金免疫分析技术

1、金免疫分析技术 1、胶体金的制备原理、方法、注意事项、质量鉴胶体金的制备原理、方法、注意事项、质量鉴 定、胶体金保存定、胶体金保存 2、免疫金的制备原理、技术要点免疫金的制备原理、技术要点 3、免疫金免疫金 测定技术测定技术 胶体金（colloidal gold）也称金溶胶（goldsol），是金盐被 还原成原子金后形成的金颗粒悬液。 什么叫胶体金什么叫胶体金 zeta电位可以使胶体金颗粒之间相互排斥，以维持 胶体金的稳定状态。 基础金核 双离子 内层负离子（AuC12） zeta电位 外层离子层 H+分散在胶体间的溶液中 胶体金的制备胶体金的制备 制备原理制备原理 还原法还原法：用一定量的还

2、原剂把一定浓度的金用一定量的还原剂把一定浓度的金 盐溶液还原成金离子。盐溶液还原成金离子。 常用的金盐是氯金酸常用的金盐是氯金酸 还原剂是枸橼酸钠、鞣酸、维生素还原剂是枸橼酸钠、鞣酸、维生素C、白磷、白磷、 硼氢化钠硼氢化钠 胶体金的制备胶体金的制备 制备方法制备方法 氯金酸水溶液加热沸腾搅拌着加入枸橼 酸钠水溶液 金黄色的氯金酸水溶液在 2min内变为紫红色 再煮沸15min冷却后以 蒸馏水恢复到原体积 胶体金的制备胶体金的制备 注意注意 事项事项 1 1）、玻璃容器的清洁容器使用前必须酸洗和硅化）、玻璃容器的清洁容器使用前必须酸洗和硅化 硅化的一般过程硅化的一般过程 用用5%5%的二氯二甲

3、硅烷的氯仿溶液浸泡玻璃容器的二氯二甲硅烷的氯仿溶液浸泡玻璃容器 1min1min，室温干燥后，用蒸馏水冲洗，在干燥备用。，室温干燥后，用蒸馏水冲洗，在干燥备用。 2 2）、试剂、水质和环境）、试剂、水质和环境 使用氯金酸时不能用金属药匙，避使用氯金酸时不能用金属药匙，避 免接错天平秤盘双蒸馏水，实验室尽量无尘免接错天平秤盘双蒸馏水，实验室尽量无尘pHpH值值3.03.05.85.8的的 柠檬酸磷酸盐、柠檬酸磷酸盐、pH5.8pH5.88.38.3的的Tris-HCLTris-HCL和和pHpH值值8.58.510.310.3的硼酸的硼酸 氢氧化钠等缓冲容量大的缓冲系统，但应控制浓度不要太高氢氧

4、化钠等缓冲容量大的缓冲系统，但应控制浓度不要太高 胶体金的制备胶体金的制备 质量鉴定和胶体金保存质量鉴定和胶体金保存 质量鉴定质量鉴定外观检查外观检查 清亮透明悬液清亮透明悬液 颗粒大小与均一性检查颗粒大小与均一性检查 肉眼观察或肉眼观察或 分光光度计扫描或者电镜检查分光光度计扫描或者电镜检查 胶体金保存胶体金保存 洁净玻璃器皿，放入少洁净玻璃器皿，放入少 量防腐剂，少量分装备用量防腐剂，少量分装备用 免疫金免疫金制备制备 胶体金与抗胶体金与抗 原抗体等大原抗体等大 分子物质结分子物质结 合形成合形成 制备制备 原理原理 将蛋白质吸附到胶体金颗粒表面将蛋白质吸附到胶体金颗粒表面 而结合的过程而

5、结合的过程 环境环境pH值和离子强度是影响吸附值和离子强度是影响吸附 的主要因素的主要因素 免疫金的制备免疫金的制备 技术技术 要点要点 胶体金溶液胶体金溶液pHpH值的调配值的调配 0.2molLK2CO3或者或者 0.1molLHCl调整到标记调整到标记 蛋白质带等电点货稍偏碱。蛋白质带等电点货稍偏碱。 通常要经多次试验通常要经多次试验。 蛋白质最适用量的确定蛋白质最适用量的确定 用标记蛋白质作系列稀释，用标记蛋白质作系列稀释， 分别取分别取0.1ml0.1ml蛋白质稀释液加蛋白质稀释液加 入入1ml1ml胶体金溶液中，并设不胶体金溶液中，并设不 加蛋白质的对照管加入加蛋白质的对照管加入

6、10%NaCl10%NaCl溶液溶液0.1ml0.1ml混匀、静混匀、静 置置2 2小时。选以红色不变管中小时。选以红色不变管中 蛋白质含量最低为稳定蛋白质含量最低为稳定1ml1ml胶胶 体金所必需蛋白质的量。体金所必需蛋白质的量。 胶体金的标记胶体金的标记 按照最适比，在电磁按照最适比，在电磁 搅拌下将所需要量的搅拌下将所需要量的 胶体金加入一定量的胶体金加入一定量的 蛋白质溶液中，加入蛋白质溶液中，加入 一定量的稳定剂，调一定量的稳定剂，调 整整pHpH至至8.58.5，离心，离心， 轻吸上清液，用缓冲轻吸上清液，用缓冲 液悬浮，恢复原体积液悬浮，恢复原体积 后再离心，重复操作后再离心，重

7、复操作 2 2、3 3次。次。 胶体金结合物的胶体金结合物的 纯化与鉴定纯化与鉴定 纯化：超速离心法纯化：超速离心法 和凝胶过滤法和凝胶过滤法 鉴定：电镜测定颗鉴定：电镜测定颗 粒的平均直径以及粒的平均直径以及 免疫组化滤纸模型免疫组化滤纸模型 测定结合物的特异测定结合物的特异 性、敏感性性、敏感性 保存保存 用稀释液配制用稀释液配制 成工作浓度保成工作浓度保 存存 金免疫测定技术分类金免疫测定技术分类 斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验 DIGFA 斑点金层析试验斑点金层析试验 DICA （ dot immunogold chromatographic assay） DIJFADIJFA

8、将抗原抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制将抗原抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制 成抗原抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上成抗原抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上 标本中的抗原抗体被膜上的抗体抗原捕获，无关蛋标本中的抗原抗体被膜上的抗体抗原捕获，无关蛋 白随液体滤出白随液体滤出 加入胶体金标记物在渗滤中与相应的抗原抗体结合。加入胶体金标记物在渗滤中与相应的抗原抗体结合。 阳性反应：膜上呈现红色斑点阳性反应：膜上呈现红色斑点 斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验 原理原理 斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验 DIGFA双抗体夹心双抗体夹心 法测抗原法测抗原 DIGFA-间接法测抗体

9、间接法测抗体 抗体结合在微孔滤膜抗体结合在微孔滤膜 的中央的中央 加待测标加待测标 本本 加金标抗体加金标抗体 洁洗涤剂后，洁洗涤剂后，阳阳 性结果，膜中央呈现性结果，膜中央呈现 红色斑点红色斑点 抗原包被在微孔滤膜抗原包被在微孔滤膜 上上滴加待测标本滴加待测标本 加洗涤剂后加洗涤剂后滴加滴加 金标抗抗体金标抗抗体加洗涤加洗涤 剂后，剂后，阳性结果，膜中阳性结果，膜中 央呈红色斑点央呈红色斑点 斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验 DIGFA-间接法测抗体间接法测抗体 阳性阳性 阴性阴性 固相膜固相膜固相固相 抗原抗原 待测待测 抗体抗体 金标二抗人金标二抗人人人IgGIgG 斑点金免疫渗滤试

10、验斑点金免疫渗滤试验 DIGFADIGFA双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原 AB 操作：加样操作：加样A； 加加金标记物金标记物； 洗涤洗涤B， 观察观察 具体步骤如下： （1 1）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本）将反应板平放于实验台上，于小孔内滴加血清标本A 1A 12 2滴，待完全渗滴，待完全渗 入。入。 （2 2）于小孔内滴加金标记物物试剂）于小孔内滴加金标记物物试剂1 12 2滴，待完全渗入。滴，待完全渗入。 （3 3）于小孔内滴加洗涤液）于小孔内滴加洗涤液B 2B 23 3滴，待完全渗入。滴，待完全渗入。 （4 4）判读结果：）判读结果：在膜中央有清晰的淡红色斑点显

11、示者判为阳性反应；反之，在膜中央有清晰的淡红色斑点显示者判为阳性反应；反之， 则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。则为阴性反应。斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度。 斑点金免疫渗滤试验斑点金免疫渗滤试验 原理和免疫渗透试验相同。原理和免疫渗透试验相同。 不同在一个是穿流一个是横流。不同在一个是穿流一个是横流。 DICA 原理原理 斑点金层析试验斑点金层析试验 斑点金层析试验图示斑点金层析试验图示 斑点金层析试验斑点金层析试验 DIGFA 穿流（flow through） DICA 横流（lateral flow） 斑点金层析试验斑点金层析试验 双抗体夹心法双抗体夹心法测抗原测抗原 间接法间接法测抗体测抗体 竞争法竞争法测抗原测抗原 斑点金层析试验斑点金层析试验 C 阴性B 阳性 DICA-DICA-双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原 斑点金层析试验斑点金层析试验 DICA-间接法测抗体间接法测抗体 C 阴性 B 阳性 斑点金层析试验斑点金层析试验 阴性弱阳性阳性 DICA竞争法测抗原竞争法测抗原 检测线颜色强度与SD浓度负相关 斑点金层析试验斑点金层析试验 检测检测HCGHCG，AFPAFP、轮状病毒、轮状病毒、A A族链球族链球 菌、衣原