显微注射海藻糖对卵母细胞玻璃化冷冻效果影响的研究

1、安徽医科大学硕士毕业论文目录中英文缩略词对照表1中文摘要2英文摘要5第一部分海藻糖联合人工辅助激活在家兔成熟卵母细胞玻璃化冷冻中的应用前言10材料与方法12结讨结果16论20论23参考文献23第二部分海藻糖应用于人类成熟卵母细胞玻璃化冷冻及安全性研究前言27材料与方法28结讨结果31论34论36参考文献36附致综录40谢42述43安徽医科大学硕士毕业论文中英文缩略词对照表缩写MICSI英文全称metaphase intracytoplasmic sperm injection中文全称第二次减数分裂中期单精子卵胞浆内注射IVF-ET in vitro fertilization and embr

2、yo transfer体外受精胚胎移植技术HMGPMSGFSHHCGOCCsGnRHaHTFPVPAOAPBSHSAhuman menopausal gonadotropinpregnant mares serum gonadotrophinfollicle stimulating hormonehuman chorionic gonadotrophinoocyte-cumulus complexgonadotrophin releasing hormone agonisthuman tubal fluidpolyvinyl pyrrolidoneartificial oocyte activ

3、ationphosphate buffer salinehuman serum albumin人绝经期促性腺激素孕马血清促性腺激素卵泡刺激素人绒毛膜促性腺激素卵丘-颗粒细胞复合体促性腺激素释放激素激动剂人输卵管培养液聚乙烯吡咯烷酮人工卵母细胞激活磷酸盐缓冲液人血清白蛋白HEPEs4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4-羟乙基哌嗪乙磺酸EMVMTMDMWMPROHEGFISHDAPISPSSequilibrium mediumvitrification mediumthawing mediumdilution mediumwashing m

4、edium1,2-propanediolethylene glycolfluorescent in situ hybridization4,6-diamidino-2-phenylindoleStatistical Product and Service Solution1平衡冷冻液玻璃化冷冻液融解液稀释液清洗液丙二醇乙二醇荧光原位杂交技术4,6-二脒基-2-苯基统计产品与服务解决安徽医科大学硕士毕业论文显微注射海藻糖对卵母细胞玻璃化冷冻效果影响的研究第一部分海藻糖联合人工辅助激活在家兔成熟卵母细胞玻璃化冷冻中的应用中文摘要目的（1）探讨家兔稳定高效的超促排卵方法，以获得充足的优质家兔卵母细胞

5、；（2）探讨海藻糖的应用能否提高家兔成熟卵母细胞的玻璃化冷冻效果；（3）探讨人工辅助激活技术能否提高冻融后家兔卵母细胞的发育潜能。方法（1）30 只新西兰大耳白兔，平均随机分成 3 组：人绝经期促性腺激素（HMG）+人绒毛膜促性腺激素（HCG）组；孕马血清促性腺激素（PMSG）+ HCG 组；卵泡刺激素（FSH）+ HCG 组，比较 3 组超排卵效果。（2）选择 HMG + HCG 组及 FSH +HCG 组超排卵后获取的 438 枚优质成熟卵母细胞随机分成四组：显微注射海藻糖组（n=143）：将 0.15 mol/L 海藻糖显微注射进入卵母细胞后行玻璃化冷冻，其冷冻保护液含 0.5 mol/

6、L 海藻糖；细胞外海藻糖组（n=127）：卵母细胞未注射海藻糖，其冷冻保护液含 0.5mol/L 海藻糖；常规蔗糖组（n=118）：卵母细胞行常规玻璃化冷冻，冷冻保护液含 0.5mol/L 蔗糖；新鲜对照组（n=50）：卵母细胞未行玻璃化冷冻。以 cryoleaf 为载体，联合使用乙二醇和丙二醇作为冷冻保护剂进行卵母细胞冷冻。（3）卵母细胞冷冻一个月后解冻，复苏后在分裂期培养液中孵育 2 小时后行卵胞浆内单精子显微注射（ICSI），ICSI 后部分卵母细胞入 7%无水乙醇作用 6 分钟（即人工辅助激活）后移入分裂期培养液中培养（激活组），另一部卵母细胞 ICSI 后直接入分裂期培养液中培养（非

7、激活组）；新鲜对照组直接行ICSI。观察各组卵母细胞冻融后存活率、受精率、卵裂率及囊胚率。结果（1）HMG+HCG 组的平均回收卵泡数显著高于 FSH+HCG 组和 PMSG+HCG 组，差2安徽医科大学硕士毕业论文异有统计学意义（P0.05）；FSH+HCG 组与 PMSG+HCG 组平均回收卵泡数比较差异有统计学意义（P0.05）；PMSG+HCG 组超排后的卵巢平均充血卵泡数、平均卵巢囊肿数显著高于 HMG+HCG 组和 FSH+HCG 组，差异有统计学意义（P0.05)；三组冷冻组的卵母细胞受精率、卵裂率、囊胚率均显著低于新鲜对照组（P0.05)，但均显著低于新鲜对照组（P0.05)，

8、但激活组受精率明显高于未激活组（P0.05)，激活组受精率明显高于未激活组（P0.05)，激活组受精率明显高于未激活组（P0.05），显微注射海藻糖组受精率、卵裂率、优质囊胚率高于细胞外海藻糖组和常规蔗糖组，差异均有统计学意义(P0.05)，其中与细胞外海藻糖组受精率、卵裂率差异极显著(P0.01)，与常规蔗糖组卵裂率差异极显著(P0.05）；显微注射海藻糖组与新鲜对照组优质胚胎率、优质囊胚率差异有统计学意义(P0.05)；细胞外海藻糖组及常规蔗糖组与新鲜对照组受精率、卵裂率、优质胚胎率、优质囊胚率差异极显著(P0.05）。结论（1）海藻糖作为细胞内冷冻保护剂能够改善人卵母细胞玻璃化冷冻效果及

9、冻融后卵母细胞发育潜能；（2）显微注射海藻糖不会加重异常囊胚的发生。关键词人卵母细胞 玻璃化冷冻 海藻糖 显微注射 荧光原位杂交技术Study on the Effect of Microinjecting Trehalose onOocytes VitrificationPart IThe Effect of Trehalose and Artificial Oocyte Activation onRabbit Oocytes VitrificationAbstractObjective (1)To explore a stable and high efficient control ov

10、arian hyperstimulationmethod for rabbits to obtain sufficient high-quality rabbit oocytes；(2) To investigatewhether the application of trehalose can improve the effect of vitrification in rabbitoocytes or not; (3) To explore the effect of artificial oocyte activation on thedevelopment ability of fro

11、zen-thawing oocytes.Methods (1) 30 New Zealand white rabbits, randomly divided into 3 groups:HMG+HCG group; FSH+HCG group; PMSG+HCG group, compared the ovarianhyperstimulation effects of three treatment methods. (2) 438 mature oocytes whichcollected from HMG+HCG group and FSH+HCG group were chosen,

12、and wererandomized divided into four groups: Intra- and extracellular trehalose group（n=143）:0.15 mol/L intra- and 0.5 mol/L extracellular trehalose + 15% ethylene glycol (EG) +15% 1,2-propanediol(PROH), trehalose was introduced into oocytes by microinjection;Extracellular trehalose group(n=127): 0.

13、5 mol/L trehalose + 15% EG + 15% PROH ;Sucrose group(n=118): 0.5 mol/L sucrose + 15% EG + 15% PROH; Fresh controlgroup(n=50) : without vitrification. (3) All the oocytes were thawed after 1 month,5安徽医科大学硕士毕业论文fertilized by ICSI after incubated for 2 hours. Then the thawed oocytes from Intra- andextr

14、acellular trehalose group, Extracellular trehalose group and Sucrose group wererandomly divided into two groups respectively: the controlled group and artificialoocyte activation group (AOA). The controlled groups oocytes were cultured incleavage medium after ICSI directly. The AOA groups oocytes we

15、re activated byexposure to 7% anhydrous alcohol for 6 minutes, and then cultured in cleavagemedium. The survival rates, fertilization rates, cleavage rates, blastocyst rates werecompared.Results (1) The average number of follicles retrievaled from HMG+HCG group wassignificantly higher than which ret

16、rievaled from FSH+HCG group and PMSG+HCGgroup (P0.05). And the average number of follicles retrievaled from FSH+HCGgroup was significantly higher than the PMSG+HCG group (P0.05). The averagenumber of hyperaemia follicles and ovarian cysts on the ovary of PMSG+HCG groupwas significantly higher than w

17、hich retrievaled from HMG+HCG group andFSH+HCG group (P0.05); The survival rates, fertilization rates, cleavagerates and blastocyst rates of all the three vitrification controlled groups weresignificantly lower than those of fresh control group (P0.05); but the survival rates, fertilization rates,cl

18、eavage rates and blastocyst rates of all the three vitrification AOA groups were6安徽医科大学硕士毕业论文significantly lower than those of fresh control group (P0.05), but the fertilization rate had significant difference (P0.05), but the fertilization rate had significant difference (P0.05), butthe fertilizati

19、on rate had significant difference (P0.05); Thefertilization rate, cleavage rate and high-quality blastocyst formation rate weresignificantly higher in the Intra- and extracellular trehalose group than Extracellulartrehalose group and Sucrose group(P0.05), the fertilization rate and cleavage ratewer

20、e significantly higher than Extracellular trehalose group(P0.01), and the cleavagerate were significantly higher than Sucrose group(P0.05); The high-quality embryo formation rate andhigh-quality blastocyst formation rate had significant differences between the Intra-and extracellular trehalose group

21、 and Fresh control group(P0.05); The fertilizationrate, cleavage rate, high-quality embryo formation rate and high-quality blastocystformation rate were significantly higher in the Fresh control group than the8安徽医科大学硕士毕业论文Extracellular trehalose group and Sucrose group (P0.05).Conclusions (1) Intrac

22、ellular trehalose appears to improve the effect of vitrification inhuman oocytes, as well as post-thawed human oocytes development; (2)Microinjection of trehalose into oocytes followed by vitrification, ICSI and in-vitroembory culture seems not to induce more abnormal blastocysts.Key WordsHuman oocy

23、te Vitrification Trehalose Microinjection Fluorescence in situ hybridization (FISH)9安徽医科大学硕士毕业论文第一部分海藻糖联合人工辅助激活在家兔成熟卵母细胞玻璃化冷冻中的应用1前 言玻璃化冷冻方法是一种快速、简便、有效的冷冻法，其基本原理是高浓度（46M）的冷冻保护剂溶液经急速降温后，使细胞内外的成分同时玻璃化，很好地避免了冷冻过程中冰晶的形成，缩短了胚胎或者卵母细胞与冷冻保护剂的接触时间，降低了冷冻损伤，冷冻效率得到了进一步提高。冷冻保护剂在卵母细胞的冷冻过程中起关键性作用。适宜的冷冻保护剂可减少冰晶造成的损

24、伤及渗透压改变造成细胞骨架的损伤和染色体的改变等，使细胞在经历冷冻过程后存活1，因而适宜的冷冻保护剂是目前卵母细胞玻璃化冷冻的焦点。糖类不能穿过细胞膜，因而作为非渗透性冷冻保护剂广泛应用于哺乳动物细胞冷冻。目前，蔗糖作为最常用的糖类保护剂常规应用于玻璃化冷冻方法中，但卵母细胞的冷冻效果及后期胚胎发育仍不够理想。作为近年来发现的低温生物领域最佳的保护剂，海藻糖已经在红细胞及造血干细胞冷冻保存等领域取得突破性进展2,3,在人类精子的冷冻保存中也发挥着重要作用 4。而海藻糖应用于卵母细胞玻璃化冷冻的研究甚少。海藻糖因其独特的生物学特性及作用机制在冷冻保护方面优于蔗糖，在卵母细胞玻璃化冷冻技术的应用中

25、逐渐得到重视。虽然海藻糖有着种种优点，其是否适用于卵母细胞冷冻、以何种方式应用仍需进一步探索。一些研究采用多种不同的方法如电通透5、转染6、膜脂向温性换位7等方式将海藻糖载入体细胞内，证实将海藻糖作为细胞内保护剂能更有效地发挥冷冻保护作用。作为哺乳动物体内最大的细胞，由于卵母细胞表面积/体积比值小，这些方法均不能使海藻糖进入卵母细胞内，限制了海藻糖在卵母细胞冷冻中的应用。Eroglu 等8首先应用定量显微注射技术将海藻糖注入受精失败的卵母细胞，10安徽医科大学硕士毕业论文行慢速冷冻后获得了较高的存活率，证实显微注射海藻糖应用于慢速冷冻是冷冻保存人类卵母细胞可行方法之一。将同样的方法应用于小鼠卵

26、母细胞慢速冷冻，获得健康子代，说明微量注入有效浓度的海藻糖不损害小鼠受精卵的发育，进一步证实显微注射海藻糖在卵母细胞冷冻中发挥了保护作用9-11。Younis 等12应用ICSI 注射针将海藻糖注入受精失败的成熟卵母细胞行慢速冷冻，获得了 88.5%的存活率，但未对冻融后卵母细胞发育潜能行进一步研究。海藻糖通过显微注射作为细胞内冷冻保护剂应用于玻璃化冷冻是否可以改善冷冻存活率，是否会提高冻融后卵母细胞的受精及胚胎发育潜能，是否影响胚胎质量，还不明确。而人类卵母细胞来源非常有限,受到法律、伦理等多种因素的限制,很难获得足够数量的人类卵母细胞用于实验研究。卵母细胞体积是冷冻过程中的重要参数，家兔的

27、卵母细胞体积与人类卵母细胞大小相似，因此家兔可以作为一种理想的动物模型进行研究。获得优质的卵母细胞是相关研究的最基本条件，本实验首先通过对三种促排卵方式进行研究，为随后的相关试验提供可靠的物质保障。目前解冻后的卵母细胞多应用 ICSI 方法授精。卵母细胞激活是受精过程中的关键环节，主要包括细胞内钙离子浓度升高、钙震荡、皮质反应的发生、减数分裂的恢复等。ICSI 过程中，钙离子浓度升高的起始部位发生改变，从卵的皮层开始升高而不是从精子头部，这可能会导致卵母细胞激活不完全13。在卵母细胞冷冻过程中，细胞膜上的各种离子通道、蛋白会遭到损伤，线粒体极性消失，影响卵母细胞激活时钙震荡的产生14,15，最

28、终影响卵母细胞受精及胚胎发育。因此激活失败是冻融后卵母细胞 ICSI 受精失败的主要原因16。Borges 等17研究证实人工辅助激活可以改善卵母细胞的受精率及发育潜能。Hosseini 等18研究证实化学辅助激活可以增加卵母细胞内钙离子浓度、钙离子震荡的频率和幅度。本实验中采用两种海藻糖应用方式：（1）作为细胞内保护剂：应用显微注射的方式将海藻糖注入卵母细胞；（2）作为细胞外保护剂：应用海藻糖替代常规玻璃化冷冻中应用的蔗糖，旨在探索海藻糖的应用能否改善家兔成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果，并对冻融后行 ICSI 的卵母细胞辅以人工辅助激活，旨在探讨人工辅助激活能否改善冻融卵母细胞的受精及胚胎发育潜

29、能，且若能通过该技术获得优质胚胎予以移植则能够更好地对冷冻及激活的安全性进行评定。11安徽医科大学硕士毕业论文2 材料与方法2.1 材料2.1.1 实验动物新西兰性成熟雌性大耳白兔8月龄左右，体重2.0-3.0Kg，新西兰性成熟雄性大耳白兔，体重2.5-3.0Kg，实行单笼饲养，自由采食，光照时间为6:0020:00，室内温度控制在1525，均购自安徽医科大学动物实验中心。2.1.2 试剂COOK 胚胎培养液（Gamete, Fertilization,Cleavage，Blastocyst）（COOK,Australia）；Culture Oil( COOK, Australia )；PVP

30、（Irvine Scientific, USA）；透明质酸酶（Sigma, USA）； HTF1024（SAGE, USA）；EG（Sigma, USA）；PROH（Sigma, USA）；蔗糖（Sigma, USA）；海藻糖（Fluka，USA）；HSA（SAGE，USA）；HMG（丽珠药业,广东)；HCG（丽珠药业，广东)；PBS(Sigma, USA)；FSH（欧加农，荷兰)；PMSG（宁波激素厂，宁波 )；无水酒精（Sigma, USA）。2.1.3 耗材巴斯德吸管（Falcon, USA）；钻石刻字笔（Vysis ,USA）；1006 皿(Falcon,USA)；细胞培养皿（Nunc

31、, USA）；显微注射针（Humagen, USA）；3037 培养皿（Falcon,USA）；四孔培养皿（Nunc, USA）；McGill Cryoleaf (MediCult，Canada) ；ICSI注射针(MIC-CUST-30; Humagen)。2.1.4 主要仪器设备液氮贮存罐（USA）；体视显微镜（SMZ800, Nikon, Japan）；倒置显微镜及显微操作仪（IX-70，Olympus, Narishige，Japan）；显微辅助加热台（USA）；CO2 培养箱 (HERA CELL, Germany)。2.1.5 操作液2.1.5.1 玻璃化冻融液显微注射海藻糖组和细

32、胞外海藻糖组冻存液：EM:HTF1024 + 20%HSA + 7.5%(v/v) PROH + 7.5%(v/v) EG, RT;VM:HTF1024 + 20%HSA + 0.5 mol/L 海藻糖 + 15%(v/v) PROH +15%(v/v) EG,RT常规蔗糖组冻存液：12安徽医科大学硕士毕业论文EM:HTF1024 + 20%HSA + 7.5%(v/v) PROH + 7.5%(v/v) EG, RT;VM:HTF1024 + 20%HSA + 0.5 mol/L 蔗糖 + 15%(v/v) PROH +15%(v/v) EG, RT显微注射海藻糖组和细胞外海藻糖组融解液：T

33、M: HTF1024 +20% HSA + 1.0mol/L 海藻糖, 37;DM-1: HTF1024 + 20%HSA + 0.5mol/L 海藻糖, RT;DM-2: HTF1024 + 20%HSA + 0.2mol/L 海藻糖, RT;WM-1: HTF1024 + 20%HSA, RT;WM-2: HTF1024 + 20%HSA, 37.常规蔗糖组融解液：TM: HTF 1024 + 20%HSA + 1.0mol/L 蔗糖，37;DM-1: HTF 1024 + 20% HSA + 0.5mol/L 蔗糖, RT;DM-2: HTF 1024 + 20% HSA + 0.25m

34、ol/L 蔗糖, RT;WM-1: HTF 1024 + 20% HSA, RT;WM-2: HTF 1024 + 20% HSA，372.1.5.2 显微注射海藻糖溶液配制：显微注射前平衡液：HEPES + 5% HSA + 0.15 mol/L 海藻糖；显微注射液：HEPES + 0.8mol/L 海藻糖。2.1.5.3 卵母细胞激活液：7%无水乙醇+ Cleavage，382.2 方法2.2.1 兔超促排卵处理选用青年雌性新西兰大耳白兔30只，将30只处于发情期的雌兔随机分成3组，每组10只，分别采用 HMG + HCG、FSH + HCG和 PMSG + HCG法分组进行超数排卵处理。

35、2.2.1.1 HMG+HCG法于第1、2天9:00颈部皮下注射HMG 35IU只，第3天21:00耳缘静脉注射HCG 100 IU只，接着用消毒过的圆滑玻璃棒涂上甘油刺激雌兔的阴道，诱发雌兔排卵。2.2.1.2 PMSG+HCG法于第1天21:00颈部皮下注射PMSG 80IU只，第4天21:00耳缘静脉注射HCG 100 IU只，接着用消毒过的圆滑玻璃棒涂上甘油刺激雌兔的阴道，诱发雌兔排卵。2.2.1.3 FSH+HCG 法于第1天21:00开始恒量注射 FSH 10 IU只，每间隔12h13安徽医科大学硕士毕业论文注射1次,第4天9：00注射最后一次FSH，21:00耳缘静脉注射HCG

36、100 IU只,接着用消毒过的圆滑玻璃棒涂上甘油刺激雌兔的阴道，诱发雌兔排卵。2.2.2 卵母细胞收集注射HCG 1516小时后处死超排雌兔，取出输卵管和卵巢。首先观察兔卵巢状况，数清每只卵巢的排卵点数。用PBS冲洗兔输卵管腔，冲出处在输卵管腔内的卵丘卵母细胞复合体（OCCs），连续冲洗3遍，依托体视显微镜，将OCCs移入80 IU/ml的透明质酸酶中，用移液枪来回吹吸OCCs以去除卵子周围的颗粒细胞。2.2.3 精子的收集雄兔固定后消毒，确定附睾位置，注射器抽取2mlPBS穿刺附睾，形成负压后抽吸若干次，小心移出穿刺液观察，有足够精子时，将精子加入PVP中备用。2.2.4 兔卵母细胞海藻糖显微注射显微注射海藻糖基于 Eroglu