FISH技术在血液肿瘤中的应用课件

1、FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital 上海市第一人民医院 Shanghai First Peoples Hospital 上海市第一人民医院 血液科 Shanghai First Peoples Hospital 荧光荧光原位杂交原位杂交（FISH） 在血液肿瘤中的应用在血液肿瘤中的应用 2 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital FISH的定义 荧光原位杂交（FISH）是20世纪八十年代在细胞遗 传学、分子遗传学和免疫学相结合的基础上发展起来的新 技术。它利用已知核酸序列作为

2、探针，以荧光素直接标记 或先以生物素或地高辛等半抗原标记后与靶DNA进行杂 交，再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后 在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对标本中待测核酸进 行定性、定位和定量分析。 3 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital FISH技术原理 4 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital FISH技术原理 5 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital FISH技术原理 6 FISH技术在血液肿瘤中的 应

3、用 Shanghai First Peoples Hospital FISH技术原理 7 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital FISH技术原理 8 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital FISH技术原理 9 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital FISH技术原理 10 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital FISH的种类 v间期FISH（Interphas

4、e FISH） v染色体涂染分析（Chromosome painting） v多色FISH（Multicolor-FISH） v反向涂染（Reverse painting） v比较基因组杂交（Comparative genomic hybridization） 11 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital FISH探针的种类和用途 v 着丝粒探针 用于检测染色体数目异常如三体、单体等。 v 亚端粒探针 靠近端粒的200-300Kb为染色体特异性DNA，用于检测 涉及端粒的隐匿性易位。 v 染色体臂或整条染色体涂染探针（WCP） 用于检测

5、染色体易位和标记染色体。 v 序列特异性探针 包括臂、带和基因探针等多种，用于检测基因缺失和重排。 12 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital 血液肿瘤FISH检测常见探针类型 13 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital FISH在血液肿瘤中的应用 检测样本可以是血液、骨髓、石蜡切片 v诊断和鉴别诊断 v治疗和预后分层 v监测疗效（微小残留病灶检测） v识别移植后骨髓细胞来源 14 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospita

6、l 一、诊断和鉴别诊断 v核型分析缺点： 有丝分裂象少或缺如 染色体质量低劣，显带不佳 染色体异常复杂 v分子生物学检测不足： 常见的转录序列来设计引物，扩增的片段长度一般在 100 700bp之间 mRNA剪切方式比较特殊，假阴性结果，易造成漏诊或误诊 15 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital 一、诊断和鉴别诊断 vFISH技术能弥补以上2种技术的不足之处 间期细胞上分析（无需中期分裂象），极大地提高了敏感 性、准确性和可靠性。 对核型提示的染色体异常做进一步鉴定，从“正常核型” 中筛查隐匿的染色体畸变，成为精确的染色体分析不可缺

7、 少的手段。 FISH探针的片段相对较长，常可达数百kb，甚至大于1Mb， 跨越融合基因每一侧多个外显子区域，只要发生在这些区 域的缺失或易位都能被检测到，极少发生漏检，假阴性率 很低。 16 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital v举例举例 v 男性46岁患者，2003.2.24内科急诊发现白细胞增 高（25109/L） 。 v 骨髓显示粒系极度增生，红系、巨核系以及血小 板增生尚可，NAP积分49分，核型分析结果为 46,XY20。 v 随访3年，其白细胞始终维持在20-30109水平。 一、诊断 17 FISH技术在血液肿瘤中的

8、 应用 Shanghai First Peoples Hospital v 2006.5.4发现白细胞增高至170109，血小板511109 ，血红蛋白118g/dL。 v 骨髓象显示早幼粒细胞占6%，中幼粒细胞占13%，核型 分析未见分裂象。 v BCR-ABL 210基因阴性，经单融合FISH探针证实骨髓59% 细胞BCR-ABL融合基因阳性。 v 接受格列卫治疗，2006.9.7复查，FISH阳性细胞比例降 低至7.4%，2006.10.23以后的复查结果FISH都为阴性。 一、诊断 18 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital

9、v 其他常用于诊断的探针还有：PML/RARA ，AML1/ETO，CBF，TEL/AML1等。 v 以CBF探针为例： 发生16号染色体倒位的细胞其荧光信号由2F 变成1F/1R/1G。 有研究表明CBF探针对inv(16)导致的 CBF-MYH11融合基因的检出率与分子生物 学的方法相当。 一、诊断 19 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital 一、诊断急性淋巴细胞白血病 v急性淋巴细胞白血病 检测探针探针定位异常染色体 GLP 4/GLP 10 GLP 4: 4p11.1-q11.1 GLP 10: 10p11.1-q11.1 +

10、4，+10 GLP 17GLP 17: 17q11 +17 GLP TEL/GLP AML1 GLP AML1：21q22 GLP TEL：12p13 t(12;21) GLP MLLGLP MLL：11q23t(11;v) GLP BCR/GLP ABL(DF) GLP BCR: 22q11.2 GLP ABL: 9q34 t(9;22) 20 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital 一、诊断淋巴瘤 21 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital v鉴别诊断，以BCR/ABL探针

11、为例： 额外信号的BCR/ABL探针（ES） 根据荧光信号的模式不同，可以鉴别MBCR 断裂点（P210）和mBCR断裂点(P190)。 MBCR断裂点的细胞呈现1Y/2R/1G的信号模 式，而mBCR断裂点的细胞则是2Y/1R/1G的 信号模式。 一、鉴别诊断 22 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital 一、鉴别诊断 v 双色双融合信号探针（DF）虽不能区 分MBCR和mBCR，但能检测der（9）的部 分序列缺失。 ABL和BCR基因同时缺失：1R/1G/1Y ABL基因单独缺失： 1R/2G/1Y 。 ES探针却无法检测der（

12、9）的部分序 列缺失，其信号均显示1R/1G/1Y 。 23 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital 一、鉴别诊断 v IgH-CCND1 男性，54岁患者，左颌下肿块2月余 白细胞增高（21.3109/L） 骨髓涂片见到增生活跃，以成熟淋巴细胞增生为主 ，考虑慢性淋巴细胞白血病。 流式分析显示CD5+CD19+细胞占86.5%，以CD19+的细 胞群设门，CD23+细胞约占16.3%。 FISH检测患者外周血，约50%的圆形细胞显示融合 信号，提示套细胞淋巴瘤可能性大。 病理证实了左颌下淋巴结非霍奇金套细胞淋巴瘤。 。 24 FISH

13、技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital vCLL中的应用 CLL的细胞大多处于间期，有丝分裂活性 较低，细胞往往不分裂，即使分裂的细胞 绝大多也是正常核型，核型分析的异常检 出率很低。 CLL的遗传学异常被认为与存活期有关： 正常核型和13q-预后相近 +12、11q-和17p-的预后均较差 二、治疗和预后分层 25 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital FISH共检出了23例异常（76.7%）。 完成核型分析的18例中仅2例检出异常。 正常核型的9例中，FISH检出7例异常。 未见分

14、裂象的7例中，FISH检出5例异常。 而且这些由FISH检出的异常克隆比例基本都在20%以上。 CEP12P53D13S25RB1ATM核核 型型 阳性例数11213121 异常2 正常9 未见7 未做12 二、治疗和预后分层 26 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital vMM中的应用 MM的骨髓瘤细胞有丝分裂指数低，且由于骨髓浸 润程度不同，常规核型分析异常检出率相对较低 ，检出的异常往往是超二倍体和/或复杂核型。 MM的遗传学异常同样被认为与预后相关，13q14的 缺失被认为是复发和预后不良的独立危险因素， 1q21扩增、p53缺

15、失也都提示预后不良。 二、治疗和预后分层 27 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital 二、治疗和预后分层 v FISH共检出了17例异常（56.7%）。 v 完成核型分析的27例中6例检出异常（22.2%）。 v 正常核型的15例中，FISH检出9例异常。 v 未见分裂象的7例中，FISH检出3例异常。 v FISH检出的异常克隆比例大多都低于30%。 v 浆细胞比例低于20%，异常检出率会大大降低。 1q21P53D13S319RB1IgH核核 型型 阳性例数628710 异常6 正常15 未见6 未做3 28 FISH技术在血液肿

16、瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital vMDS中的应用 FISH在MDS中的应用价值相对较低。 MDS的患者大多能成功完成核型分析， 且被分析的分裂象数目和质量尚可。 FISH检测普遍采用组合探针（-5/5q-、 -7/7q-、+8、20q-和-Y）对五大类常见 异常进行分析。 二、治疗和预后分层 29 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital v在我院新近完成的70例MDS患者的研究中： 核型和FISH分别检出21例和22例异常，异常检出率相当。 核型异常但FISH正常的6例，这6例异常均发生于探

17、针覆盖范 围以外区域。 核型正常而FISH异常7例，这7例的异常克隆细胞比例大多较 低（10%）。 对于未见分裂像和正常核型的患者有一定的应用 价值，能提高小克隆异常的检出率。 二、治疗和预后分层 30 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital 三、监测疗效 对于某些不具有特定分子水平改变，或者 是基因重排方式比较特殊，常规的分子生物学 方法不能检测，但其在疾病初发时有较大片段 的易位、缺失、扩增或重排并能被现有的FISH 探针检出的患者，可在治疗后进行FISH监测。 31 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital vFISH在异性别异基因造血干细胞 移植后供受者嵌合比例的监测中 也有非常重要的价值。 v比较未分选细胞的STR和FISH两种 技术，FISH的敏感性和准确度更 高，对于早期提示复发或排斥反 应的临床应用价值更大。 四、识别移植后骨髓细胞来源 32 FISH技术在血液肿瘤中的 应用 Shanghai First Peoples Hospital 小 结 vF