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文档简介

1、蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃

2、蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇

3、螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁

4、薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈

5、螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃

6、蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇

7、蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁

8、蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅

9、薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀

10、螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇

11、蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁

12、蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅

13、蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀

14、蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄

15、螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈

16、薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节

17、袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿

18、蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄

19、薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈

20、螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂

21、薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆

22、袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁

23、虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈

24、蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂

25、螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅蚀肇肇薀薆蚄腿莃蒂螃芁薈螁螂羁莁蚇螁肃薇蚃螀芅蒀蕿蝿莈节袇螈肇蒈螃螈膀芁虿螇节蒆薅袆羂艿蒁袅肄蒄螀袄芆芇螆袃荿薃蚂袂肈莅薈袂膁薁蒄袁芃莄螂袀羃蕿蚈罿肅莂薄羈膇薈蒀羇荿莀衿羇聿膃螅羆膁葿蚁羅芄芁薇羄羃蒇蒃羃肆芀螂肂膈蒅蚈肁芀芈薄肁羀蒄薀肀膂莆袈聿芅薂螄肈莇莅肀蒆蒆罿羆肃薈螂袁肂蚁羈膀肁莀螁肆膀蒃羆羂膀薅蝿袈腿螇薂芇膈蒇袇膃膇蕿蚀聿膆蚁袅

26、羅膅莁蚈袁膄蒃袄腿芄薆蚇肅芃蚈袂羁节莈蚅羇芁薀羀袃芀蚂螃膂艿莂罿肈芈蒄螁羄芈薇羇袀莇虿螀膈莆莈薃肄莅蒁螈肀莄蚃薁羆莃莃袆袂莂蒅虿膁莂薇袅肇莁蚀蚇羃蒀荿袃衿葿蒂蚆膈蒈蚄袁膄蒇螆螄肀蒆蒆罿羆肃薈螂袁肂蚁羈膀肁莀螁肆膀蒃羆羂膀薅蝿袈腿螇薂芇膈蒇袇膃膇蕿蚀聿膆蚁袅羅膅莁蚈袁膄蒃袄腿芄薆蚇肅芃蚈袂羁节莈蚅羇芁薀羀袃芀蚂螃膂艿莂罿肈芈蒄螁羄芈薇羇袀莇虿螀膈莆莈薃肄莅蒁螈肀莄蚃薁羆莃莃袆袂莂蒅虿膁莂薇袅肇莁蚀蚇羃蒀荿袃衿葿蒂蚆膈蒈蚄袁膄蒇螆螄肀蒆蒆罿羆肃薈螂袁肂蚁羈膀肁莀螁肆膀蒃羆羂膀薅蝿袈腿螇薂芇膈蒇袇膃膇蕿蚀聿膆蚁袅羅膅莁蚈袁膄蒃袄腿芄薆蚇肅芃蚈袂羁节莈蚅羇芁薀羀袃芀蚂螃膂艿莂 新型纳米结构材料在生物传

27、感器领域的应用综述新型纳米结构材料在生物传感器领域的应用 作者: *摘要:纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1-100nm)或由它们作为基本单元构成的材料,这大约相当于10100个原子紧密排列在一起的尺度。基于新型纳米结构材料的葡萄糖生物传感器的研究基于新型纳米结构材料的葡萄糖生物传感器的研究摘要纳米材料是指在三维空间至少有一维处于纳米尺度范围或以纳米结构为基本单元所构成的材料,其所表现出来的在化学、机械、电子、磁学及光学等方面的特异性能,引起了众多学科领域专家和学者的广泛关注,是20世纪末以来的热门研究课题之一。 随着纳米科技的迅速发展,人们发现,在实际应用中,不仅需要考虑

28、单个纳米粒子的性质,同时要考虑纳米粒子所组成的材料的整体行为。很多研究表明,任何宏观材料的功能均源于组成该材料单元之间相互作用的结果,在一个复杂体系中可以观察到单个组分所不具备的性质。因此,纳米材料的进一步发展是制备或组装纳米结构材料或器件。纳米结构是以纳米尺度的物质单元为基础,按一定的规律构筑或营造的一种新体系。纳米结构的基本构筑单元包括纳米微粒、纳米线、纳米棒,纳米丝等,这些具有特殊性能的纳米尺度单元赋予了由其构筑的有序结构材料不同于本体材料的性质,这为设计具有特殊光、电、催化特性的装置提供了新的选择。生物体内活性物质的分析和检测,对获取生命过程中的化学与生物信息、了解生物分子的结构与功能

29、的关系、阐释生命活动的机理以及疾病的诊断都具有重要的意义。随着生命科学研究的不断深入,人们对生物体的研究也由器官、组织达到了细胞、单分子层次,我们迫切需要在更加微观的尺度上原位、活体、实时地获取相关生物化学信息,许多传统的、常规的生物分析方法与手段面临着极大的挑战。纳米材料由于其特异的表面效应、宏观量子隧道效应和量子尺寸效应,其电学、磁学、光学和化学性质等呈现出常规材料不具备的优越性能。如果将纳米材料用于生物传感器中电极的修饰,基于其尺寸效应、表面效应等,电极将呈现电催化作用,降低底物过电位,使可能的干扰及背景降至最小,如果进一步将纳米材料按一定的规律组装或改造,改善材料的生物兼容性,就有可能

30、构造出满足生物分子识别过程中保持其生物活性、稳定性以及空间定向的微环境,从而进一步建立生物分子与纳米微粒的连接,开发新型的纳米生物传感器,实现对目标分子的识别和检测。关键词:新型纳米结构材料、生物传感器、生物技术、酶传感器、组织传感器、微生物传感器、免疫传感器、场效应晶体管生物传感器。 前言:从科学技术发展的历史看,一种新技术的实现,往往需要新材料的支持。半导体材料的发明,促使电子技术发生了根本性的变化;20世纪70年代光导纤维的出现造就了现代光通讯技术;高纯度大直径硅单晶的产生促进了超大规模集成电路的发展,也成就了今天如此发达的计算机世界及电子信息业。而20世纪末以来,以“纳米”尺度范围(t

31、hermalenzymeprobe)和酶热敏电阻器 (enzymethermistor)分别研制成功。1980年,在光学传感器一光极的基础上,lubbers等人研制成了测量乙醇的光学生物传感器。这些换能器都是通过测定生化反应中的产物、热效应或是光效应而间接地测定目标物的。20世纪70年代起,人们就开始寻求一种可以直接捕捉敏感源与目标物之间结合过程(如抗体与抗原的结合)的换能器,由此免疫传感器的产生。另外,在酶电极中还广泛应用着一种促进酶活性中心与电极表面之间电子转移的物质一介体(mediator)。 1976年,可溶性的六氰合铁酸盐首次作为介体加入敏感膜中充当酶与电极之间的电子传递剂,以提高传

32、感器的性能。现在,介体已广泛应用于电流型酶电极制作中。medisense公司以此为基础发展了能大规模生产具有高重现性【1】 酶电极的丝网印刷技术,该技术推动了生物传感器的发展。20世纪90年代初,生物传感器的研究进入第二阶段,这时期的生物传感器为第二代。第二代生物传感器的特点是使用抗体或受体蛋白作分子识别组件,换能器的选用则更为多样化,诸如场效应管,光纤,压电晶体,声表面波器件等。21世纪发展的生物传感器为第三代产品,随着微加工技术和纳米技术的进步,生物传感器不断地向微型化、集成化方向发展,便携式测试仪已得到快速发展。过去4年中,生物传感器研发的方向有了显著变化,许多新的生物技术的出现,如生物

33、表达化学、表面定性、分子标记以及纳米科技,带动了生物传感器在各种环境下应用的增长t7。当今纳米材料在生物传感器中的应用,使其研究进入崭新阶段。在生物传感器研究领域内,集纳米技术、生物技术和自组装方法于一体,实现具有高酶活性第一章绪论的三维有序组装制备生物传感器的报道不多。从已有的一些报道来看,加入纳米粒子后制备的生物传感器的灵敏度得到了很大提高。响应时间的缩短,检测的线性范围的增大,都表明了生物传感器性能的提高。morrin等人基于可加工的传导聚苯胺纳米颗粒制成了生物传感器。国内外学者还对纳米颗粒增强葡萄糖氧化酶(god)生物传感器开展了大量研究。结果表明:葡萄糖【2】生物传感器具有选择性高、

34、测试简便、快速的特点,是检测葡萄糖浓度最常用的方法。人的血液和体液中含有许多干扰物质,通过引入纳米颗粒,还可以改善葡萄糖传感器抗干扰性能。二、生物传感器的工作原理仁8一1011、生物传感器的原理生物传感器是一种集现代生物技术与电子技术为一体的高科技产品。它是应用生物化学和电化学反应原理,使用具有特异选择性的生物元件,如酶、抗体、受体、微生物、组织、dna及单克隆等为敏感材料,与适当的化学换能器相结合产生的一种快速检测各种物理、化学和生物量的一种先进测试仪器,这种新型的传感器具有分子水平的识别功能。由于它容易进行电学放大,因而可以进行快速、稳定、简便、灵敏、直观无试剂分析测量。敏感材料是对目标物

35、进行选择性作用的生物活性单元。最先被使用的是具有高度选择催化活性的酶。酶或是以物理方法(包埋、吸附等),或是以化学方法(交联、聚合等)被固定在化学传感器的敏感膜中,然后以化学电极作为换能器测定酶催化目标物反应所生成的特定产物的浓度,从而间接地测定目标物的浓度。随着物理检测手段的引入,人们已成功地把抗体、dna聚合物、核酸、细胞受体和完整细胞等具有特异选择性作用功能的生物活性单元用作了敏感材料。换能器是能捕捉敏感材料与目标物之间的作用过程的器件,主要包括电化学电极、光学检测元件、热敏电阻、场效应晶体管、压电石英晶体及表面等离子共振器件等tn一16。最早应用的换能器就是前面所提到的电化学传感器。根

36、据产生的电信号类别,可将其分为电流型和电位型两大类。电流型传感器主要基于探测生物识别或化学反应中的电活性物质,通过固定工作电极的电位给电活性的电子转移反应提供驱动力,探测电流随时间的变化,该电流直接测量了电子转移反应的速度,反映了生物分子识别的速度,即该电流正比于待测物质的浓度。电位型第一章绪论传感器将生物识别反应转换为电信号,该信号与生物识别反应过程中产生或消耗的活性物质浓度对数成正比,从而与待测物质浓度的对数成正比。电位型离子选择电极的选择性渗透离子导电膜可设计成与待测离子相关的产生电位信号的敏感膜,测试【3】 在电流为零的条件下进行。生物传感器分类生物传感器在最近10余年发展非常迅速,他

37、们大致可分为以下几类:酶传感器、组织传感器、微生物传感器、免疫传感器、场效应晶体管生物传感器。酶传感器利用酶在生化反应种特殊的催化作用,可使糖类、醇类、有机酸、氨基酸、激素、三磷酸腺营等生物分子,在常温下迅速被分解或氧化。反应过程中消耗或产生的化学物质即可用转换器转变为电信号记录下来。目前国际上已经研制成功的酶传感器有十几种,如葡萄糖、乳酸、尿素、尿酸、过氧化氢、胆固醇和氨基酸等传感器。但酶传感器仍在不断地进行研究和开发,以达到酶传感器的完全实用化和商品化。酶传感器的结构:主要是由感受器酶膜和转换器基础电极组合而成。用于酶传感器的基础电极,常用的有氧、过氧化氢、二氧化碳、氨以及ph电极等。近年

38、来又开发了某些介体修饰的碳、铂、把和金等基础电极,获得了良好的效果。组织传感器最早提出组织传感器的是rachnitz,当时是将猪肾组织切片覆盖在氨气敏电极上制备成可测定谷氨酞胺的传感器。组织传感器实际上也是酶传感器,因为酶都是从动植物的器官,组织中提取出来的,经过纯化成为单一的酶。组织传感器是利用天然组织中酶的催化作用,所以也是一种酶传感器。由于这种酶存在于天然的动植物组织内,得到其它生物分子的协同作用,因此十分稳定,制备成的传感器的寿命也较长。另外,人工提取后纯化过的酶,不仅价格昂贵,而且酶蛋白分子一旦离开了生物环境,它的寿命也就大大缩短。到目前为止,只有少数如葡萄糖氧化酶等比较稳定,可以较

39、长期的在一定的低温下保存,因此,如用动植物第一章绪论组织代替酶,则取材容易,易于推广使用。微生物传感器微生物有两类,一类是好氧性的,另一类是厌氧性的。好氧性微生物在繁殖时需要消耗大量的氧。因此可以从氧浓度的变化来观察微生物与底物的反应情况。微生物传感器的测定原理有二种类型:一类使利用微生物同化底物时消耗氧的呼吸作用;另一类是利用不同的微生物含有不同的酶,这和动植物组织一样,把它作为酶源。微生物种类繁多,而他们也各有同化的对象和条件。荧光假单胞菌,能同化葡萄糖,芸苔丝抱酵母可以同化乙酸,因此可以分别用来制备葡萄糖和乙酸传感器。这两种细菌在同化底物时,均将消耗溶液【4】微生物传感器常见的有生物需氧

40、量 (bod)传感器,变中的氧,因此可用氧电极来测定。异传感器,l一天冬氨酸传感器和尿酸传感器。免疫传感器放射免疫法是一种灵敏度极高的分析方法,在临床上常用来检验各种抗体和抗原。目前,利用抗体和抗原之间高的选择性,各种免疫传感器的研制已经获得初步成功。免疫传感器是由特异抗体与载体结合而成,其对特定的抗原分子具有选择性的识别能力。这类传感器分为非酶标记型和酶标记型。非酶标记型传感器检测的是抗原一抗体复合物所引起的膜电位的变化,它已在诊断梅毒和血型鉴定等方面获得成功。酶标记型传感器是酶免疫测定方法的扩展,它的选择性取决于抗体对抗原的识别能力,灵敏度取决于酶的化学放大作用,这种传感器能够测定10一“

41、一10一”克/毫升浓度的甲胎蛋白和人绒毛膜促性腺激素等,这些激素与某些癌症的诊断有关。场效应晶体管生物传感器场效应晶体管 (fet)简称场效应管,是利用电场效应来控制输出电流大小的半导体器件。场效应管生物传感器主要由感受器和场效应管两部分构成,感受器是固定着具有分子识别功能的生物物质的敏感膜,而场效应管则起信号转换的作用。研究使用的场效应管基本上为了离子敏场效应晶体管(isfet),在isfet的第一章绪论敏感栅表面固定生物功能物质,再加上参比电极并连接好相应的测量线路,便构成了完整的场效应管生物传感器,当固定的生物功能物质与待测物质接触时,发生特定的反应,引起敏感膜附近局部的ph值或其它离子

42、浓度的变化,从而导致isfet敏感膜电位的改变,指示出待测物质的量17一19。生物传感器的应用研究21世纪是生命科学的世纪,随着“人类基因组工作草图”的完成、纳米生物技术和纳米微电子加工技术的出现,为生物传感器的发展带来巨大的变革。生物传感器具有选择性高、分析速度快、仪器操作简单和价格低廉等特点,可以进行在线及活体分析,从而为环境监测、食品医药工业、生物医学及军事医学领域直接带来新技术革命120一30。20世纪80年代起,国际上对生物传感器进行广泛的研究和探索,近年来已经研制出一系列的有实用价值的生物传感器。在环境监测中的应用近年来,环境污染问题日益严重,人们迫切希望拥有一种能对污染物进行连续

43、、快速、在线监测的仪器,生物传感器满足了人们的需要。例如,大气环境监测中,50:是酸雨酸雾形成的主要原因,传统的检测方法很复杂。marty等人将亚细胞类脂类固定在醋酸纤维膜上,和氧电极制成安培型生物传感器,可对酸雨和酸雾样品溶液进行检测。生化需氧量(bioehemiealoxygendemand,bod)的测定是监测水体被有机物污染状况的最常用指标,常规的bod测定需要5天的培养期,操作复杂、重复性差、耗时耗力、干扰性大,不宜现场监测。目前,研究人员分离了2种新的酵母菌种spti和sptz,并将其固定在玻碳电极上以构成微生物传感器,用于测量bod,其重复性误差为月0%。该传感器用于纸浆厂污水中

44、bod的测定,其测量最小值可达 2mgl一,所用时间为 5min。用耐高渗透压的酵母菌种作为敏感材料的一种新型微生物传感器,在高渗透压下可以正常工作,并且,其菌株可长期干燥保存,浸泡后即恢复活性,为海水中bod的测定提供了快捷简便的方法。【5】除微生物传感器外,一种光纤生物传感器己经研制出来,用于测定河水中较低的bod值,该传感器的反应时间是巧min,最适工作条件为30,ph=7,传感器系统几乎不受氯离子的影响(在 1000mgl一范围yellowspringsinstrliment公司首次成功地将葡萄糖酶电极推向市场。miles公司 1976年将酶电极用于人造胰脏中的血糖监控。 1987年,

45、medisense公司推出丝网印刷【6】据 kaloralnainformation近日发布电极。1990年,pharlnacia公司将spr技术市场化。的一项新研究报告医疗与生物传感器和传感器系统:市场、应用和全球竞争称,2005年生物传感器营业收入达到了29亿美元,而医疗应用占该销售额的最大份额。在发酵生产中的应用在微生物发酵过程中,检测多种有关的生化参数(生物量/细胞活性、底物/营养、产物/代谢物),是生物技术领域研究者和工程师们有效地对过程进行控制的必要前提。在各种生物传感器中,微生物传感器最适合发酵工业诸多化学、生第一章绪论物参数的测定。因为发酵过程中常存在对酶的千扰物质,并且发酵液

46、往往不是清澈透明的,不适用于光谱等方法测定。而应用微生物传感器则极有可能消除干扰,并且不受发酵液混浊程度的限制。同时由于发酵工业是大规模的生产,微生物传感器成本低、设备简单的特点使其在应用中具有更大的优势。在食品工业中的应用生物传感器在食品分析中的应用包括食品成分、食品添加剂、有害毒物及食品鲜度等的测定分析。食品成分分析:在食品工业中,葡萄糖的含量是衡量水果成熟度和贮藏寿命的一个重要指标。已开发的酶电极型生物传感器可用来分析白酒、苹果汁、果酱和蜂蜜中葡萄糖的含量。食品添加剂的分析:亚硫酸盐通常用作食品工业的漂白剂和防腐剂,采用亚硫酸盐氧化酶为敏感材料制成的电流型二氧化硫酶电极可用于测定食品中的

47、亚【7】2002年,morales等人研究的一种聚四氟乙烯一酪氨酸酶生物传感器可以测硫酸含量。量食物中的安息香酸,原理是基于安息香酸对酶的抑制作用。该生物传感器的电极可以长时间稳定运行,测量极限为9.0/10一 7mol.l一,并且它的专一性好,在同时含有众多其他物质的食物中可以准确地检测安息香酸的浓度而不受影响。用该生物传感器对两类不同的样品进行了测量:高度不沾水的蛋黄酱和可乐类饮料,不需要任何样品的处理过程,其结果令人满意。随着生物传感器在食品、医药、环境和过程监控等方面应用范围的扩大,要求传感器既不干扰测定对象而又不被测足对象中的其他相关组分影响,要满足这一要求,同时又能得出高精度的测量

48、结果,不能只依靠对敏感元件的改进,而需要建立一套一体化、微型化的优化系统(包括进样、处理和测量)才能得到满意的结果。新的快速分析方法、新的生物仪器设备的来源、生物传感器与纳米技术、信息技术、微电子技术的交叉,将促使更多、更新的生物传感器的产生。未来的生物传感器将会和计算机完美紧密的结合,能够自动采集数据、处理数据,更科学、更准确地提供结果,实现采样、进样、最终完成检测的自动化系统。同时,芯片技术也将越来越多地进入传感器领域,实现检测系统的集成化、一体化。相信随着一些关键技术(如固定化技术)的进一步完善,随着人们对生物体认识地不第一章绪论断深入,随着各学科地不断发展,生物传感器必将在各个领域发挥

49、更大的作用。酶生物传感器的发展及应用酶生物传感器是生物传感器领域中研究最多的一种类型。它是利用酶在生化反应中的特殊催化作用,当酶浸入被测溶液,待测底物进入酶层的内部并参与反应,大部分酶反应都会产生或消耗一种被电极测定的物质,当反应达到稳态时,电活性物质的浓度可以通过电位或电流的模式进行测定。最早的酶分析法是在水溶液中进行的,由于酶在水溶液中很不稳定且只能与底物作用一次,难于重复利用。为此发展了酶的固定化技术,继而发展了酶生物传感器技术。1962年首次在氧电极的基础上提出了酶传感器的原理与设计,1967年updik和hick研制出第一个以铂电极为基体的葡萄糖氧化酶传感器。此后酶生物传感器技术迅速

50、发展成为生物、化学、物理、医学和电子技术等多学科互相渗透的高新技术口。酶生物传感器的发展酶生物传感器有两个主要组成部分:感受器(固定化酶)和换能器。作为生物敏感基元的感受器(固定化酶)是整个生物传感器的技术核心。感受器的制备包括选择最佳的载体材料以及在载体上固定化酶。换能器可以感知酶与待测物质特异性结合产生的微小变化,并把这种变化转变成其他可以记录的信号,如:电信号、热信号以及密度、质量等性质的变化。换能器质量的好坏决定了传感器灵敏度的高低。酶层god0x十葡萄糖一葡萄糖酸+godred+mox一godox+加介ed电极mred一【8】也不涉及hzoz,而是利用具有较低氧化电mox+ne利用电

51、子传递媒介体既不涉及仇,位的传递媒介体在电极上产生的氧化电流,对底物进行测定,从而避免了其他电活性物质的干扰,提高了测定的灵敏度和准确性。电子传递媒介体在近十年来得到迅速发展,可以使用的传递媒介体也越来越多。据其作用机理主要分(1)含第一章绪论有过渡金属元素的化合物或配合物,通过过渡金属的价态变化来传递电子。(2)通过分子中的特殊官能团的结构变化传递电子。这些化合物的共同特点是含有大7t键的环及与环相连的双键,这些双键容易打开并再形成。常见的媒介体有二茂铁及其衍生物。hale等人采用二茂铁修饰硅氧烷聚合物,再用此聚合物与葡萄糖氧化酶混合,制成性能稳定、电子传递速率较高的电极。用循环伏安法和稳态

52、电势法测得:由上述方法制得的葡萄糖生物传感器对小于1,0/10一 5mol.l一的【9】另外还有钉及其衍生物、铁氰酸低浓度葡萄糖溶液也可快速响应(响应时间小于lmin)。盐、酮类341、饿类351、有机染料、有机介体和有机导电盐等。其中有机介体和有机导电盐是一类新型的媒介体,它对生物大分子的氧化有着明显的催化作用。实际应用过程中,媒介体的部分溶解或媒介体的扩散离开电极表面限制了这类传感器的稳定性和寿命。第三代酶生物传感器为直接电极电催化,指在无酶介体存在下,利用酶与电极间的直接电子传递制作的酶传感器,仍以葡萄糖氧化酶催化葡萄糖为例:【10】酶层电极godox+葡萄糖葡萄糖酸+godredgod

53、ox+ne由于酶与常规电极之间的直接电子传递较为困难,考虑选择合适的接合剂,将酶共价键合到化学修饰电极上,或将酶固定到多孔电聚合物修饰电极上,【13】cooper等使酶氧化还原活性中心与电极接近,直接电子传递就能够相对容易地进行。人通过碳化二亚胺缩合,把细胞色素c共价键合到乙酞半肤胺酸修饰金电极上,使细胞色素c与修饰电极间的直接电子传递得以发生,由此做成的生物传感器对超氧化合物有很好的响应。近年来,实现酶在电极上的固定化,以实现电极上的直接电子传递的材料主要有:有机导电聚合物膜、有机导电复合材料膜、金属纳米颗粒或金属和非金属纳米颗粒。第三代酶生物传感器由于不再需要电子授体来完成酶催化循环,可以

54、避开由于引进外界媒介体所带来的复杂性和局限性,可能在选择性、灵敏度和测试范围等方面有新的突破。不过由于酶分子的电活性中心深埋在分子的内部,且在电极表面吸附后易发生变形,要在酶与电极间直接进行电子转移比较困难。酶的固定化酶作为一种生物催化剂,具有高选择性、催化反应条件温和、无污染等特点,广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用,并且反应后混入产品,纯化困难,使其应用受到限制。20世纪60年代兴起的固定化酶技术为这些问题提供了有效的解决手段,从而成为酶工程领域中最为活【14】 跃的研究方向之一。酶生物传感器中的生物活性物质是传感器的核心部分,然而他们一般都溶

55、于水,其本身也不稳定,需要固定在各种载体上,才能延长其活性。生物活性物质的固定化技术是生物传感器制作的核心,它既要保持生物传感器的稳定性、灵敏度和选择性等主要性能,又决定着生物传感器是否有研究和应用价值。酶的固定化,就是将酶束缚在特殊的载体上,使它与整体相分隔,但仍能与底物进行分子交换,这种固定化了的酶既具有酶的催化特性,又具有能回收、反复使用等特点,使用寿命和贮存寿命都比溶液形式的酶长。固定化酶的性能取决于固定化酶所使用载体材料的性质和固定化方法,而酶的固定化程度直接决定酶生物传感器的检测性能。纵观生物传感器发展的历史可知,生物传感器的发展史就是固定化技术不断改进和完善的历史。【15】 目前

56、被广泛研究的固定化技术主要有吸附法、包埋法、共价键合法和交联法。吸附法共价结合法包埋法,生物活性物质在电极表面的物理吸附是一种较为简单的固定化技术。吸附法主要是通过酶分子极性键、氢键、疏水键以及静电等作用,将酶吸附于不溶性载体上。此法多以无机材料为载体,主要包括多孔玻璃、活性炭、氧化铝等。酶在电极上的吸附一般是通过含酶缓冲溶液的挥发进行的,通常温度为4,因此,酶不会发生热降解。吸附后,还可以通过交联法来增加稳定性。物理吸附具有无需化学试剂、极少的活化和清洗【16】 步骤,很少发生酶降解,对酶分子活性影响较小等优点。但对溶液的ph值变化、温度、离子强度和电极基底较为敏感,需要对实验条件进行相当程

57、度的优化。该方法由于存在吸附过程的可逆性,生物活性单元易从电极表面脱落,而且同其他固定化技术相比,生物活性单元的寿命短。包埋法迄今为止,应用最为普遍的固定化技术是采用凝胶/聚合物包埋,它能将酶分子或细胞包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构中。此法多以天然或合成的聚合物凝胶为载体,如:树脂、藻酸盐、聚丙烯酞胺、聚乙烯醇等。包埋法一般可采用温和的实验条件及多种凝胶/聚合物;对酶活性的影响较小;膜的孔径和几何形状可任意控制;包埋的酶不易泄露,并可以采用其他固定化技术进一步改进包埋的稳定性。此外,包埋法还具有过程简单、可对多种生物活性单元进行包埋的优点。这种固定化技术在某些方面也具有一定的局限,如

58、必须控制很多的实验因素;聚合物形成过程中产生的自由基对生物活性单元可能会产生失活作用;聚合物的空间结构局限于测定较小尺寸的物质,而且由于大的扩散排阻使响应时间增加。采用这种固定化技术时,通常采用物理方法将凝胶/聚合物限制在电极表面,这使生物【17】 传感器难以微型化。共价键合法共价键合法是酶与载体以共价键结合的固定化方法。归纳起来有两类:一是将载体有关基团活化,然后与酶有关基团发生偶联反应;另一种是在载体上接上一个双功能试剂,然后将酶偶联上去。共价键合法的优点是酶与载体结合牢固,但是该方法操作复杂,反应条件苛刻,会引起酶蛋白高级结构变化,破坏部分活性中心,因此往往不能得到比活力高的固定化酶,酶

59、活回收率一般为30%左右,第一章绪论甚至底物的专一性等酶的性质也【18】 会发生变化。交联法通过采用双功能团试剂,在生物活性单元之间、生物活性单元与凝胶/聚合物之【19】 间交联形成网状结构而使生物活性单元固定化的方法称为交联法。最常用的交联剂为戊二醛,能在温和的条件下与蛋白质的自由氨基反应。生物传感器与其他技术联用:1、与微渗析技术联用微渗析是一种在体取样技术,是在线渗析技术的一个分支。最早由美国和瑞典的研究人员首先提出了这一概念。他们的构思是在动物组织内植入一个“人工毛细血管”,用生理溶液(灌注液)对其进行灌注,组织细胞间液中的分子则亩以通过管壁进入渗析液,然后通过对渗析液中的物质进行分析来反映组织液中物质组成。这一技术自80年代初逐步发展成熟起来,首先成为了实验精神药理学和神经【20】 生理学的

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