品最大

12、密度的沉降样品 区带形成条件区带形成条件 根据各个组分沉降系数的根据各个组分沉降系数的 差别，形成各自的区带差别，形成各自的区带 根据各组分密度差形根据各组分密度差形 成区带成区带 离心条件离心条件 在最前的沉降物质达到管底在最前的沉降物质达到管底 前停止，短时间，低速度前停止，短时间，低速度 使各组分沉降到其平衡的使各组分沉降到其平衡的 密度区，长时间，高速度密度区，长时间，高速度 27 离心分离设备 1. 离心机是生化实验室及生化工业广泛使用 的分离设备。实验室用离心机以离心管式 转子离心机为主，离心操作为间歇式。 2. 工业离心分离设备中，较为常用的有管式 和碟片式两大类。 28 管式管

13、式离心机碟片式碟片式离心机 各种转子各种转子 区带转子 分析转子 29 管式管式离心机碟片式碟片式离心机 30 离心机的选用原则离心机的选用原则 颗粒的大小、形状及硬度颗粒的大小、形状及硬度 原料液的组成、密度及粘度原料液的组成、密度及粘度 产物热敏性产物热敏性 31 过滤过滤 过滤速度 过滤设备 32 过过 滤滤 过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差过滤操作是借助于过滤介质，在一定的压力差 P作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道，作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道， 而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的 单元操作。单元操作。 过滤

14、介质过滤介质 : 过滤采用的多孔物质。过滤采用的多孔物质。 织物状介质织物状介质，棉花、石棉、蚕丝、麻、 羊毛及各种人造纤维与金属丝等 多孔陶瓷介质多孔陶瓷介质，此为特殊的介质，低温 烧制，具有大量微细孔道的滤管或滤板 （其他多孔材料，PE等） 膜分离介质，膜分离介质，微滤分离等 33 （1）过滤推动力：）过滤推动力： 悬浮液自身压强差、重力悬浮液自身压强差、重力 悬浮液的悬浮液的外加压力外加压力 过滤介质的过滤介质的抽真空抽真空 离心力离心力 （2）过滤阻力：）过滤阻力： 介质阻力介质阻力 滤饼阻力滤饼阻力 大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼大多情况下，过滤阻力主要取决于滤饼 阻力。阻力。

15、34 （3）过滤速率）过滤速率 cmL RR pA dt dQ Rm表示介质的阻力；表示介质的阻力； Rc表示滤饼的阻力；表示滤饼的阻力； L为滤液的粘度为滤液的粘度 35 （4）过滤速度的强化）过滤速度的强化 a降低滤饼阻力降低滤饼阻力 如絮凝剂、凝固剂助滤剂等。如絮凝剂、凝固剂助滤剂等。 b降低滤液黏度降低滤液黏度 黏度愈低，过滤阻力愈小。加热、去杂蛋白、絮凝、黏度愈低，过滤阻力愈小。加热、去杂蛋白、絮凝、 调调pH、选择合适的放罐时间。、选择合适的放罐时间。 c降低悬浮液中悬浮固体的浓度降低悬浮液中悬浮固体的浓度 过滤速度与获得滤饼体积成反比。因此应尽可能降低过滤速度与获得滤饼体积成反比

16、。因此应尽可能降低 培养基配料浓度（如玉米粉、豆饼粉的浓度）。培养基配料浓度（如玉米粉、豆饼粉的浓度）。 d. 对发酵液进行预处理，改善滤液性质。对发酵液进行预处理，改善滤液性质。 36 过滤设备过滤设备 内装微孔滤膜 进液口 出液口 微孔滤膜滤器微孔滤膜滤器 37 38 生化分离中，工业规模过滤设生化分离中，工业规模过滤设 备主要有加压叶滤机、板框过备主要有加压叶滤机、板框过 滤机、旋转真空过滤机。滤机、旋转真空过滤机。 39 板框压滤机板框压滤机 plate and frame filter 板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的板框压滤机的过滤推动力来自泵产生的 液压或进料贮槽中的气压。液压

17、或进料贮槽中的气压。 广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放 线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。 适合于固体含量适合于固体含量1-10%1-10%的悬浮液的分离。的悬浮液的分离。 40 2.2 2.2 细胞破碎细胞破碎 理解：理解：各种细胞破碎方法、原理、优缺各种细胞破碎方法、原理、优缺 点及其适用范围。点及其适用范围。 应用：应用：采用不同的细胞破碎方法对细胞采用不同的细胞破碎方法对细胞 进行不同程度的破碎。进行不同程度的破碎。 41 一、概述一、概述 (大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，大多数情况下，

18、抗生素，胞外酶，一些多糖， 及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。 (有些目标产物存在于生物体中。有些目标产物存在于生物体中。 l尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是 在细胞内沉积。在细胞内沉积。 l脂类物质和一些有用酶包含在生物体中。脂类物质和一些有用酶包含在生物体中。 42 *细胞破碎（细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力）技术是指利用外力 破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的 产物成分释放出来的技术。产物成分释放出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的

19、非分泌细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌 型生化物质（产品）的基础。型生化物质（产品）的基础。 为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了 解各种生物细胞壁的组成和结构。解各种生物细胞壁的组成和结构。 43 二、常见细胞壁的结构二、常见细胞壁的结构 细菌细菌酵母酵母霉菌霉菌 葡聚糖 糖蛋白 蛋白质 几丁质 44 三、细胞破碎技术三、细胞破碎技术 压缩/撞击 作用 剪切 作用 撞击法 45 机械破碎机械破碎 捣碎法捣碎法 研磨法研磨法 匀浆法匀浆法 超声法超声法 物理破碎物理破碎 温度差破碎法温度差破碎法 压力差破碎法压力差破碎法 化学破碎化学破碎 有

20、机溶剂有机溶剂 表面活性剂表面活性剂 酸碱酸碱 酶促破碎酶促破碎 自溶法自溶法 外加酶制剂法外加酶制剂法 通过机械运动产生的剪切通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。力，使组织、细胞破碎。 通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构使组织、细胞的外层结构 破坏，而使细胞破碎。破坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细通过各种化学试剂对细 胞膜的作用，而使细胞胞膜的作用，而使细胞 破碎破碎 通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎而达到细胞破碎 四

21、、细胞破碎方法及其原理四、细胞破碎方法及其原理 46 （一）机械法（一）机械法 机械破碎法又可分为机械破碎法又可分为 高压匀浆破碎法（高压匀浆破碎法（homogenizationhomogenization） 高速珠磨破碎法（高速珠磨破碎法（bead grindingbead grinding） 超声波破碎法（超声波破碎法（ultrasonicationultrasonication） 47 1 1 高压匀浆法高压匀浆法 高压匀浆又称高压剪切破碎。高压匀浆器的 破碎原理是：细胞悬浮液在高压作用下从阀 座与阀杆之间的环隙高速(可达到450m/s)喷 出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击 作用后

22、，急剧释放到低压环境，从而在撞击 力和剪切力等综合作用下破碎。高压匀浆器 的操作压力通常为50-70MPa。 48 49 50 高压匀浆法中影响细胞破碎的因素主要有压力、 循环操作次数和温度。细胞破碎率S与操作压力 P和循环操作次数N之间的关系可表达为 细胞破碎率用胞内产物释放率表示,是单位质量 细胞的产物释放量，mg/cell ba Nkp S 1 1 ln max R R S 51 式中：式中：S S 破碎率，为破碎率，为N N次循环后，蛋白次循环后，蛋白 质的释放量质的释放量R R与最大释放量与最大释放量RmaxRmax之比；之比； k k 与温度有关的速度常数；与温度有关的速度常数；

23、P P 操作压力，操作压力，MPaMPa； 、b b 与微生物种类和培养条件有关与微生物种类和培养条件有关 的常数。的常数。 52 高压匀浆法适用于酵母和大多数细菌细胞的 破碎，料液细胞浓度可达到20左右。团状 和系状菌易造成高压匀浆器堵塞，一般不宜 使用高压匀浆法。高压匀浆操作的温度上升 约2 310MPa，为保护目标产物的生物 活性，需对料液作冷却处理，多级破碎操作 中需在级间设置冷却装置。因为料液通过匀 浆器的时间很短，通过匀浆器后迅速冷却， 可有效防止温度上升，保护产物活性。 53 2 珠磨法珠磨法 bead mill u珠磨是常用的方法珠磨是常用的方法 u细胞悬浮液与极细的玻璃小细胞

24、悬浮液与极细的玻璃小 珠、石英砂、氧化铝等研磨珠、石英砂、氧化铝等研磨 剂（直径小于剂（直径小于1mm）一起快）一起快 速搅拌或研磨，研磨剂、珠速搅拌或研磨，研磨剂、珠 子与细胞之间的互相剪切、子与细胞之间的互相剪切、 碰撞，使细胞破碎，释放出碰撞，使细胞破碎，释放出 内含物。内含物。 u在工业规模的破碎中，常采在工业规模的破碎中，常采 用高速珠磨机用高速珠磨机 WSKWSK卧式高效全能珠磨机卧式高效全能珠磨机 54 （1）高速珠磨机工作原理）高速珠磨机工作原理 l 磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的圆盘搅拌器磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的圆盘搅拌器 高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃小珠相互搅

25、动；高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃小珠相互搅动； l 细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起 l 在出口处，旋转圆盘和出口平在出口处，旋转圆盘和出口平 板之间的狭缝很小，可阻挡玻板之间的狭缝很小，可阻挡玻 璃小珠，使不被料液带出。璃小珠，使不被料液带出。 l 由于操作过程中会产生热量，由于操作过程中会产生热量， 故磨室还装有冷却夹套，以冷故磨室还装有冷却夹套，以冷 却细胞悬浮液和玻璃小珠。却细胞悬浮液和玻璃小珠。 55 珠磨法破碎操作时，产生大量的热能。但有效能 量利用率仅为1左右。 在设计操作时应充分考虑换热能力问题。 珠磨法适用于绝大多数微生

26、物细胞的破碎，但 与高压均质法相比，影响破碎率的操作参数很多， 操作过程的优化设计较复杂。 56 珠磨法(Bead milling)破碎细胞可采用间歇或连续操 作。两种情况下细胞的破碎动力学均可近似表示 其中k为破碎速率常数 t在间歇操作时为破碎操作时间，连续操作时为细 胞悬浮液在破碎室内的平均停留时间 kt S 1 1 ln Q V t 57 式中：式中： S S 破碎率；破碎率； kk破碎速率常数；破碎速率常数； k k与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、 玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等玻璃小珠装量和珠体直径，以及温度等 相关。相关。 58 喷雾

27、撞击法喷雾撞击法 细胞是弹性体，比一般的刚性固体例子难于破碎。将细胞冷冻 使其成为刚性球体，降低破碎的难度。喷雾撞击破碎正是基于这样 的原理。 如下图，细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速度为每 分钟数千 ），形成粒径小于50微米的微粒子。高速载气(如N2， 流速为300m/s)将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻 结的细胞发生破碎。 喷雾撞击破碎的结构喷雾撞击破碎的结构 59 与珠磨法和高压均质法相比， 本方法中，细胞破碎 仅发生在与撞击板撞击的瞬间，细胞破碎程度均匀，可 避免细胞反复受力发生过度破碎的现象 细胞破碎程度可通过无级调节载气压力（流速）控 制，避免细胞内部结构的破坏，适

28、用于细胞器（线粒体、 叶绿体等）的回收。 喷雾撞击破碎适用于大多数微生物细胞和植物细胞 的破碎，通常处理细胞悬浮液质量浓度为100200g/L。 实验室规模的撞击破碎器间歇处理能力约50500mL， 而工业规模的连续处理能力在10L/h以上。 60 针对目标产物的性质（如相对分子质量、 分子形 态、稳定性等），选择合适的细胞破碎法，并确定适 宜的破碎操作条件是非常重要的。 如核酸相对分子质量很大，破碎中易受剪切损伤。 利用高压均质、珠磨、超声波和喷雾破碎等数种机械 破碎器破碎大肠杆菌，提取质粒DNA的研究表明，只 有珠磨法的完整质粒收率在90以上，而其他方法的 收率低于50。 61 超声波破碎

29、超声波破碎 1. 超声波破碎法(Ultrasonication)利用发射 1525kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 2. 超声波破碎的机理是：在超声波作用下 液体发生空化作用空化作用(cavitation)，空穴的形 成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪产生极大的冲击波和剪 切力，使细胞破碎切力，使细胞破碎。超声波的细胞破碎 效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、 声能有关。 62 JY92-II D超声波超声波 细胞破碎机细胞破碎机 63 超声波破碎的适用范围超声波破碎的适用范围 超声波破碎适用于多数微生物的破碎。超声波破碎适用于多数微生物的破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，一般杆菌比球菌易破碎，

30、G-细菌比细菌比G+细菌易细菌易 破碎，对酵母菌的效果较差。破碎，对酵母菌的效果较差。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性 活性物质失活。活性物质失活。 超声波破碎的有效能量利用率极低。超声波破碎的有效能量利用率极低。 由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大，由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大， 但但实验室小规模细胞破碎中常用。实验室小规模细胞破碎中常用。 64 技术技术原理原理效果效果成本成本破碎率破碎率举例举例 高压匀浆法高压匀浆法 (孔型孔型) 须使细胞通过小孔，须使细胞通过小孔， 使细胞受到剪切力使细胞受到剪切力 而破碎而破碎 剧烈剧烈

31、适中适中50% 细胞悬浮液细胞悬浮液 大规模处理大规模处理 珠磨破碎法珠磨破碎法 细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁 珠剪切碰撞珠剪切碰撞 剧烈剧烈便宜便宜90% 细胞悬浮液细胞悬浮液 和植物细胞和植物细胞 的大规模处的大规模处 理理 超声波法超声波法 用超声波的空穴作用超声波的空穴作 用使细胞破碎用使细胞破碎 适中适中昂贵昂贵50% 细胞悬浮液细胞悬浮液 小规模处理小规模处理 不同机械破碎方法的比较不同机械破碎方法的比较 65 （二）化学和生物化学渗透 酸、碱处理 化学试剂处理 酶溶 66 1、酸碱处理、酸碱处理 蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其 荷电性质，使蛋白质之间或蛋白质与其 他物质

32、之间的相互作用力降低而易于溶 解。因此，利用酸碱调节pH值，可提高 目标产物溶解度 。 67 2、化学试剂处理、化学试剂处理 用表面活性剂(如十二烷基硫酸钠，Triton X 100等)、螯合剂(如乙二胺四乙酸，简称EDTA)、 盐(改变离子强度)或有机溶剂(苯、甲苯等)处理 细胞，可增大细胞壁通透性。脲(urea)和盐酸胍 (guanidine HCl)等变性剂(chaotropic agent)能破 坏氢键作用，降低胞内产物之间的相互作用， 使之容易释放。 68 3、酶溶、酶溶 酶溶法(Enzymatic lysis)利用溶解细胞壁 的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分 或完全破坏后，再利用

33、渗透压冲击等方 法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的 通透性。 69 外加酶法外加酶法 常用的溶酶常用的溶酶 溶菌酶溶菌酶 蜗牛酶蜗牛酶 葡聚糖酶葡聚糖酶 蛋白酶蛋白酶 纤维素酶纤维素酶 糖苷酶糖苷酶 肽键内切酶肽键内切酶 壳多糖酶壳多糖酶 70 酶解法的优缺点酶解法的优缺点 优点：优点： u发生酶解的条件温和。发生酶解的条件温和。 u能选择性地释放产物。能选择性地释放产物。 u胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整。胞内核酸等泄出量少，细胞外形较完整。 u与机械法结合大大提高破碎率。与机械法结合大大提高破碎率。 缺点：缺点： 溶解酶价格高。溶解酶价格高。 溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶溶酶

34、法通用性差（不同菌种需选择不同的酶) )。 71 1. 溶菌酶(lysozyme)适用于革兰氏阳性菌细胞壁的 分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使 之更有效地作用于细胞壁； 2. 酵母细胞的酶溶需用Zymolyase(几种细菌酶的混 合物)、-1,6葡聚糖酶(-1，6-dextranase)或甘 露糖酶(mannanase)； 3. 破坏植物细胞壁需用纤维素酶(cellulase)。 72 化学渗透法比机械破碎速度低，效率差， 并且化学或生化试剂的添加形成新的污 染，给进一步的分离纯化增添麻烦。但 是，化学渗透法比机械破碎的选择性高， 胞内产物的总释放率低，特别是可有效 地抑制核酸的释放，料液粘度小，有利 于后处理过程。 73 （三）物理渗透法 渗透压冲击法 冻结融化法 74 （1 1）渗透压冲击法）渗透压冲击法 渗透压冲击是较温和的一种破碎方法 通过渗透压的改变，引起细胞快速膨胀而破裂。通过渗透压的改变，引起细胞快速膨胀而破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用 酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗 生素等