代谢物识别与结构鉴定

1、代谢物的识别代谢物的识别 与结构鉴定与结构鉴定 组员：周霞 周雯迪 郑梦琳 代谢物的结构鉴定在新代谢物的结构鉴定在新 药开发过程的重要地位药开发过程的重要地位 预防潜在的毒性预防潜在的毒性 测定是否和原测定是否和原 药具有相同的药具有相同的 治疗作用治疗作用 测定对其他治疗测定对其他治疗 有内在的活性有内在的活性 测定是否有代测定是否有代 谢物和已知药谢物和已知药 物相关物相关 药物代谢研究贯穿于创新药物研发产业链的始终，并药物代谢研究贯穿于创新药物研发产业链的始终，并 在药物的发现及开发过程中起到越来越重要的作用。在药物的发现及开发过程中起到越来越重要的作用。 建立可靠的分析方法是研究药物体

2、内代谢的前提。在建立可靠的分析方法是研究药物体内代谢的前提。在 药物发现和开发的许多阶段，药物发现和开发的许多阶段，代谢物鉴定具有关键性代谢物鉴定具有关键性 作用。作用。 极性代谢极性代谢 物的分离物的分离 和保留和保留 怎样在复杂怎样在复杂 的数据中准的数据中准 确快速地找确快速地找 到代谢物到代谢物 怎样对代谢怎样对代谢 物的结构进物的结构进 行确认，怎行确认，怎 样确定代谢样确定代谢 位点位点 A C B 联用技术 放射性示踪 一、.联用技术 联用技术联用技术 LC-MS LC-MS/MS GC-MS GC-MS/MS LC-NMR LC-MS联用技术联用技术 p体内代谢物研究过 程中，

3、因待测物浓度 太低，提取其纯品进 行结构鉴定是不太可 能的。应用LC-MS 联用技术可获得复杂 混合体中单一成分的 质谱图，大大有利与 药物代谢物的分离与 鉴定。 LC-MS联用技术联用技术 p随着现代色谱联用技术的发展，体内多种 微量代谢产物的分离、鉴定已成为一个连 续过程，尤其是LC-MS样品前处理简单， 一般不要求水解或衍生化处理，可直接用 于药物及其I，相等极性较大代谢产物的 同时分离、鉴定。运用LC-MS技术不仅可 避免复杂烦琐的分离、纯化代谢产物的工 作，而且可分离鉴定难以辨识的体内痕量 代谢产物。 LC-MS联用技术联用技术 四极质谱仪（四极质谱仪（QMS） 三重四极质谱仪（三重

4、四极质谱仪（TQMS） 四极四极-线性离子阱质谱仪（线性离子阱质谱仪（QTrap） 四极四极-飞行时间质谱仪（飞行时间质谱仪（Q-TOFMS） 离子阱离子阱-飞行时间质谱仪（飞行时间质谱仪（IT-TOFMS） 代谢物鉴定中，代谢物鉴定中， 常用的与常用的与LC 联用的质谱仪器联用的质谱仪器 LC-MS特点特点 样品前处理简单，样品前处理简单， 无需衍生化，适用无需衍生化，适用 范围广范围广 将色谱的高分离能将色谱的高分离能 力与质谱的高检测力与质谱的高检测 灵敏度、定性专属灵敏度、定性专属 性集于一身性集于一身 随着接口装置和离随着接口装置和离 子化技术的发展成子化技术的发展成 熟，该技术在体

5、内熟，该技术在体内 药物分析中逐渐发药物分析中逐渐发 展成为一种常规的展成为一种常规的 分离检测方法分离检测方法 实实 例例 大鼠尿中人参皂苷 Rd及 其代谢物的 LC-MS研究 LC-MS实例实例 目的：探讨人参皂苷 Rd在大鼠体内的代谢产物及转化途 径。 方法：选择 SD大鼠 6只 ,单剂量口服和静脉给予人参皂苷 Rd,分段收集给药前和给药后 024 h尿样 ,将尿样分时段 合并后采用旋转薄膜蒸发浓缩 ,以固相萃取小柱纯化处理 , 采用高效液相色谱 -串联飞行时间质谱进行检测。 结果：通过比较给药前后的 TOF总离子流图 ,对尿中推测 的代谢物和标准物质的出峰时间及相关化合物选择离子扫 描

6、二级质谱图进行了比较分析 ,结果在尿中发现了 7种代谢 产物 ,系统分析了这些代谢产物的代谢转化规律及可能结 构。 结论：大鼠尿中人参皂苷 Rd的主要转化途径为氧化、水 解、结合及异构化代谢反应。 离子源离子源(ESI)电压电压: - 4 kV, 去簇电势去簇电势(DP) :- 15 V, 聚焦电势聚焦电势( FP) : - 80 V, 去簇电势去簇电势2 (DP2) :- 15 V, 雾化气雾化气(NEB ) : 0135 L min- 1 帘气帘气(CUR) : 0120 Lmin-1 负离子方式检测负离子方式检测 采用采用TOF扫描一级质谱扫描一级质谱 扫描质量范围扫描质量范围: 400

7、1 200 选择离子扫描二级质谱进行测定选择离子扫描二级质谱进行测定 色谱柱色谱柱 流动相流动相 其他其他 质谱条件质谱条件色谱与质谱条件色谱与质谱条件 为甲醇为甲醇(A) -10 molL - 1乙酸铵乙酸铵(B) 40 min内由体积比内由体积比50 50 线性梯度升至线性梯度升至90 10, 40 55 min 维持维持A B = 90 10,等度洗脱等度洗脱15 min 流速流速: 018 mLmin-1 分流比为分流比为1 60 柱温为柱温为25 , 进样量为进样量为20L Agilent Zorbax SBC18 (150 mm 416 mm, 5 m) Agilent Zorba

8、x SB C18 (1215 mm 211 mm)预柱预柱 LC-MS实例实例 LC-MS实例实例 Metabolization pathway of G-Rd LC-MS实例实例 Fragment pathway of G-Rd LC-MS/MS联用技术联用技术 p由于多数药物的代谢物保留了原药分子的 骨架结构，或一些亚结构，因此，代谢物 可能进行与原药相似的裂解，丢失一些相 同的中性碎片或形成一些相同的特征离子， 用MS/MS分别进行中性丢失扫描、母离子 扫描以及子离子扫描，即可迅速找到可能 的代谢物，并鉴定出结构。 实实 例例 LC-MS/MS 法快速高效检测尿 液中尼古丁及其 9 种代

9、谢物 LC-MS/MS实例实例 以氘代尼古丁、氘代可的宁、3-OH-氘代可的宁、氘代尼 古丁葡萄糖醛酸复合物、氘代可的宁葡萄糖醛酸复合物、 3-OH-氘代可的宁葡萄糖醛酸复合物作内标, 在 LC- MS/MS 的大气压化学电离(APCI)离子化模式下, 建立了快 速检测吸烟者尿液中尼古丁及其 9 种代谢物的方法, 并对 19 个实际样品进行了测试和判别分析(DA). 实验前处理简 单, 色谱运行时间仅为3.8 min. 结果表明, 尼古丁及其代谢物的精密度在 0.5%5.5%之 间, 回收率在94%109%之间, 线性相关系数均大于 0.995. DA 分析充分区别开了不同量的吸烟者, 进一步

10、的相 关性分析表明吸烟者 24 h 尿液中的尼古丁及其 9 种代谢 物含量与卷烟抽吸量的分析因子之间均有较强正相关性. 质谱检测采用质谱检测采用APCI 源源 正离子化模式正离子化模式 气帘气压力设置为气帘气压力设置为0.17 MPa 雾化气雾化气0.55 MPa 碰撞气碰撞气0.04 MPa 离子源温度为离子源温度为550 离子化电流设为离子化电流设为3 A 各代谢物的多反应监测各代谢物的多反应监测(MRM) 参数见表参数见表 色谱柱色谱柱 流动相流动相 其他其他 质谱条件质谱条件色谱与质谱条件色谱与质谱条件 流动相流动相A 为为10mmol/L 醋酸铵水溶液醋酸铵水溶液(pH 6.8) 流

11、动相流动相B 为为10 mmol/L醋酸铵的甲醇溶液醋酸铵的甲醇溶液 流速流速0.5 mL/min 梯度洗脱条件梯度洗脱条件: 起始起始A 为为85%, 到到0.02 min 为为5% 保持至保持至0.3 min, 0.32 min 变为变为85% 保持至保持至2 min 结束结束 柱温为柱温为35 为为Shisheido MG II 柱柱 (2.0 mm50 mm, 3m) LC-MS/MS实例实例 LC-MS/MS实例实例 GC-MS联用技术联用技术 u气质联用技术是分析仪器中较早实现联用技术的 仪器。气相色谱分离效率高、定量准确，然而不 足的是定性较为困难，及时未知样品纯度较高， 鉴定结

12、构也不容易。质谱具有灵敏度高、鉴别能 力强、响应速度快的优点，但欠缺的是对复杂得 多组分样品的分离能力。 u虽然商品化的GC-MS联用仪器出现较早，在药物 代谢研究中的应用也较早，但GC法对样品的极性 和热稳定性有一定要求。因此，在GC-MS联用技 术分析前，样品的预处理极为重要。其代谢物的 热稳定性、挥发性、极性可能差异较大，需要根 据具体情况对样品先进行水解处理或衍生化处理。 实实 例例 GC-MS/MS 法测定人头发中 的大麻酚类及其代谢物 GC-MS/MS实例实例 目的：建立同时检测头发中 9-四氢大麻酚（THC）、大 麻酚（CBN）、大麻二酚（CBD）和 9-四氢大麻酸 （THC-C

13、OOH）的分析方法。 方法：头发样品加入氘代内标 9-四氢大麻酸（THC- COOH-d3），经碱水解后，以混合溶剂V（正己烷） V （乙酸乙酯9 1进行提取，吹干，残留物经双（三甲基 硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）衍生化，用 GC-MS/MS 方法进行分析。 结果 ：头发中 THC-COOH、THC、CBN 和 CBD 的最低 检出限分别为 4、4、10 和 20 pgmg-1， 各化合物在 0.045ngmg-1呈良好的线性关系（r0.999），方法精 密度、准确度均符合要求。 结论：本方法选择性强、灵敏度高，适用于头发中 CBD、 CBN、THC 及其代谢物 THC-COOH 的分析，

14、并成功应用 于实际案例中。 质谱检测采用质谱检测采用MRM 模式，模式， 以一级质谱分析结果为基础，以一级质谱分析结果为基础， 选择各目标物的分子离子，选择各目标物的分子离子， 优化碰撞能量优化碰撞能量CE），）， 得到各目标物和内标的二级质谱图。得到各目标物和内标的二级质谱图。 CBD、CBN、THC、THC-COOH 和和THC-COOH-d3的的MS/MS见表见表 色谱柱色谱柱 柱温柱温 其他其他 质谱条件质谱条件色谱与质谱条件色谱与质谱条件 程序升温：程序升温：100保持保持1.5min， 以升温速率以升温速率25/min 升温升温 至至280保持保持5min 分流比分流比2 1； 载

15、气：氦气载气：氦气 进样口温度：进样口温度：250 检测器温度：检测器温度：250 进样量：进样量：1L。 HP-1MS 石英毛细管柱石英毛细管柱 （30m0.25mm0.1m） GC-MS/MS实例实例 GC-MS/MS实例实例 LC-NMR联用技术联用技术 近年来，LC-MS虽然得到普及推广，但MS本身不 能提供足够的分子结构信息，因此在实际使用LC- MS鉴定药物代谢物结构时，往往需要借助核磁共 振（NMR）的数据，才能顺利完成工作。目前， 在仪器分析领域中NMR能够提供最大量的分子结 构信息，但该法要求样品为纯品，即在做NMR分 析前必须做大量的分离、纯化工作，这不利于样 品的快速分析

16、。如果在核磁共振仪器前配置一套 色谱分离设备，使样品被LC分离后，直接进入 NMR中进行扫描测定，就可以大大简化分析程序， 提高样品分析速度。因此，将高分离能力的色谱 与能提供最丰富结构信息的NMR在线联用是非常 有意义的。 LC-NMR联用技术联用技术 p但HPLC和NMR的联用并不是两种技术 的简单组合：NMR的检测灵敏度明显低 于常规的HPLC的检测器，且作为HPLC 流动相的混合溶剂往往产生多重强溶剂 峰而影响溶质峰的正确而检测。 p由于技术上的原因，如NMR灵敏度低、 液相色谱使用的氘代溶剂十分昂贵，溶 剂信号对样品的干扰等等使该联用技术 受到限制。 p近年来LC/ NMR 联用技术

17、在研究药物代 谢产物,特别是相代谢产物方面表现出 了非常诱人的前景,有关研究报告相继发 表。 LC-NMR实例实例 布洛芬在人体内代谢物的研究便是一个很 好的例子,健康男性注射400mg 布洛芬后, 收集0 4 小时的尿液, 经HPLC/ NMR 联 用技术分析,图谱中清晰地显示出5个代谢产 物:2-羟基布洛芬葡萄糖醛酸、2-羧基布洛 芬葡萄糖醛酸、2-羟基布洛芬、2-羧基布洛 芬和布洛芬葡萄糖醛酸。采用停止流动模 式技术可以得到纯的2-羟基布洛芬的1H- NMR 图谱。 二、放射性示踪 放射性同位素示踪技术是放射性同位素示踪技术是 利用放射性核素及其标记物作利用放射性核素及其标记物作 为示踪

18、剂来研究生物体内各种为示踪剂来研究生物体内各种 物质吸收、分布、代谢、排泄物质吸收、分布、代谢、排泄 ( ADME) 规律的一门科学。规律的一门科学。 放射性示踪原理放射性示踪原理 把用放射性核素标记的物质A引入动物 体，经过一段时间，从排出物或组织 中分离出另一化合物B，含有相当数量 的上述标记核素，即可确定A在动物体 内可以转变为B. 与被示踪的物质有同一性，与被示踪的物质有同一性， 即放射性核素与其同种元素的非放射性核素即放射性核素与其同种元素的非放射性核素 在化学和生物学行为上具有高度一致性，不致在化学和生物学行为上具有高度一致性，不致 扰乱和破坏体内外生理过程的平衡状态扰乱和破坏体内

19、外生理过程的平衡状态 放射性示踪放射性示踪 一一 与被示踪的物质有可区别性，与被示踪的物质有可区别性， 放射性核素的原子核不断衰减，发出能被放放射性核素的原子核不断衰减，发出能被放 射性探测仪所探测的射线，从而实现对标记物射性探测仪所探测的射线，从而实现对标记物 的定量及定位。的定量及定位。 二二 放射性同位素得以广泛应用于活性物质放射性同位素得以广泛应用于活性物质 示踪主要依赖于其最重要的两个特点示踪主要依赖于其最重要的两个特点 放射性示踪放射性示踪 灵敏度高灵敏度高 专属性强专属性强 适用性广适用性广 检测方法简便检测方法简便 n 在药物在药物ADME 研究中得到了广泛的应用。放射性同位素

20、研究中得到了广泛的应用。放射性同位素 示踪技术在药物示踪技术在药物ADME 研究中发挥着十分重要的作用，研究中发挥着十分重要的作用， 美国美国FDA 已将放射性同位素标记药物给药后的药动学数已将放射性同位素标记药物给药后的药动学数 据作为据作为新药安全性评价的重要依据新药安全性评价的重要依据，并制定了相关指南，并制定了相关指南 放射性同位素示踪剂的选择放射性同位素示踪剂的选择 在药物ADME 的研究中，常用的放射性同位素 包括14C、3H、32P、33P、35 S、125 I、131 I 等。 如今随着小型正电子发射断层扫描( positron emission tomography，PET) 仪器的发展，利 用11C、13N、15O、18 F 等放射性核素进行 ADME 研究的实例也日渐增多。 放射性同位素示踪剂的选择放射性同位素示踪剂的选择 放射性同位素放射性同位素 有时