流式细胞仪的应用

1、流式细胞仪特点 开滦医院引进的BD公司FACSCalibur流式细 胞仪 BD LSRBD LSR FACSAriaFACSAria 流式细胞仪的工作原理 信号检测- -散色光 它反应细胞FSC（小角散 射)光它反应细胞的相对 大小和截面积的大小 SSC (90度角散射光)代 表细胞的颗粒度和精细 结构的变化 的物理特性,根据前侧向 散射光，可以把不同类 型的细胞群加以区分 信号检测-荧光信号 流式细胞术的操作流程 流式细胞仪检测范围 1 对细胞抗原的检测 各种血细胞都有相应的抗原表达方式，并且不同成熟阶 段表达的抗原种类也不完全相同。通过免疫荧光标记技 术将细胞表面抗原同标记有特异染料的一种

2、以上单克隆 抗体结合后，在流式细胞仪同一激光光源激发下产生几 种特异荧光色，由荧光检测器对每个细胞的体积、结构、 荧光种类及性质等多种参数同时测定，分析得到细胞群 体的多种表面抗原的表达情况。FCM也可用于特异性细 胞质内或细胞核上抗原的检测，并协同其他实验指标预 示疾病的预后2 。FCM也为网织红细胞计数提供了 快速、准确的测试手段，可通过某些染料与网红中RNA 结合，在FCM测量时发出特定颜色的荧光，进行单参数 定量RNA。 2 对淋巴细胞及其亚群的分析 FCM进行淋巴细胞及其亚群的分析，分类更 客观、准确。使用流式细胞仪的绝对计数 系统，即加入已知数量的荧光微球，通过 仪器测定时收获的细

3、胞数量和微球数量及 血液标本用量，直接得到每微升全血中T淋 巴细胞亚群的绝对计数（个/l）3 。 用FCM检测PBMC中p24、p24nef、p18等HIV 抗原阳性的CD4 + 细胞数可监测体内HIV复 制情况，结果表明HIV抗原阳性细胞与CD4 + 细胞数量负相关 4 。 T淋巴细胞检测 CD8+Ts淋巴细胞检测 B淋巴细胞检测 NK细胞检测 3 白细胞分类分析 利用FCM的体积测定和细胞结构测定来检测 每个白细胞的光散色强度，它与细胞体积、 细胞膜结构、细胞核形状、细胞质性状等 多种因素有关，经过分析可得到中性粒细 胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞 的检测结果。这种方法应用于血细胞计

4、数 速度快、结果准确，大大提高了临床实验 室的工作效率 5 。 4 病毒抗原的检测 FCM既可用于检测受染细胞内的病毒抗原，也可检测 受染细胞表面的病毒抗原。由于FCM检测的是单个细 胞，因此FCM检测受染细胞适用于血液、支气管灌洗 液、尿标本以及经酶消化过的组织细胞。同时由于 FCM为多参数分析，因此可在单个细胞中同时获得多 个分析参数并能定量检出受染细胞。当用不同荧光染 料标记不同的病毒抗原特异性抗体或将特异性病毒抗 体与不同大小的乳胶颗粒相联时，FCM可同时检测到 同一样本中的多种病毒或病毒抗原 6 。 5 病毒抗体检测 利用吸附有病毒抗原的聚苯乙烯微球作为 载体的病毒抗体FCM分析技术

5、已广泛应用。 结合流式细胞仪与微球杂交法可同步检测 同一反应管中HIV、HCV、HBV的数目和种类， 其基本原理为将检测不同病原体的探针分 别包被微球，流式细胞仪分辨特异性结合 后发出的不同强度的荧光。当用FCM技术检 测HCV核心抗原、NS 3 抗原抗体时，其灵 敏度比酶标免疫技术高5倍左右 7 6 在器官移植中的作用 FCM通过检测受者血清中抗供者的抗HLA的抗体，根据 抗体的种型、效价、靶抗原和器官移植的类型不同， 抗体介导的排斥反应也有所不同，FCM比传统方法更 灵敏、操作时间更短并可同时检测细胞亚型、分辨出 IgG和IgM抗体。巨细胞病毒（CMV）能在白细胞内繁 殖并合成CMV特异性

6、蛋白，通过FCM检测CMV特异性抗 原及其抗原分泌量，这种技术用于CMV感染检测时感 染后4h便可检出T淋巴母细胞中CMV-DNA，从而可快速、 准确地反映CMV在移植受者中的早期感染状况，对预 防和减少感染具有重要意义 8 。以FCM监测肾移 植受体CD8 + 、CD38 + 、T细胞亚群的变化也可监测 CMV感染 9 。 7 检测血小板自身抗体 FCM检测PAIgG与ELISA相比更简便省时，检 测中操作步骤少。由于血小板被抗体-荧光 素标记而显示阳性，所以不受其它种类细 胞或碎片的影响，重复性好，可检测成批 或单个标本，可直观地显示结合PAIgG量不 同的血小板群体，并可在同一份标本上同

7、 时测定聚集和释放功能 10 。 8 在白血病诊断中的作用 白血病是白细胞在分化到某个阶段受阻后 异常增殖的结果，利用白细胞分化不同阶 段出现的细胞表面标志可以对白血病进行 免疫分型。过去对造血细胞和免疫细胞分 类主要是依据细胞形态学和细胞免疫化学 染色来进行的，现在将多种检测手段相结 合，可为临床诊断、治疗监测和预后提供 更多、更有力的依据。通过FCM检测各种急 性白血病细胞表面抗原的表达，对临床诊 断尤为重要 11 。 9 在肿瘤诊断中的作用 通过DNA含量分析的细胞周期分布，可反映 肿瘤细胞的增殖状态，对治疗及预后有十 分重要的意义。近年来，流式细胞测量法 DNA分析越来越多地应用于实体

8、瘤患者。 DNA非整倍体的出现率和癌变与不典型增生 程度密切相关。DNA非整倍体可能是癌前病 变发生早期癌变的一个早期指标 12 。 10 在微型生物学研究中的应用 从现有的微型生物核糖体RNA序列出发，设计分类专 用的核酸探针，它们能与核糖体RNA分子一些区域互 补，而这些RNA分子对于目标分类群是唯一的，通过 荧光标记寡核苷酸链探针与细胞内同源RNA序列结合， 目标种可被测出，它们的系统发育被确定。在这一研 究中，通过原位杂交，用FCM确定杂交信号，可定量 杂交信号强度，而细胞和特异探针杂交的平均荧光强 度与细胞和非特异探针杂交平均荧光强度的比率，能 计算和估测探针特异性和灵敏性。由此确定

9、微型生物 DNA含量与倍体水平 13 11 用于抗生素敏感性试验 近年来，FCM用于细菌的药敏效应研究已有 较大发展，FCM与荧光染料的联合运用可判 断细菌活力和功能状态，由于速度快，该 方法已被建议用作临床实验室的常规药敏 试验 14。 综上所述，FCM具有快速、灵敏及能同时进 行多参数分析的优点，广泛应用于多种学 科，具有广阔的应用前景。 目前的流式细胞仪应用研究 1、 2 3 4 5 癌症患者外周血细胞DNA与T细胞亚群、NK细胞活性关系的研究 白血病的分型 肝癌患者免疫性预后的研究 中西医结合治疗胰腺炎后外周血中T细胞亚群的变化分析（备选题） （备选题） 参考文献 1 Grogan W

10、M，Collins JM.Guide to flow cytometry methods.New York:Marcel Dekker，1990，29-190. 2 Islam D，Lindberg AA，Christensson B.Peripheral blood cell prepare in fluences the level of expression of leukocyte cell surface marshal assessed with quantitative multicolor flow cytometry.Cytometry，1996，22:128-134. 3

11、Schnizlein-Bick CT，Spritzler J，Wilkening CL，et al.Evaluation of TruCount absolute-count tube for determining CD4and CD8cell numbers in human immunodeficiency virus- positive adults.Clin Diagn Lab Immunol，2000，7:336-343. 4 Ghate MV，Mehendale SM，Mahajan BA，et al.Relationship between clinical condition

12、 and CD4counts in HIV-in fected predicted persons in Pune，maharashtra，India.Natl Med J India， 2000，13（4）:183-187. 5 Impert MBM，Nell R Anne SP，et al.Development of a method direct quantification of cytomegalovirus antigenemia by flow cytometry.Clin Microbiol Infect，1997，10:2665-2669. 6 Iannelli DD，Ap

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14、 flow cytometry.Cytometry，1997，29:106- 112. 8 Kusne S，Grossi P，Irish W，et al.Cytomegalovirus PP65antigen monitoringas a guide for preemptive therapy:cost effective strategy to prevention of cytomegalovirus disease in adult liver transplant recipient.Transplantation，199 9，68:1125-1131. 9 Belles-Isles

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16、g.Br J Haematol，1999， 104:174-183. 11 Zoeteweij JP，Eyes ST，Orenstein JM，et al.Identification and rapid quantification of early-and late-lytic huma 2 对淋巴细胞及其亚群的分析 FCM进行淋巴细胞及其亚群的分析，分类更 客观、准确。使用流式细胞仪的绝对计数 系统，即加入已知数量的荧光微球，通过 仪器测定时收获的细胞数量和微球数量及 血液标本用量，直接得到每微升全血中T淋 巴细胞亚群的绝对计数（个/l）3 。 用FCM检测PBMC中p24、p24nef

17、、p18等HIV 抗原阳性的CD4 + 细胞数可监测体内HIV复 制情况，结果表明HIV抗原阳性细胞与CD4 + 细胞数量负相关 4 。 11 用于抗生素敏感性试验 近年来，FCM用于细菌的药敏效应研究已有 较大发展，FCM与荧光染料的联合运用可判 断细菌活力和功能状态，由于速度快，该 方法已被建议用作临床实验室的常规药敏 试验 14。 综上所述，FCM具有快速、灵敏及能同时进 行多参数分析的优点，广泛应用于多种学 科，具有广阔的应用前景。 目前的流式细胞仪应用研究 1、 2 3 4 5 癌症患者外周血细胞DNA与T细胞亚群、NK细胞活性关系的研究 白血病的分型 肝癌患者免疫性预后的研究 中西医结合治疗胰腺炎后外周血中T细胞亚群的变化分析（备选题） （备选题） 5 Impert MBM，Nell R Anne SP，et al.Development of a method direct quantification of cytomegalovirus antigenemia by flow cytometry.Clin Microbiol Infect，1997，10:2665-2669. 6 Iannelli DD，Apice L，Cottone C，et al.Simultaneous detection of cucumber mos