基因诊断与测序技术在其中的应用_陈然_2015-03-20

1、基因诊断与测序技术基因诊断与测序技术 在其中的应用在其中的应用 武汉分子生物学实验室武汉分子生物学实验室 陈然陈然 2015-03-202015-03-20 KG Diagnostics Confidential 内容内容 基因诊断的概念 基因测序技术及发展沿革 一代测序及片段分析检测流程 二代测序技术流程 测序结果的分类及测序策略的选择 测序技术的局限性 KG Diagnostics Confidential 基因诊断的概念 内容内容-1-1 KG Diagnostics Confidential 基因检测 基因预测 基因诊断 即分子诊断，应用分子生物学方法检测患者体 内遗传物质的结构或表达

2、水平的变化等而做出 的或辅助临床诊断的技术。 又称基因体检，通过检测基因判断未来患某种 疾病的可能性（风险预测），进而加强健康管 理。 基因诊断的概念基因诊断的概念 KG Diagnostics Confidential 正常人不会发生融合基因或基因突变。正常人不会发生融合基因或基因突变。 某些疾病的患者会检测出融合基因或基因突变。某些疾病的患者会检测出融合基因或基因突变。 两个或多个基因的编 码区相连接，表达融 合蛋白。可由染色体 易位造成，常与染色 体项目、流式项目同 时送检。 项目：BCR/ABL, AML1/ETO, PML/RARa, AML 16种筛查，ALL 15种筛查，31种筛

3、 查 技术：定性PCR、定 量PCR、基因芯片、 二代测序。 融合 基因 基因在结构上发生的 碱基对或排列顺序的 改变，包括点突变、 插入/缺失突变 （INDEL）。 项目：JAK2 V617F, CALR Exon9, AML预 后, EGFR, Kras, HLH, Fanconi, 地贫 DMD, HBV耐药 技术：定量PCR、基 因芯片、一代测序、 二代测序、MLPA、定 性PCR、杂交。 基因 突变 分子实验室开展的诊断类检测分子实验室开展的诊断类检测-1-1 KG Diagnostics Confidential 正常人正常人和某和某 些疾病的患些疾病的患 者间基因表者间基因表 达

4、量不同。达量不同。 用分子生物学手段检 测个体基因型 （Genotype）。 项目：配型, 嵌合率, HCV分型，SNP，亲子 鉴定 技术：一代测序、片 段分析、二代测序、 基因芯片。 基因 分型 量化检测mRNA的多少。 项目：化疗ERCC1， RRM1，TUBB3，TYMS 基因mRNA表达含 量 技术：定量PCR、二 代测序。 基因 表达 正常人之间的正常人之间的 基因分型不同。基因分型不同。 分子实验室开展的诊断类检测分子实验室开展的诊断类检测-2-2 KG Diagnostics Confidential 基因测序技术及发展沿革 内容内容-2-2 KG Diagnostics Con

5、fidential v DNADNA测序技术，即基因测序技术，是测序技术，即基因测序技术，是 指测定指测定DNADNA碱基序列的技术。碱基序列的技术。 v 人类基因组约有人类基因组约有3030亿个碱基对。大部亿个碱基对。大部 分分DNADNA测序的目的是得到特定基因的测序的目的是得到特定基因的 特定区域上序列信息特定区域上序列信息AA、T T、G G、C C 四种碱基的排列顺序，即靶向基因测四种碱基的排列顺序，即靶向基因测 序序/ /目标区域测序。目标区域测序。 v 通过对比被检者的碱基排列顺序是否通过对比被检者的碱基排列顺序是否 与正常人一致，以此作为疾病诊断的与正常人一致，以此作为疾病诊断

6、的 依据。依据。 v 测序技术已广泛应用在医学、生物学测序技术已广泛应用在医学、生物学 研究，各类疾病的检测和筛查，物种研究，各类疾病的检测和筛查，物种 鉴定，农作物筛选，基因工程鉴定，农作物筛选，基因工程 基因测序技术基因测序技术 KG Diagnostics Confidential 为什么使用测序技术进行诊断为什么使用测序技术进行诊断 既能检测已知突变、也能既能检测已知突变、也能 检测未知突变。检测未知突变。 二代测序技术的发展使得二代测序技术的发展使得 基因诊断的深度和广度得基因诊断的深度和广度得 到极大扩展，使得多基因到极大扩展，使得多基因 参与的复杂疾病检测，及参与的复杂疾病检测，

7、及 高灵敏度检测成为可能。高灵敏度检测成为可能。 能够检测一段区域内的所能够检测一段区域内的所 有点突变。有点突变。 具备成本和可操作性具备成本和可操作性 上的优势。上的优势。 KG Diagnostics Confidential Thermo Life/ABI 3500 xL Beckman Coulter GenomeLab GeXP Roche/454 Genome Sequenser FLX Illunima HiSeq 2500 Life/Ion Torrent PGM PacBio RS System 一代一代测测序序二代二代测测序序三代三代测测序序 1977起2005起2011

8、起 Thermo Life/ABI Solid 5500 测序技术的发展测序技术的发展 KG Diagnostics Confidential 一代一代测测序序 二代二代测测序序 (NGS) 三代三代测测序序 (3GS) 技术 原理 双脱氧末端终止法 （Sanger法）+毛细 管电泳（CE）； Roche 454：高通量焦磷酸测序； Illumina：桥接PCR+边合成边测序； ABI Solid：寡聚物连接检测测序； Ion Torrent：H+电位信号检测+半导体芯片； 大规模平行测序（massively parallel DNA sequencing），生物信息技术处理产出 数据； 单分

9、子实时测序； 特点 高读长；检测通量中 等；检测灵敏度低； 单孔成本低，适用于 少数基因的少量位点 测序； 检测通量高；检测灵敏度高；开机运行成本 高，但平摊到每样本、每碱基的成本低；适 用于多基因，多位点的测序；可自动完成数 据分析； 高读长，特别适合于de novo测序；检测通量高； 准确性低（81-83%）；开 机运行成本很高； 应用 范围 研究和临床检测；研究和临床检测；目前只用于研究； 三代测序技术的比较三代测序技术的比较 KG Diagnostics Confidential 一代测序及片段分析检测流程 内容内容-3-3 KG Diagnostics Confidential 样本

10、收取&处理PCR扩增目的片段酶解消化 测序反应 （双脱氧末端终止 法） 测序反应产物纯化 （乙醇沉淀） 加入Hi-Di甲酰胺， 变性 基因分析仪上机 （毛细管电泳） 分析结果，得出报 告 一代测序检测流程一代测序检测流程 KG Diagnostics Confidential 医院 前处理 录入Lis系统 分子实验室 分拣、登记 物流 标本 （血液） DNA RNA 提取核酸过程 标本收取标本收取& &处理处理 KG Diagnostics Confidential v PCR：Polymerase Chain Reaction（聚合酶链式反应）的简称。PCR是一个在 体外特异性的复制一段DN

11、A片段的过程。1985年由美国科学家Mullis发明。 v 分子生物学最常用的体外扩增DNA的方法，使人们很快的获得大量拷贝的特异 DNA片段，利于继续进行后续检测的分析。 DNA模板； 4种脱氧单核苷酸 dNTP（包括dATP、 dTTP、 dGTP、 dCTP ）； 耐热性聚合酶(如 Taq)； 一对特异性引物； 适量的反应缓冲 液； 基因扩增仪（PCR仪） PCRPCR扩展目的基因片段扩展目的基因片段 KG Diagnostics Confidential 时间 温度 延伸 3 变性 1 退火 2 1个PCR循环包 括变性、退火、 延伸3步 重复13步 30-35轮 目的DNA片段 扩增

12、百万至亿倍以上， 能够被电泳等后续 方法检测到。 DNA单链 与引物复性 DNA变性 形成2条单链 子链延伸 DNA加倍 PCRPCR程序程序 KG Diagnostics Confidential 模板DNA 95 KG Diagnostics Confidential PCRPCR的基本原理的基本原理 vPCR反应条件 vPCR过程 vPCR的特点 56 引物1 引物2 DNA引物 KG Diagnostics Confidential PCRPCR的基本原理的基本原理 vPCR反应条件 vPCR过程 vPCR的特点 72 引物1 引物2 DNA引物 Taq Taq dATP dGTP d

13、TTP dCTP KG Diagnostics Confidential PCRPCR的基本原理的基本原理 vPCR反应条件 vPCR过程 vPCR的特点 95 第1轮循环结束 第2轮循环开始 KG Diagnostics Confidential PCRPCR的基本原理的基本原理 vPCR反应条件 vPCR过程 vPCR的特点 Taq Taq Taq Taq dATP dGTP dTTP dCTP 56 72 95 KG Diagnostics Confidential PCRPCR的基本原理的基本原理 vPCR反应条件 vPCR过程 vPCR的特点 72 第2轮循环结束 第3轮、第4轮 K

14、G Diagnostics Confidential No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824 经多次循环后靶片段扩增的数量经多次循环后靶片段扩增的数量 KG Diagnostics Confidential v SAP：Shrimp Alkaline Phosphatase，虾碱性磷酸酶，催 化降解体系里多余的dNTP。 v Exo I： Exonuclease I，核酸外切酶I，催化分解体系里 多余的单链DNA（即引物）。 v 同时向PCR产物中加入一

15、定的SAP和Exo I，去除多余的 dNTP和引物，只保留扩增产物，达到纯化的效果。 酶解消化酶解消化 KG Diagnostics Confidential Frederick Sanger, 1918-2013。 1958年和1980年诺贝尔化学奖得 主。 1977年提出双脱氧末端终止法。 在反应体系中加入已经过酶解消化的PCR产 物、耐热性聚合酶、4种脱氧单核苷酸dNTP （包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、4种带 荧光标记的双脱氧单核苷酸ddNTP（包括 ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP ）、单条特 异性引物、适量的缓冲液。 测序反应：双脱氧末端终止法（测序反

16、应：双脱氧末端终止法（SangerSanger法）法） KG Diagnostics Confidential # 由于双脱氧单核苷酸缺乏延伸所需要的3-OH基团， 一旦掺入到DNA链中，此DNA链就不能进一步延长。 # 每当DNA聚合酶需要dNTP参入到正常延长的DNA 链中时，就有两种可能性，一是掺入ddNTP，结果 导致DNA链延长的终止；二是掺入dNTP，使DNA链仍 可继续延长，直至掺入下一个ddNTP。 # 根据这一方法，就可得到一组长短不一的链终 止产物，彼此只相差一个碱基。它们有共同的起始 点，但终止在不同的荧光标记的ddNTP上。 # 通过高分辨电泳对这一组产物进行分离，光学

17、 系统捕捉到ddNTP的荧光信号，以峰的形式展现成 图谱，并按顺序排列。从电泳图谱上可读得DNA碱 基序列。 测序反应：双脱氧末端终止法（测序反应：双脱氧末端终止法（SangerSanger法）法）-2-2 KG Diagnostics Confidential v测序反应产物纯化目的：去除多余荧光ddNTP对激光 检测器的干扰；方法：乙醇沉淀法。 v加入Hi-Di甲酰胺并变性：将DNA双链打开，维持其 处于单链状态。 测序反应产物纯化及变性测序反应产物纯化及变性 KG Diagnostics Confidential 基因分析仪工作原理 毛细管电泳（Capillary Electrophor

18、esis，CE）：以毛细管 为分离通道、以高压直流电场为驱 动力，依据样品中各组分之间的淌 度和分配行为上的差异而实现分离 的电泳分离分析方法。毛细管电泳 的分辨率比PAGE电泳更高，能够分 辨出1个碱基的DNA片段差异。经双 脱氧末端终止法扩增出来的以ddNTP 结尾的长短不一的DNA片段通过毛细 管电泳分离，再经激光系统对ddNTP 上的荧光信号检测，就能得到DNA的 序列信息。 基因分析仪上机基因分析仪上机 KG Diagnostics Confidential 参考序列 样本序列 报出与参考 序列不一致 的地方 测序结果分析测序结果分析 KG Diagnostics Confident

19、ial 毛细管 电泳 分离Sanger法测序产物 一代测序 分离PCR产物 片段分析 片段分析（Fragment Analysis）：用带荧光标记的引物扩增目的DNA片 段（可实现多重扩增），产物经毛细管电泳分离后得到荧光峰图谱，再 经软件处理得出产物的片段大小，从而得到基因型等结果。 基因分析仪基因分析仪不仅仅用于测序不仅仅用于测序 KG Diagnostics Confidential 测序：检测DNA片段中的碱基序列。 片段分析：分离荧光标记的片段并检测其大小。 流程短；灵敏度高； 多重扩增增加了检测 通量；应用及衍生技 术多； 不能检测点突变，不 能检测未知突变。 测序测序vsvs片段

20、分析片段分析 KG Diagnostics Confidential 片段片段 分析分析 SNP分型 SNaPshot SNaPlex 微卫星/STR 基因连锁定位 动物育种 人身份鉴定 微卫星不稳定性 嵌合体 相对荧光定量 MLPA LOH QF-PCR/QMPSF 指纹图谱分析 AFLP 片段分析的应用片段分析的应用 KG Diagnostics Confidential 样本收取&处理 PCR扩增目的片 段 上样准备 基因分析仪上机 （毛细管电泳） 分析结果，得出 报告 片段分析的检测流程片段分析的检测流程 KG Diagnostics Confidential PCR：引物带有荧光标记

21、，故扩增 出的PCR产物也带有荧光标记。 上样准备：PCR产物+Hi-Di甲酰胺 +内标，变性。 基因分析仪上机：进行毛细管电 泳，光学系统捕捉到荧光信号， 并以峰的形式展现成图谱。 PCRPCR上样准备上样准备上机上机 KG Diagnostics Confidential 片段结果示例片段结果示例 KG Diagnostics Confidential v MLPA： Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification（ 多重连接依赖式探针扩增）的简称，由MRC-Holland公司于2002年 首创。 v 该技术利用杂交、连接和PCR扩增反应三

22、个基本步骤，在单个反应 管内可进行最高达50种的核苷酸片段相对定量检测。 v 优势：通量高；灵敏度高；操作简单；特别适于检测DNA缺失/重复 突变（Indel），CNV（Copy Number Variation）突变。 v 局限：不能用于检测STR（短串联重复序列多态性）；不能用于检 测染色体平衡易位；不能用于单个细胞检测；开发新MLPA试剂盒很 困难；只集中于人DNA分析； 定量PCR不 能达到 Southern Blot费时 费力 测序不能检测中大片段Indel和CNV MLPAMLPA技术技术 KG Diagnostics Confidential MLPAMLPA技术流程技术流程 K

23、G Diagnostics Confidential 缺失突变 CNV突变 MLPAMLPA举例举例 KG Diagnostics Confidential MLPAMLPA的量化结果的量化结果 KG Diagnostics Confidential ThermoFisher Scientific Life Technologies Ion Torrent二代测序平台 内容内容-4.1-4.1 KG Diagnostics Confidential Ion TorrentIon Torrent公司简介公司简介 Ion Torrent公司，由Dr.Jonathan Rothberg创办。 创立4

24、54生命科学公司， 推出第一台NGS测序仪。 2007年以1.4亿美元被罗 氏公司收购。 创立Ion Torrent公司， 推出第一台半导体测序仪 PGM。 2010年以3.5亿美元被 Life Technologies收购。 创立RainDance公司，开 拓出第三代PCR数字 PCR技术。 KG Diagnostics Confidential Ion TorrentIon Torrent半导体测序技术的特点半导体测序技术的特点-1-1 成本低成本低：设备价格实惠，无光 学系统。 通量灵活通量灵活：选择合适的芯片， 无论样本多少都能开机。 小型化小型化：为临床检测而设计的 台式测序仪，改变

25、了NGS的发展 方向。 快速性快速性：无荧光检测，测序步 骤耗时短。 Ion PGM首款半导体测序仪，全球销售速度、普及速度最快的测序仪。 KG Diagnostics Confidential Ion TorrentIon Torrent半导体测序技术的原理半导体测序技术的原理 KG Diagnostics Confidential Ion TorrentIon Torrent半导体测序核心技术半导体测序核心技术 KG Diagnostics Confidential Ion TorrentIon Torrent技术流程技术流程 文库制备 手工完成 模板制备 手工完成 上机测序 自动化完成

26、数据分析 自动化完成 核酸提取 PCR扩增目的片段 KG Diagnostics Confidential 文库制备的目的文库制备的目的 打断打断DNADNA分子分子 增加接头增加接头 增加增加BarcodeBarcode KG Diagnostics Confidential 模板制备的目的模板制备的目的 使ISP珠子上富集同一克隆的DNA片段。 KG Diagnostics Confidential 芯片上样和测序仪测序芯片上样和测序仪测序 PGM的清洗 PGM的初始化 模板上芯片-ISP 珠子的Loading KG Diagnostics Confidential PGMPGM测序结果测

27、序结果 KG Diagnostics Confidential 数据分析数据分析 通过专用服务 器的插件分析。 插件平台开放， 便于升级、共 享。 KG Diagnostics Confidential VariantCallerVariantCaller插件分析结果插件分析结果 KG Diagnostics Confidential Illumina二代测序平台 内容内容-4.2-4.2 KG Diagnostics Confidential Illumina 公司，成立于1998年，原专注于BeadArray芯片分型技 术。 2006年收购Solexa，不断改良Genome Analyze

28、r NGS平台，目前成 为高通量测序的行业领导者。 IlluminaIllumina公司简介公司简介 KG Diagnostics Confidential IlluminaIllumina二二代代测序技术特点测序技术特点 准确性高准确性高：唯一在Q30上表现出 色的二代测序平台。世界上第 一台获得FDA认证的测序平台。 数据产出量巨大数据产出量巨大：大规模样本 一起测序时，每样本平摊成本 低。 市场占有率高市场占有率高：众多科研文章 均是基于Illumina平台发表。 集成自动化集成自动化：Miseq可承担簇生 成、测序与数据分析。 KG Diagnostics Confidential I

29、lluminaIllumina二二代代测序核心技术测序核心技术 Sequencing By Synthesis (SBS, 边合成边测序边合成边测序 ) 杂交的测 序引物 第一个碱基被合成， 检测荧光信号 切掉阻遏基团和荧 光基团 KG Diagnostics Confidential IlluminaIllumina二二代代测序技术流程测序技术流程-1-1 KG Diagnostics Confidential IlluminaIllumina二二代代测序技术流程测序技术流程-2-2 文库构建：通过捕获/扩增的方式达到：打断 DNA分子、加接头、加Index。 簇生成：经过桥接PCR在Flo

30、w Cell上生成大量 模板。 测序：每次流过1种dNTP；照相机拍下荧光信号； 分析处理后得出碱基序列。 决定了测 序通量 KG Diagnostics Confidential IlluminaIllumina二二代代测序技术流程测序技术流程-3-3 Library Preparation Cluster Generation MiSeq cBot Sequencing MiSeq HiSeq Data Analysis MSR CASAVA 手工完成 自动完成 自动完成 自动完成 KG Diagnostics Confidential TruSight系列（肿瘤、心血管、遗传性 疾病等）

31、 临床靶向基因测序（基因突变引起的疾 病检测等），如范可尼贫血、MDS套系等。 微生物基因组测序 全外显子组测序 转录组测序 其他科研测序项目 IlluminaIllumina二二代代测序平台的分工测序平台的分工 KG Diagnostics Confidential Vcf.outVcf.out数据结果数据结果 KG Diagnostics Confidential 测序结果的分类 测序策略的选择 内容内容-5-5 KG Diagnostics Confidential 测序结果报告测序结果报告& &注释注释- -致病性突变致病性突变 KG Diagnostics Confidential

32、测序结果报告测序结果报告& &注释注释- -可能致病性可能致病性/ /增加风险增加风险 KG Diagnostics Confidential 测序结果报告测序结果报告& &注释注释- -临床意义不明确临床意义不明确 KG Diagnostics Confidential 测序结果报告测序结果报告& &注释注释- -多态性位点，无致病性多态性位点，无致病性 KG Diagnostics Confidential 已推出的遗传病测序检测项目已推出的遗传病测序检测项目-1-1 遗传代谢类疾 病 高苯丙氨酸血症 甲基丙二酸血症 糖原累积症 戈谢病 （注意与质谱的区别） 遗传型肌肉病 假肥大型肌营养不

33、良 症MLPA方法和测 序方法是两个不同项 目 脊髓性肌萎缩 运动、神经、生长发育异常 软骨发育不全/低下 脆性X综合征 X连锁低血磷酸抗生素 D佝偻病 Rett综合症 线粒体疾病 线粒体脑肌病MELAS综 合症 MERRF综合症 Leigh综合症 KG Diagnostics Confidential 已推出的遗传病测序检测项目已推出的遗传病测序检测项目-2-2 儿科血液病 嗜血细胞综合征 范可尼贫血 先天性纯合细胞再障 地中海贫血 血友病 遗传性结缔组 织疾病 新生儿马凡氏综合症- FBN1基因测序 Loeys-Dietz综合征- TGFBR1、TGFBR2基因 测序 遗传性心血管疾病 载脂蛋白E基因分型 家族性高胆固醇血症 LDLR基因检测 遗传性出血性毛细血 管扩张症的基因检测 遗传性淀粉样变性 转甲状腺素蛋白TTR基 因测序 载脂蛋白A-I (APOA1)、 载脂蛋白A-II (APOA2) 基因检测 KG Diagnostics Confidential 已推出的遗传病测序检测项目已推出的遗传病测序检测项目-3-3 免疫缺陷遗传 病 X