流式细胞术在出血与血栓性疾病中的应用

1、 FCMFCM在出血与血栓性疾病中的应用在出血与血栓性疾病中的应用 集激光、电子物理、光电测量、计算机、细胞荧光化学 及单克隆抗体为一体的新技术。 对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速、 灵敏、多参数定量分析和分选技术。 开创了对单个开创了对单个BPCBPC或亚群分析的新途径。或亚群分析的新途径。 FCMFCM分析分析BPCBPC的主要项目的主要项目 血小板计数：CD41、CD61射门 网织血小板（RNA噻唑橙黄染料）：含RNA的BPC 自身抗体:特异性血小板抗体、PAIg、同种抗体 免疫表型分析：膜糖蛋白表达: GPIb/IX/V复合物(CD42a、CD42b、CD42c、CD4

2、2d) GPIIb/IIIa复合物（CD41、CD61）FV、IIIa BPC活化：膜糖蛋白表达（P-选择素，CD62p） BPC内物质，微粒对不同刺激剂的反应性：胞质钙流 FCMFCM在出血性疾病中的应用在出血性疾病中的应用 1、血小板减少：血小板数量、网织血小板 2、血小板功能缺陷 血小板无力症： GPIIb-IIIa（CD41- CD61） 巨大血小板综合征： GPIb-IX（CD42b-D42a 3、血小板抗体： 血小板相关免疫球蛋白（PAIg） 血小板糖蛋白特异性自身抗体（GP） 4 、血小板采集、储存与输注的监测. 出血性疾病的分类出血性疾病的分类 血管壁功能异常 遗传性（毛细血管

3、扩张症、家族单纯性） 获得性（过敏性紫癜、血管炎、免疫性） 数量 遗传性、 获得性 Aa 、巨核、免疫性、 ITP、DIC 血小板异常 数量 （ET，CML） 功能异常（GT、BS、颗粒性） 凝血功能障碍 遗传性（血友病、 VWD、其他凝血因子缺乏） 获得性（VK缺乏，肝脏病，DIC、药物） 循环中病理性抗凝物质 凝血因子抑制物 肝素样抗凝物质；狼疮样抗凝物 纤维蛋白（原）溶解亢进 遗传（t-PA/u-PA抗纤溶酶） 获得（DIC，血栓症） 血小板计数血小板计数 BPC直径1-4m，与RBC，WBC或碎片、免疫复合物大小相等， 影响计数准确性。 FCM优点： 利用各种BPC特异性单克隆抗体直接

4、标记荧光素分子 快速、准确，排除非BPC颗粒干扰，误差5% ， 尤其适合BPC20X109/L 重复性好 缺点：技术条件要求高，费用高。 FCMFCM分析血小板原理分析血小板原理 利用荧光素标记的BPC特异性单抗或与待测成分特异性结合 且能发荧光的物质 + 分离BPC或全血 去除未反应的单抗或荧光物质; 特异检测5000-10000 BPC光散射与荧光信号（单色或多色）; 获取, 统计数据, 分析, 根据光散射与荧光强弱 计算阳性BPC百分比或所测成分的含量（GP/BPC). FCMFCM分析血小板方法分析血小板方法 抗凝血2ul 调节BPC 105-106/ml 2-80C 预冷的1% 多聚

5、甲醛1ml固定，2h BPC特异单抗+荧光剂(异硫氰酸荧光素)(CD42b FITC) +SSC+FSC设门-特异性选择BPC. 检测10000-100000 BPC表面荧光信号. FCM获取，分析数据 结果表示: 平均颗粒荧光强度-活化时GP:Ag量 特异性荧光抗体结合阳性BPC% -x.x. 血小板光散射图血小板光散射图 FCMFCM分析血小板的客观评价分析血小板的客观评价 利用各种BPC特异性单克隆抗体直接标记荧光素分子 优点： 1、接近生理条件直接测定血小板: 2、微量（2ul) 3、快速、准确，排除非BPC颗粒干扰，误差ELISA (单个BPC上PAIg) MAIPA（单抗特异性捕获

6、血小板抗体试验） PAICA（ BPC相关IgG特异性试验） 特异性 MAIPA PAICA 血小板抗体免疫流式检测法（PAICA) FCMFCM检测检测PAIgPAIg在诊断在诊断ITPITP中的评价中的评价 1、用于严重BPC减少者PAIgG检测； 2、特异性0.05）， CD61敏感性86.2%，特异性90%。（薛磊、朱微波） 网织血小板（网织血小板（RP)RP)检测检测 骨髓最早释放到外周血中含mRNA的新生BPC，用荧光染料噻唑橘红或 金胺橙标记BPC RNA。反映骨髓血小板生成状态的指标。 传统方法：1、手工计数；2、自动计数 FCM临床应用： 1、ITP 2、干细胞移植：预测骨髓

7、造血恢复，在血小板恢复前增高； 移植后10-26天,RP由2.91.713.66.4,达峰值后3天。 血小板45./L, RP逐渐降低。 3、化疗后骨髓抑制与恢复； 4、肝移植 网织血小板检测临床意义网织血小板检测临床意义 ITP：BPC破坏外周血新生BPC含mRNA的BPC荧光强度、 百分率增加，且与BPC呈负相关： BPC，网织BPC-负相关 治疗有效： BPC，网织BPC。 治疗无效： BPC，网织BPC持续。 Aa： BPC，网织BPC FCMFCM检测在检测在ITPITP诊断中的意义诊断中的意义 1、PAIgG 50-60%阳性，可鉴别免疫与非免疫性BPC减少， 敏感性49-66%；

8、特异性78-93%； 2、特异性抗GPIIb/IIIa抗体( CD61/CD41） 敏感性86.2%，特异性 90%； 3、网织BPC; BPC-负相关； 4、BPC微粒（PMPS）：BPC破坏产生 BPC PMPS。 FCM FCM在血栓性疾病中的应用在血栓性疾病中的应用 1、血栓前（高凝）状态：BPC“活化”是参与血栓的前提，BPC活化指标： TXB2、GP（IIb/IIIa、Ib、V）、-TG、PF4、 GMP-140； 2、冠心病：P-sel；CD41/CD61；sGC均 不稳定心绞痛： P-sel，GPV AMI：P-sel，GPV ； 溶栓再通：1-6h， P-sel，GPV 溶栓

9、未通： P-sel，GPV ； 3、脑缺血：活化标志物均； 4、糖尿病： P-sel ； BPC活化与血管病变有关 DM无血管病变：P-sel ；DM+血管病变：P-sel FCMFCM分析血小板活化原理分析血小板活化原理 血小板活化过程中生理、生化改变： 1、最早期反应：Ca+流 2、形态改变（圆盘伪足）：光散射改变 3、膜糖蛋白改变：GPIb/IX/V；GPIIb/IIIa+构型改变 4、颗粒膜蛋白表达：活化血小板标志物 释放反应a颗粒、溶酶体膜蛋白（CD62P、CD63） 5、暴露促凝表面： PS、PI暴露于膜表面 促进FV/Va、FVIII/VIIIa、FX/Xa、FIIa+Ca+ 参

10、与凝血 血小板活化血小板活化 -granule Weibel-Palade body Endothelial cells Platelets Thrombin P-Selectin 活化血小板的表面标志活化血小板的表面标志 RestingActivated P-Selectin FCMFCM血小板活化分析血小板活化分析 血小板活化: 受体介导的静止血小板对各种刺激物的反应。 激活颗粒膜蛋白(CD62P)在质膜上表达活化标志物活化标志物; ; GP构型改变与血浆中相应的受体蛋白结合 BPC聚集； BPC内分泌反应; BPC膜内、膜表面、血浆中GP成分改变 BPC活化的标志物。 利用各种活化依赖型

11、单抗可反映BPC活化程度。 血小板活化标志物血小板活化标志物 -TG、PF4、TXB2、 血小板+白细胞(CD11c/CD18)-NC激活,介导炎症,血栓. 活化依赖的GPIIb/IIIa复合物（GPIIb/IIIa） P-选择素（P-sel、GMP-140，金标准） 糖盏蛋白（GC） 糖蛋白V（GPV） BPC微颗粒（PMP） 胞质内游离钙浓度: Fluo-3-Am 连续,动态,早期 血小板表面活化依赖的变化血小板表面活化依赖的变化 P-P-选择素（选择素（P-selectinP-selectin） （ 颗粒膜糖蛋白，颗粒膜糖蛋白，GMP-140GMP-140，D62pD62p） 整合型-

12、跨膜区域，静止BPC 颗粒和活化的BPC质膜上； 静止BPC被凝血酶活化颗粒与质膜融合 BPC膜表达P-sel 活化BPC特异性标志物(金标准分子) 可溶性- 无跨膜区域(sP-selectin) ， BPC活化时释放到血浆中反映BPC活化的分子标志物。 -granule Weibel-Palade body Endothelial cells Platelets Thrombin P-Selectin Is a Surface Marker for Activated Platelets RestingActivated P-Selectin 各组各组s sP-selectinP-selec

13、tin比较比较（X XS S，g g /L /L） 组别组别 例数例数 P-P-选择素选择素 control 50 control 50 15.6215.625.895.89 UA 15 30.73. UA 15 30.73.10.1410.14* * AMI 37 54.56AMI 37 54.5611.8711.87* * * *与正常对照组比较与正常对照组比较 P0.01P0.01 血小板糖盏蛋白血小板糖盏蛋白 （glycocalicinglycocalicin，GCGC） GPIb（ GPIb，）胞外部分 与vWF、凝血酶结合位点 GPIb对多种蛋白酶敏感，水解后释放 GC。 直接反映

14、蛋白酶活化和BPC破坏的分子标志物, 判断BPC活化或黏附功能受损,有助于血栓研究. sGC sGC 正常值的建立及临床应用正常值的建立及临床应用 表表1. 1. 各组血浆各组血浆sGCsGC水平比较水平比较（X XS S，g g /L /L） 组别组别 例数例数 sGCsGC control 50 824.50 control 50 824.50 225.11225.11 UA 15 2073.34UA 15 2073.34721.14721.14* * AMI 37 2415.60 AMI 37 2415.60887.62887.62* * * *与正常对照组比较与正常对照组比较 P0.0

15、1P0.01 血小板糖蛋白血小板糖蛋白V V（GPVGPV） 与凝血酶受体GPIb-IX-V复合物中亚单位（GPIb-IX；GPV）。 GPV促进BPC表面GPIb-IX表达；增加与vWF结合；BPC活化负调控因子。 凝血酶活化BPC裂解GPV在膜外部分水解片段入循环sGPV 活化BPC新的分子标志物. 冠状动脉粥样硬化时血浆GPV增高。 表表2. 2. 各组各组sGsGPVPV水平水平比较比较（X XS S，g g /L /L） 组别组别 例数例数 sGPVsGPV control 50 28.5 control 50 28.55.895.89 UA 15 118.47UA 15 118.4

16、758.9358.93* * AMI 37 60.01 AMI 37 60.0143.3543.35* * * *与正常对照组比较与正常对照组比较 P0.01P 2倍ITP+出血，提示PMP有止血功能。 PMPS：TTP、TIA、AMI、DM、APL、CPB (心肺旁路术)、ACS. PMPS：罕见、Scott综合征、PMP形成障碍。 PMPPMP检测的临床意义检测的临床意义 1、肝素引起的血小板减少症（HIT）/HIT血栓 抗肝素抗体+PF4复合物+BPC FcrIIa BPC激活PMP血栓 2、急性冠状综合征：活化BPC PMP 。 3、糖尿病： PMP； DM+肾病PMP ，提示：检测D

17、M并发症。 4、PNH+血栓：补体损伤CD55/59 的BPC对凝血酶激活敏感 BPC活化 PMP FCM FCM在血栓性疾病应用总结在血栓性疾病应用总结 1、血栓前（高凝）状态：BPC“活化”是参与血栓的前提，BPC活化指标： TXB2、GP（IIb/IIIa、Ib、V）、-TG、PF4、 GMP-140； 2、冠心病：P-sel；CD41/CD61；sGC均 不稳定心绞痛： P-sel，GPV AMI：P-sel，GPV ； 溶栓再通：1-6h， P-sel，GPV 溶栓未通： P-sel，GPV ； 3、脑缺血：活化标志物均； 4、糖尿病： P-sel ； BPC活化与血管病变有关 DM

18、无血管病变：P-sel ；DM+血管病变：P-sel 血小板无力症（血小板无力症（GTGT） 1918年瑞士Glanzmann报道 BPC膜GPIIb-IIIa缺乏或质缺陷，BPC活化后不能结合BPC黏附蛋白 （Fg、vWF） BPC聚集功能障碍。 诊断： 血小板正常，散在分布；出血时间延长； 对各种聚集剂不聚集或严重减低；重症BPC中无Fg。 确诊：GPIIb-IIIa缺乏或减少（FCM） 治疗：输注BPC；DDAVP；rFVIIa FCMFCM检测检测PAIgPAIg在诊断在诊断ITPITP中的评价中的评价 1、用于严重BPC减少者PAIgG检测； 2、特异性特异性结合抗体（MAIPA、P

19、AICA） 特异性78-93%。敏感性49-66%； 可鉴别免疫与非免疫性BPC减少； 3、阴性不能排除；在诊断ITP中仅有参考价值。 目前国外（英国）已不作为ITP诊断标准。 FCMFCM检测在检测在ITPITP诊断中的意义诊断中的意义 1、PAIgG 50-60%阳性，可鉴别免疫与非免疫性BPC减少， 敏感性49-66%；特异性78-93%； 2、特异性抗GPIIb/IIIa抗体( CD61/CD41） 敏感性86.2%，特异性 90%； 3、网织BPC; BPC-负相关； 4、BPC微粒（PMPS）：BPC破坏产生 BPC PMPS。 FCMFCM分析血小板活化原理分析血小板活化原理 血小板活化过程中生理、