荧光定量PCR步骤【1224】

1、荧光定量pcr步骤一土壤基因组dna提取（一）试剂和仪器：1. 乙醇(96%-100%)2. 异丙醇3. 离心机4. 漩涡振荡器5. 水浴锅6. 电子天平7. 超净工作台8. 1000ul、100ul移液枪；灭菌枪头9. 1.5ml灭菌离心管、2ml灭菌离心管10. 称量纸、称量勺、滤纸、酒精棉球、镊子等（二）提取步骤（omega试剂盒 e.z.n.a.tm soil dna kit）：提取前准备工作：按说明书的比例用乙醇稀释spw wash buffer。1. 打开水浴锅预热70（70预热elution buffer），用1.5ml离心管，取0.5g土壤，加入0.5g玻璃珠，加入1ml bu

2、ffer slx mlus，立即在涡旋仪上最高速涡旋3min，使菌体进入溶液（豆粕的改为：打开水浴锅预热70，取3g豆粕到50ml离心管中，加入27ml水，3000rpm离心5min，重复3次各取4ml上清到5ml离心管，13000rpm离心2min，弃上清，加0.5g玻璃珠，加1ml buffer slx mlus，立即在涡旋仪上最高速涡旋3min，使菌体进入溶液）；2. 加入100ul buffer ds，涡旋混匀；3. 转移至预热至70水浴锅中水浴10min，水浴过程中轻轻翻转一次（若存在较难溶解的细菌，水浴温度可增加到90），使菌体裂解；4. 3,000 rpm室温离心3min，转移8

3、00ul上清液到新的2ml离心管中，并加入270ul buffer sp2涡旋混匀；（离心时准备冰盒）5. 置于冰中5min，13,000 xrpm、4离心5min（配平）；6. 在超净台中把上清液转称至新的2ml离心管中，加入0.7倍（749ul）的异丙醇，翻转混匀20-30次，把样品置于-20 1h；7. 13,000 rpm、4离心10min，沉淀dna（可能看不到沉淀）；8. 倒弃上清液，并反扣于吸水纸上1min, 若还有残留，则在超净台中用移液器吸去；9. 加入70预热的200 ul elution buffer，涡旋10s，65水浴15min，让dna充分溶解（如果想得到不含rna

4、的dna，在这一步向样品中加10ul 25mg/ml的rna酶a）；10. 用剪过的黄枪头加入50ul htr reagent(使用前充分摇匀)，漩涡混合10s;11. 置于室温2min，13,000 rpm离心2min, 使htr reagent沉降；12. 转移上清液至新的2ml离心管（若经htr reagent提取后样品仍然显棕色或深色，重复步骤10-12）；13. 加入与上清液等体积（约200ul）xp2 buffer, 漩涡震荡充分混匀；14. 将上步所得溶液加到吸附柱（柱子套在2ml收集管中），12,000 rpm 室温离心1min，弃上清液，保留收集管；15. 柱子重新套在上步收

5、集管中，加入300ul xp2 buffer，12,000 rpm 室温离心1min，弃上清液和收集管；16. 柱子套在新的2ml收集管中，加入700ul spw wash buffer（经乙醇稀释），12,000 rpm室温离心1min，弃上清液，保留收集管；17. 柱子重新套在上步收集管中，重复步骤16；18. 柱子重新套在上步收集管中，13,000 x g 室温空离2min，使吸附柱干燥（空离完后在超净台中开盖晾干2min。该步对去除乙醇残余至关重要，乙醇残留可能会影响下游酶的使用）；19. 把柱子置于新的1.5ml离心管，枪头不要碰触吸附柱，垂直悬空加加30ul elution buf

6、fer至吸附柱中央，65水浴15min， 13,000 x g离心1min，洗提回收dna；20. 换个1.5ml离心管，重复上步（不需要水浴）；21. 将两次得到的dna溶液合并后再分装两管，每个30ul，一个放4常用，另一个-20低温储存。22. 用微量之外分光光度计测定提取的dna浓度，od260/od280约为1.8左右，过低有蛋白质和酚污染，过高有rna存在。二琼脂糖凝胶电泳检测提取dna产物（1%琼脂糖凝胶）（一）试剂和仪器1. edta、naoh、tris、乙酸2. eb3. 琼脂糖4. 10ul移液枪5. 电泳槽6. 电泳成像系统（二）药液配制1. 50tae缓冲液（ph8.3

7、）：称取tris 242g，na2edta2h2o 37.2g，向烧杯中加800ml的去离子水，充分搅拌溶解；加入57.1ml乙酸，使用去离子水定容至1l，高压灭菌后保存于室温。2. 1tae缓冲液：例如需要使用200ml的1*tae，则量4ml的50*tae，196ml的去离子水，混匀即可。（三）步骤1. 制备1%琼脂糖凝胶（大胶用60ml,小胶用30ml）: 称取0.6g（0.3g）琼脂糖置于锥形瓶中,加入60ml（30ml）1tae，该上盖子。微波炉加热煮沸，煮沸后转两圈取出摇匀，重复一次，至琼脂糖全部融化，摇匀。用水冷却锥形瓶至50-60，加入6ul（3ul）eb，摇匀，倒入内槽玻璃板

8、上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，若有气泡需赶走气泡，插好梳子，室温下静置直至凝胶完全凝固（20min左右）。2. 垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。从负极（黑色）处添加 1tae电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。3. 加样: 用10 ul微量移液器在第一孔添加5ul marker；取样品3ul，与2ul loading buffer在点样板或pe手套上混合，用分别将样品加入凝胶槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压120v，时间20min，

9、n=1-1。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。5. 观察照相：在紫外灯下观察，dna存在则显示出荧光条带，凝胶成像系统拍照保存。三、普通pcr扩增（一）耐药基因的特异性引物如表1如示（由北京奥科公司合成）表1耐药基因的引物序列目标基因引物引物序列（5-3）目标片段大小（bp）参考文献ermbermb-91fgataccgtttacgaaattgg364chen et al, (2007)ermb-454rgaatcgagacttgagtgtgcermfermb-189fcgacacagctttggttgaac309chen et al, (2007)ermb-497rggacctacc

10、tcatagacaagermtermb-52fcatataaatgaaattttgag369chen et al, (2007)ermb-420racgatttgtat tagcaacc（二）耐药基因的pcr扩增反应体系均为25l（表2），表2耐药基因的pcr扩增反应体系组分（l）ermbermfermt2mix12.5012.5012.50上游引物（10m）0.500.500.5下游引物（10m）0.500.500.5dna模板1.001.001.00灭菌超纯水10.5010.5010.50（三）各基因的pcr扩增反应条件如表3所示。表3耐药基因的pcr扩增反应程序步骤ermbermferm

11、t1预变性94，240s94，240s94，240s2变性94，45s94，45s94，30s3复性（退火）58，45s56，45s49，30s4延伸72，45s72，45s72，45s5循环数（24步骤）（次）3535356再延伸72，360s72，360s72，360s7保存4，1h4，1h4，1h四琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物（2%琼脂糖凝胶）（一）试剂和仪器7. edta、naoh、tris、乙酸8. eb9. 琼脂糖10. 10ul移液枪11. 电泳槽12. 电泳成像系统（二）药液配制1. 50tae缓冲液（ph8.3）：称取tris 242g，na2edta2h2o 37.2g

12、，向烧杯中加800ml的去离子水，充分搅拌溶解；加入57.1ml乙酸，使用去离子水定容至1l，高压灭菌后保存于室温。2. 1tae缓冲液：例如需要使用200ml的1*tae，则量4ml的50*tae，196ml的去离子水，混匀即可。（三）步骤6. 制备2%琼脂糖凝胶（大胶用60ml,小胶用30ml）：称取1.2g（0.6g）琼脂糖置于锥形瓶中，加入60ml（30ml）1tae，该上盖子。微波炉加热煮沸，煮沸后转两圈取出摇匀，重复一次，至琼脂糖全部融化，摇匀。用水冷却锥形瓶至50-60，加入6ul（3ul）eb，摇匀，倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层，若有气泡需赶

13、走气泡，插好梳子，室温下静置直至凝胶完全凝固（20min左右）。7. 垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。从负极（黑色）处添加 1tae电泳缓冲液至没过胶板1-2mm为止。8. 加样: 用10 ul微量移液器在第一孔添加5ul marker；取样品5ul用分别将样品加入凝胶槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序）。9. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压120v，时间20min，n=1-1。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。10. 观察照相：在紫外灯下观察，dna存在则显示出荧光条带，采用凝胶成像系

14、统拍照保存。11. 若有目的条带则将pcr产物（剩余pcr产物20ul左右，上游引物10ul或上下游引物各10ul）送至北京奥科公司进行测序，根据测得的序列在ncbi上进行同源性比对，同源性应大于98%，判断是否为目的耐药基因。五胶回收（一）试剂和仪器：1.乙醇(96%-100%)3.离心机5.水浴锅8.移液枪；灭菌枪头9.1.5ml灭菌离心管、2ml灭菌离心管 （二）提取步骤（omega试剂盒 e.z.n.a.tm gel extraction kit）： 提取前准备工作：a.按说明书的比例用乙醇稀释spw wash buffer；b.调节水浴的温度为50-55；c.65预热的elution

15、 buffer。1. （普通pcr反映体系为25ul，需要两管，共50ul，插大梳子，用1.52的胶，将两管全打入一个孔）琼脂糖凝胶电泳分离dna片段，推荐使用新鲜的tae/ tbe buffer和新配制的胶。2. 片段完全分离后，在紫外灯下迅速切取所需条带，dna在紫外灯下爆光时间不超过30s，。 3. 切取下来的胶放入1.5ml的离心管，按照每1g凝胶加入1ml binding buffer（xp2）对应量，即胶与xp2以1:1体积混合（一般将凝胶全部淹没即可)，50-55水浴至凝胶完全溶解（约7min）。每隔2-3mi n翻转一次。注意: 当ph8，dna会明显降解。当binding b

16、uffer完全溶解凝胶后,请注意溶液颜色的变化。如果溶液颜色已经变成紫色或红色，必须加入5ul 5m naac, ph5.2至溶液中调整ph值，溶液颜色变成浅黄色。4. 把hibind dna柱子套在提供的2ml收集管中。5. 降温后，把700ul溶好的胶加hibind dna柱子中(不要垂直冲柱子)，10,000 x g（12,000 rpm）室温离心1 min。6. 倒去滤液，把柱子装回收集管中，hibind柱一次能装700ul溶液，若混合液超过700ul，每次转移700ul至柱子中，然后重复5-6步骤，直至胶加到完到柱子中。7. 把柱子重新装回收集管，加入300ul binding bu

17、ffer（xp2）；10,000 x g（12,000 rpm）室温离心1 min。弃去滤液。8. 把柱子重新装回收集管，加入700ul spw wash buffer（经乙醇稀释）；10,000 x g（12,000 rpm）室温离心1 min，弃去滤液。9. （可选）重复步骤8一次。10. 把柱子重新装回收集管，13,000 x g（13,000 rpm）空离柱子2min以甩干柱子基质。11. 把柱子装在新的1.5ml离心管上，加入15-30ul 65c预热的elution buffer到柱子基质上，室温静置1min；13,000 x g（13,000 rpm）室温离心1min，洗脱出dn

18、a。六、lb培养基配制（一）lb液态培养基（配100ml，可做500个样，一般只需要称量、加水、灭菌）1称量用200ml烧杯按lb肉汤说明称量，加超纯水。2溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。3调ph在未调ph前，先用精密ph试纸测量培养基的原始ph值，如果ph偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/l naoh，边加边搅拌，并随时用ph试纸测其ph值，直至ph达7.6。反之，则用1mol/l hcl进行调节。注意ph值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求ph值较精确的

19、微生物，其ph的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。4分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内，本试验用250ml蓝盖大口瓶分装。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。液体分装分装高度以瓶口高度的1/4左右为宜。5灭菌用记号笔注明培养基名称、组别、日期。将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。6无菌检查将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。4保存。（二）la液态培养基（每100ml的lb中加100ul氨苄青霉素，

20、配1l，可做62个样）1称量用1l烧杯按lb肉汤说明称量，加超纯水。2溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。3调ph在未调ph前，先用精密ph试纸测量培养基的原始ph值，如果ph偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/l naoh，边加边搅拌，并随时用ph试纸测其ph值，直至ph达7.6。反之，则用1mol/l hcl进行调节。注意ph值不要调过头，以避免回调，否则会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求ph值较精确的微生物，其ph的调节可用酸度计进行。4分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧

21、瓶内，本试验用250ml蓝盖大口瓶分装。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。液体分装分装高度以瓶口高度的1/4左右为宜。5灭菌用记号笔注明培养基名称、组别、日期。将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3，20分钟高压蒸汽灭菌。6. 抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的lb培养基置于55的水浴中，待培养基温度降到55时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。4保存。（三）la固态培养基（配200ml，可做20个板左右）1称量用500ml烧杯按lb琼脂说明称量，加超纯水。2溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒

22、搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。3调ph在未调ph前，先用精密ph试纸测量培养基的原始ph值，如果ph偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/l naoh，边加边搅拌，并随时用ph试纸测其ph值，直至ph达7.6。反之，则用1mol/l hcl进行调节。注意ph值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求ph值较精确的微生物，其ph的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。4分装按实验要求，可将配制的培养基分装入三角烧瓶内，分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。固体分装三角烧瓶的

23、量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。5加塞培养基分装完毕后，在三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。6包扎三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。7灭菌用记号笔注明培养基名称、组别、日期。将上述培养基以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3，20分钟高压蒸汽灭菌。8. 抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的lb培养基置于55的水浴中，待培养基温度降到55时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。3.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开

24、盖子，在紫外下照10-15分钟。4.保存：用封口胶封边，并倒置放于4保存，一个月内使用。六、载体的连接与转化准备：1pmd18-t vector载体试剂盒2e.coll competent cells dh5感受态细胞（-80保存，取出置于4冰种融化）3lb培养基 day1晚上10点：（1）将纯化的pcr产物用于pmd18-t vector载体的连接，连接体系为：1ul pmd18-t vector，4ul pcr产物（模板），5ul solution 。轻轻混匀，在pcr仪上16放置11h，4 forever，拿出时放在冰上；day2中午12地点：（2）反应结束后，将连接产物全量（10 ul

25、）螺旋加入至50 ul e.coll competent cells dh5感受态细胞中，注意须在感受态细胞刚刚解冻时螺旋加入连接产物，螺旋吹打混匀，冰中放置30min（开42水浴锅和37摇床）；（3）将加了连接产物的感受态细胞的离心管置于42的水浴中热激45s，后立即置于冰上2min，期间尽量不要摇动离心管；（4）往离心管里加200 ul的lb肉汤培养液（无氨苄霉素）。37，160r/min振荡培养45min。（5）在超净台上灼烧玻璃棒，取离心管的全量涂布到la平板培养基（含有氨苄霉素）上养菌，37过夜培养16h（开始正放，3h后倒放培养皿）。day3早上8点：七、重组子鉴定第2天挑选白色单

26、个菌落于含980ul la的肉汤培养液（含氨苄霉素）的1.5ml灭菌离心管中（用小的枪头挑菌，把枪头一并达到1.5ml离心管中，一个片段做6个管），220r/min摇菌大于3h，在超净台上把枪头打掉，取1ul菌液以原有的pcr引物对菌液进行扩增（一个片段6个），取5ul pcr产物用120v，2%琼脂糖凝胶电泳检测是否含有目的片段（作不加模板的阴性照），每个片段选取两个条带较亮的样所对应的200ul菌液送测序,确认目的基因。期间离心管放到37培养箱中继续摇菌，琼脂平板培养基放4冰箱保存。八、质粒的培养与提取阳性菌液以1:50扩摇（如：用10ml离心管，加5ml la肉汤培养液，再加100ul阳

27、性菌液），一管阳性菌液扩两管，37,220r/min摇菌16h。day4早上9点：第2天看菌液是否浑浊，如果浑浊，则可用于后续质粒提取.提取质粒前取1ml菌液到1.5ml的灭菌离心管中进行保菌。质粒提取步骤参照omega质粒提取试剂盒。质粒提取具体步骤为：（1）用上述10ml离心管所含菌液，12,000r/min离心5min，弃上清液；（2）加入250l rnase a与solution的混合液（事先混合于4保存），漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮。转移到2ml灭菌离心管中，室温静置1-2min；（3）加入250l solution，轻轻地反复颠倒混匀5-6次，避免剧烈混匀。室温放置1-2mi

28、n，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液，此步不能超过5min；（4）加入350l solution，立即轻柔地反复颠倒5-6次,避免局部沉淀，此时会出现白色絮状沉淀，12,000r/m室温离心10min，收集上清液，迅速进行下步；（5）马上将上清液置于dna纯化柱中12,000r/min离心1min，弃滤液；加入500l溶液hb，12,000r/min离心1min，弃滤液；（6）加入700l溶液spw wash buffer，12,000r/min离心1min，弃滤液；重复本步骤1次；（7）13,000r/min空离3min，以除尽纯化柱中残留的液体，弃收集管；（8）将dna纯化柱置于新的

29、1.5ml的离心管中。向纯化柱中间处悬空滴加50l的灭菌去离子水，室温放置2min。12,000r/min离心1min，管底即为高纯度质粒dna。质粒dna于-20保存；（9）在琼脂糖上鉴定所提取出的质粒，用核酸定量仪记录质粒的浓度和260/280的比值，用于拷贝数的计算。九、荧光定量pcr反应1.标准曲线的制作将已知浓度的质粒dna用灭菌超纯水进行10倍梯度稀释，稀释成八个梯度，使得pcr产物的浓度为原来浓度的10010-7，以稀释后的pcr产物为模板，按照定量pcr反应体系和反应条件进行pcr扩增，每个梯度3个重复，同时做3个阴性对照。拷贝数的计算：以ct值为横坐标，不同浓度的样品拷贝数对数值为纵坐标，制成标准曲线每g质粒dna基因拷贝数按以下公式计算（whelan等，2003）：（式2.1）式中，l是阿弗加德罗常数（6.021023）；c是质粒dna浓度（已测）；n是目标基因的模板长度（