第三章 食品微生物检验的基本程序

1、2021-6-23华南农业大学食品学院王丽1 第三章第三章 食品食品微生物检验的基本程序微生物检验的基本程序 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽2 本章的主要内容本章的主要内容 一、食品微生物检验的一般步骤一、食品微生物检验的一般步骤 二、检验前的准备二、检验前的准备 三、样品的采集三、样品的采集 四、样品的送检四、样品的送检 五、样品的处理方法五、样品的处理方法 六、致病菌检验参考菌群的选择六、致病菌检验参考菌群的选择 七、样品的检验七、样品的检验 八、检验结果的报告八、检验结果的报告 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽3 一、食品微生物检验的一般步骤一、食品微生物检验的一般

2、步骤 样品采集样品采集 样品处理样品处理 样品保存样品保存 选择参考菌群选择参考菌群 检验前的准备检验前的准备 菌落总数 大肠菌群 致病菌 分离培养 分离 培养 增 菌 纯化 染色镜检染色镜检 生化试验 血清学试验血清学试验 动物试验 结果报告结果报告 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽4 二、检验前的准备工作二、检验前的准备工作 n建立一个无菌取样的分析清单 ，按清单准 备工具、容器、设施（衣服、发网等）； n盛样品的容器应当被预先标识，如样品号、 取样日期、取样人等； n检查所有取样设施、工具和容器的灭菌日 期、灭菌时间，并做好标识； n准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼 脂或其

3、他选择必培养基； n注意干冰或湿冰的准备及保存。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽5 三、食品检验样品的采集 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽6 （一）采样的意义 n便于便于食品卫生质量监督管理；食品卫生质量监督管理； n鉴别食品中是否存在有毒有害物质；鉴别食品中是否存在有毒有害物质； n为新产品、新资源利用、新食品化为新产品、新资源利用、新食品化 工产品、新工艺投产前进行卫生鉴工产品、新工艺投产前进行卫生鉴 定。定。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽7 （二）样品的种类 n大样：整批检验 n中样：采样员从大样各部分取得的混合样 （250克） n小样：检验员用来检

4、验的样品（一般为25 克）。 n表面污染：50cm2 （5cm 210处） n罐头食品：罐/批、班次 一般每个品种3 罐，可以以每配料罐或灭菌锅为一批。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽8 （三）采样的原则（三）采样的原则 代表采样当时的及样品整体的情况； 考虑到各种影响样品质量的因素，防止样 品受到外源性污染； 防止样品变质 防止食品中固有微生物的数量和生长能力 发生变化 。 不得加入防腐剂、固定剂等。 样品采集和现场测定必须有二人以上参加 。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽9 （四）取样方案（四）取样方案 n进出口贸易合同对食品抽样量有明确规定的，按进出口贸易合同对食

5、品抽样量有明确规定的，按 合同规定抽样。合同规定抽样。 n合同没有具体抽样规定的，可根据检验的目的，合同没有具体抽样规定的，可根据检验的目的， 产品及被抽样品批的性质和分析方法的性质确定产品及被抽样品批的性质和分析方法的性质确定 抽样方案。抽样方案。 n参照同一产品的品质检验抽样数量抽样，或按单参照同一产品的品质检验抽样数量抽样，或按单 位包装件数位包装件数N的开平方值抽样。的开平方值抽样。 n参照参照GB/T 4789.1-2010中华人民共和国国家标中华人民共和国国家标 准准 食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验 总则总则之采样数量。之采样数量。 n国际上最为流行的抽样方案为国际上最为

6、流行的抽样方案为The International Commission on Microbiological Specification for Foods推荐的抽样方案和随机抽样方案推荐的抽样方案和随机抽样方案。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽10 抽样检验 1.经验（百分比抽样）：批量不同时，相同质量可能有不同的判经验（百分比抽样）：批量不同时，相同质量可能有不同的判 断结果。断结果。 2.统计抽样检验：统计抽样检验： N 批产品 n 样本 d 不合格品 随机抽 取 全检 4 3 2 1 0 批产品合格 批产品不合格 dAC dRe 比较 判断准则（Ac,Re） N,Ac,R

7、e用数理统计的方法来确定 不足：批产品合格中可能包括不合格品，反之批产品不合格中可能包括合格品。 全检不能被否定，全检仍适用于价值较大，后果影响严重的产品。如高危害产品等 AQL接收质量限接收质量限 Ac接收数接收数 Re拒收数拒收数 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽11 国际食品微生物专业委员会 (ICMSF)推荐的抽样方案 采样设想及其基本方法采样设想及其基本方法 可充分混合的物体，用于分析的样品可能代表所抽“一批” （lot）样品的真实情况，采样时可以充分混匀后随即采样； 不可充分混合的物体，在“多批”（Lots或“batchers”） 食品的情况下就不能如此抽样，因为“一批”

8、容易包含在 微生物的质量上差异很大的多个单元。因此在选择抽样方 案之前，必须考虑诸多因素（ICMSF，1986），包括： 检验目的 产品及被抽样品的性质 分析方法 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽12 国际食品微生物专业委员会 (ICMSF)推荐的抽样方案 采样基本原则 （1）各种微生物本身对人的危害程度各有不 同。 （2）食品经不同条件处理后，其危害度变化 情况：降低危害度；危害度未变；增加 危害度。 根据（1）（2）的情况来设定抽样方案并规 定其不同采样数。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽13 几个字母代号 nn：系指一批产品采样个数。 nc：系指该批产品的检样菌数中

9、，超过限量的检 样数，即结果超过合格菌数限量的最大允许数。 nm：系指合格菌数限量，将可接受与不可接受 的数量区别开。 nM：系指附加条件，判定为合格的菌数限量， 表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的 界限。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽14 ICMSF的二级抽样方案 n二级法只设有n、及m值 n以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判 定标准m值，超过m值的，则为不合格品。 n以生食海产品鱼为例 n=5，c=0，m=102， （n=5即抽样5个，c=0即意味着在该批检样中， 未见到有超过m值的检样，此批货物为合格品)。 n在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案 202

10、1-6-23华南农业大学食品学院王丽15 ICMSF的三级抽样方案 n三级法有n、c、m及M值。M即附加条件后判定合格的 菌数限量。 n设有微生物标准m及M值两个限量，超过m值的检样， 即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数， 作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过 M值者，则为不合格。 n例如：冷冻生虾的细菌数标准 n=5，c=3， m=102CFU/g，M=103CFU/g，其意义是从一批产品中， 取5个检样，经检样结果，允许3个检样的菌数是在 mM值之间，如果有3个以上检样的菌数是在mM 值之间或一个检样菌数超过M值者，则判定该批产品 为不合格品。 n对健康危害低的情

11、况下建议使用三级抽样方案 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽16 ICMSF的随机抽样方案 n随机抽样，就是保证在抽取样本过程中，排除一 切主观意向，使批中的每个单位产品都有同等被 抽区的机会的一种抽样方法。 n在现场抽样时，可利用随机抽样表进行随机抽样。 随机抽样表系用计算机随机编制而成，包括一万 个数字。 n其使用方法如下：a先将一批产品的各单位产品 （如箱、包、盒等）按顺序编号。如将一批600包 的产品编为1、2600。b.随意在表上点出一个 数。c.根据单位产品编号的位数进行抽样。重复 抽样，直到完成应抽样品件数为止。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽17 （六）食品

12、微生物检验采样方法（六）食品微生物检验采样方法 n采样原则采样原则： 能采取完整包装的样品就不拆开取样，能采取完整包装的样品就不拆开取样， 必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取 样样. 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽18 1、直接食用的小包装食品、直接食用的小包装食品 直到检验前不要开封，以防污染直到检验前不要开封，以防污染 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽19 2、统装或大容器包装的液体食品、统装或大容器包装的液体食品 n抽样前摇动均质，取样不超过其容量的抽样前摇动均质，取样不超过其容量的 四分之三，测温，记录，冷却（四分之三，测温，

13、记录，冷却（ 0- 4 ），取样检测前再混匀一次，用），取样检测前再混匀一次，用 100mL无菌注射器抽取无菌注射器抽取,注入无菌盛样容注入无菌盛样容 器。器。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽20 3、统装或大容器包装固体和半固体食品、统装或大容器包装固体和半固体食品 n大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割 取，并注意其代表性；取，并注意其代表性； n若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为 检验食品品质的情况，应从深部取样。检验食品品质的情况，应从深部取样。 （肉类、鱼类或类似食品要将表面

14、样品和深层样肉类、鱼类或类似食品要将表面样品和深层样 品分开保存，防止交叉污染品分开保存，防止交叉污染） 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽21 4、统装或大容器包装的冷冻食品 n取样时可以用锥子、木钻等获取深层样 品。样品一旦融化，不可使其再冻，保 持冷却即可。 n大包装小块冷冻食品按小块个体采取； n大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削 取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放 入无菌容器。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽22 5、生产工序监测采样、生产工序监测采样 n车间用水车间用水：采用带有防尘磨口瓶塞的广口瓶。 取样时应先用流水处理出水口，再消毒出水口， 才能取样；若怀疑

15、出水口的卫生状况，可以连带 取样。取样时避免用手接触水样或取样瓶内部。 对于用氯气处理过的水，取样后在每100mL水样 中加入0.1mL的2硫代硫酸钠。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽23 n表面取样表面取样：通过惰性载体将表面样品上的微生 物转移到合适的培养基中进行微生物检测。适应 于菌体数量较少的样品。载体包括清水、拭子、 胶带等，其它有琼脂肠、影印盘、触片法、表面 切片法等. 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽24 工作台：工作台：将经灭菌的内径为5cm5cm的灭菌规 格板放在被检物体表面，用一浸有灭菌生理盐 水的棉签在其内涂抹10次，然后剪去手接触部 分棉棒，将棉签

16、放入含10mL灭菌生理盐水的 采样管内送检。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽25 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽26 空气监测空气监测：采样时，将含营养琼脂的平皿 （直径9cm）置采样点（约桌面高度），打开 平皿盖，使平皿在空气中暴露5min。 平皿 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽27 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽28 生产工序监测采样生产工序监测采样 n工人手工人手 被检人五指并拢，用一浸湿生理盐水的棉签在 右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然 后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL 灭菌生理盐水的采样管内送检。 每只手表面细菌菌落

17、总数（cfu/只手） 平板上平均细菌菌落数10 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽29 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽30 6、采样标签的填写 n对采样前后的大、中、小样均要进行标识， 注明：编号、品名、来源、批号、数量、 时间、采样人姓名、采样条件，并填写记 录表格。 n盛样容器必须有和样品一致的标记，并确 保标记牢固并防水。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽31 采样单采样单 样品编号：样品编号： 产产 品名称（商品名）品名称（商品名）_规格型号规格型号_注册商标注册商标_ 生产厂家生产厂家_ 通讯地址通讯地址_邮政编码邮政编码 受检地点受检地点_ 通讯地址通

18、讯地址_ 邮政编码邮政编码 采样地点采样地点_ 采样日期采样日期_采样基数采样基数 _ 生产日期生产日期_ 批号批号_ 产品依据标准产品依据标准_ 有效成分及含量有效成分及含量_ 检验目地检验目地_检测项目检测项目_ 采样人仔细阅读以下句子，然后签字我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填写的合采样人仔细阅读以下句子，然后签字我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填写的合 法性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和公正性。法性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和公正性。 代表单位（章）代表单位（章） 代表单位（章）代

19、表单位（章） 签字签字 签字签字 日期年月日日期年月日 日期日期 年月日年月日 备注备注 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽32 四、样品的送检要求 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽33 1 1、样品的运送、样品的运送 注意防污染、防散漏、防 变质 n防护包装：液体防漏、冷冻食品防融，一般用减震防护包装：液体防漏、冷冻食品防融，一般用减震 材料（泡沫材料）和隔热箱（内装干冰以维持材料（泡沫材料）和隔热箱（内装干冰以维持 00）；）； n尽快送检：尽快送检：32.5cm深度）深度） 用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或 来苏尔

20、消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启 开；开； 含有二氧化碳的样品含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖 紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出 后，取样25mL检验； 酸性饮料：酸性饮料：pH4.5 用灭菌的10%Na2CO3调至中性。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽39 2.盒装或软塑料包装样品的处理 将其开口处用将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭酒精棉擦拭消毒，用灭 菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒 液的纱布在剪开部分，直接吸取样品液的纱布在剪开部分，直接吸取样

21、品25mL ， 或倾入另一灭菌容器中再取样或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。检验。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽40 3.半固体或粘性液体食品 融化（融化（45水浴），小于水浴），小于15min，取样。，取样。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽41 （二）固体样品的处理（二）固体样品的处理 1.捣碎均质法捣碎均质法 2.剪碎振摇法剪碎振摇法 3.研磨法研磨法 4.整粒振摇法整粒振摇法 5.胃蠕动均质法胃蠕动均质法 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽42 1.捣碎均质法捣碎均质法 n将中样将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中剪碎或搅拌混匀，从中 取取25g

22、放入带放入带225mL稀释液的无菌均质稀释液的无菌均质 杯中，杯中，800010000r/min均质均质12min 即可。即可。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽43 2.剪碎振摇法剪碎振摇法 n将中样将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中剪碎或搅拌混匀，从中 取取25g检样进一步剪碎，放入带检样进一步剪碎，放入带225mL 稀释液和直径稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释左右玻璃珠的稀释 瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，次， 振幅要大于振幅要大于40cm。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽44 3.研磨法研磨法 n 将中样将中样(100g)剪

23、碎或搅拌混匀，剪碎或搅拌混匀， 从中取从中取25g检样放入无菌钵中充分研磨检样放入无菌钵中充分研磨 后，再放入带有后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀无菌稀释液的稀 释瓶中，盖紧盖后充分摇匀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽45 4.整粒振摇法整粒振摇法 n有完整自然保护膜的颖粒状样品(如蒜瓣、 青豆等)，直接称取25g整粒样品置于带有带有 225mL稀释液和直径稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀左右玻璃珠的稀 释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振次，振 幅要大于幅要大于40cm。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽

24、46 这是国外使用的一种新型的均质样品的方这是国外使用的一种新型的均质样品的方 法，将一定量的样品和稀释液放入无菌均法，将一定量的样品和稀释液放入无菌均 质袋中，开机均质。均质器有一个长方形质袋中，开机均质。均质器有一个长方形 金属盒，其旁安有金属叶板，可打击塑树金属盒，其旁安有金属叶板，可打击塑树 袋，金属板由恒速马达带动，作前后移动袋，金属板由恒速马达带动，作前后移动 而撞碎样品。而撞碎样品。 5.胃蠕动均质法胃蠕动均质法 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽47 （三）冷冻样品的处理（三）冷冻样品的处理 n冷冻样品，先将中样在冷冻样品，先将中样在04 下解冻，下解冻， 时间不能超过时间不能超过18h，或在，或在 45 下解冻，下解冻， 时间不能超过时间不能超过15min。再取检样。再取检样25g做做 稀释处理。稀释处理。 2021-6-23华南农业大学食品学院王丽48 六、样品的稀释 n普通稀释液为浓度普通稀释液为浓度0.85的氯化钠溶液、的氯化钠溶液、pH6.87.0 的无菌蛋白胨水，磷酸缓冲液等，高溶解度的样品可的无菌蛋白胨