第8章液固-液液色谱法

1、第八章 高效液相色谱法 液固吸附色谱 液液分配色谱 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 主要内容 液液- -固吸附色谱法固吸附色谱法 一一 液液- -液分配色谱法液分配色谱法 二二 正相硅胶反相洗脱色谱法正相硅胶反相洗脱色谱法 三三 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 3 一、液固吸附色谱法一、液固吸附色谱法 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 1 1、液固吸附色谱法的定义、液固吸附色谱法的定义 v液固吸附色谱是最早出现的，也是最基本的一液固吸附色谱是最早出现的，也是最基本的一 种柱色谱类型。种柱色谱类型。 液液 固固 吸吸 附附 色

2、色 谱谱 色谱分离是基于吸附效应的色谱法称色谱分离是基于吸附效应的色谱法称 为吸附色谱法，以固体吸附剂为固定为吸附色谱法，以固体吸附剂为固定 相，以液体为流动相的色谱法，称为相，以液体为流动相的色谱法，称为 液固吸附色谱法液固吸附色谱法（Liquid-Solid Adsorption Chromatography，LSC），）， 简称液固色谱法。简称液固色谱法。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 2 2、液固吸附色谱法的固定相、液固吸附色谱法的固定相 v优良的固定相填料应具备以下特性：优良的固定相填料应具备以下特性： 表面具有极性活性基团即吸附位点；形状适宜，最表面具有极

3、性活性基团即吸附位点；形状适宜，最 好成微米级微球形，且粒径分布均匀；多孔性且比好成微米级微球形，且粒径分布均匀；多孔性且比 表面积大，载样量大；化学性质稳定；机械强度高；表面积大，载样量大；化学性质稳定；机械强度高； 价格合理价格合理 。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 v在吸附色谱中，最常用的吸附剂是在吸附色谱中，最常用的吸附剂是硅胶硅胶，其次是，其次是氧氧 化铝化铝，此外还有高分子多孔微球（有机胶）、分子，此外还有高分子多孔微球（有机胶）、分子 筛及聚酰胺等。筛及聚酰胺等。 v固定相按固定相按极性极性大小分类如下：大小分类如下： 按极性按极性 大小分大小分 极性吸

4、附剂极性吸附剂 非极性吸附剂：活性碳非极性吸附剂：活性碳 酸性吸附剂：硅胶、硅酸镁酸性吸附剂：硅胶、硅酸镁 碱性吸附剂：氧化铝、氧化镁碱性吸附剂：氧化铝、氧化镁 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 S i O O S i 硅胶的性质硅胶的性质 v硅胶表面主要存在着硅羟基（硅胶表面主要存在着硅羟基（Silanol，或称硅醇基），或称硅醇基） 和暴露于表面的和暴露于表面的SiOSi键，另外还有一些硅醇基键，另外还有一些硅醇基 可能与水以氢键键合。硅羟基的表面浓度在液固可能与水以氢键键合。硅羟基的表面浓度在液固 吸附色谱中很重要，因为人们通常认为硅羟基是强吸附色谱中很重要，因为人

5、们通常认为硅羟基是强 吸附位点，而吸附位点，而SiOSi则是疏水性的。则是疏水性的。 Si OH 自由型硅醇基自由型硅醇基 硅氧烷型硅氧烷型 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 硅胶表面的活性作用点硅胶表面的活性作用点 物理吸附水物理吸附水 干燥表面干燥表面 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 v硅胶按硅胶按结构类型结构类型分类如下：分类如下： 硅胶硅胶 薄壳型薄壳型 全多孔型全多孔型 无定形无定形 球球 形形 薄壳玻珠薄壳玻珠 无定形无定形 全多孔硅胶全多孔硅胶 球形球形 全多孔硅胶全多孔硅胶 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 性

6、能性能薄壳玻珠薄壳玻珠全多孔微粒硅胶全多孔微粒硅胶 平均粒度平均粒度/m3040510 比表面积比表面积/（m2/g）1.01.5400600 样品容量样品容量/（mg/g）0.050.115 填充填充干法装柱干法装柱湿法装柱湿法装柱 分析速度分析速度慢慢快快 薄壳玻珠和全多孔微粒硅胶性能比较薄壳玻珠和全多孔微粒硅胶性能比较 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 （1 1）无定形全多孔硅胶）无定形全多孔硅胶 v无定形全多孔的填料容易制备、价格低、无定形全多孔的填料容易制备、价格低、 粒径一般为粒径一般为5 m10 m，粒度分布较均，粒度分布较均 匀，理论塔板数可达匀，理论塔板

7、数可达50000 /m，比表面积，比表面积 约约300 m2/g，载样量大，但涡流扩散大，载样量大，但涡流扩散大， 渗透性差，比较难填装出稳定的柱床，一渗透性差，比较难填装出稳定的柱床，一 般用来做制备柱。般用来做制备柱。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 （2 2）球形全多孔硅胶）球形全多孔硅胶 v球形全多孔填料外形为球形，常用粒径为球形全多孔填料外形为球形，常用粒径为3 m5 m，下图为中国科学院兰州化学物理研究所生产的，下图为中国科学院兰州化学物理研究所生产的 高纯度多孔球形硅胶电镜照。高纯度多孔球形硅胶电镜照。 放大放大30003000倍倍 放大放大5000500

8、0倍倍 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 （2 2）球形全多孔硅胶）球形全多孔硅胶 v球形全多孔填料具有涡流扩散小，渗透性好球形全多孔填料具有涡流扩散小，渗透性好 的优点；如果是硅胶先做成珠子再堆积而成的优点；如果是硅胶先做成珠子再堆积而成 的话，即堆积硅珠，则具有传质阻抗小、载的话，即堆积硅珠，则具有传质阻抗小、载 样量大的优点，柱效也更高。球形填料外形样量大的优点，柱效也更高。球形填料外形 对称，比较容易填装出稳定的柱床，是化学对称，比较容易填装出稳定的柱床，是化学 键合相的理想载体。键合相的理想载体。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 氧化铝氧

9、化铝 v氧化铝与硅胶相似，但对水溶液、酸性或碱性水溶氧化铝与硅胶相似，但对水溶液、酸性或碱性水溶 液更加液更加不稳定不稳定，所以，极少用作键合固定相的基质。，所以，极少用作键合固定相的基质。 v氧化铝适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非氧化铝适宜分离溶于有机溶剂的极性、弱极性的非 强离解型的化合物，尤其适合于分离强离解型的化合物，尤其适合于分离芳香族化合物芳香族化合物。 v当样品为碱性化合物时，用硅胶分离会造成严重吸当样品为碱性化合物时，用硅胶分离会造成严重吸 附，此时可选用氧化铝进行分离，但附，此时可选用氧化铝进行分离，但酸性酸性易离解的易离解的 化合物容易在氧化铝上形成化合物容易在氧化铝

10、上形成死吸附死吸附。 v氧化铝分离氧化铝分离几何异构体能力优几何异构体能力优于硅胶。于硅胶。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 3 3、液固吸附色谱法的保留机理、液固吸附色谱法的保留机理 溶 质溶 质 分 子分 子 固定相对它的吸附力固定相对它的吸附力 流动相的流动相的“拉力拉力”或溶解或溶解 力力 吸附力强而溶解能吸附力强而溶解能 力差时，溶质有较力差时，溶质有较 大的保留。大的保留。 吸附力差而溶解能吸附力差而溶解能 力强时，溶质有较力强时，溶质有较 小的保留。小的保留。 溶质处于这两相作溶质处于这两相作 用力场的平衡之中用力场的平衡之中 宋宋 敏敏中国药科大学药分教

11、研室中国药科大学药分教研室 在吸附色谱体系中，溶剂分子和溶质分子均能被吸在吸附色谱体系中，溶剂分子和溶质分子均能被吸 附于吸附剂的活性位点上，当流动相流过固定相时，附于吸附剂的活性位点上，当流动相流过固定相时， 样品组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面吸附中样品组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面吸附中 心，同时，样品中不同组分分子也在竞争吸附中心。心，同时，样品中不同组分分子也在竞争吸附中心。 v一是由一是由Snyder和和Soczewinski提出的提出的竞争模式竞争模式 （competition model）。）。 v二是由二是由Scott和和Kucera提出的溶剂作用模式（提出的溶剂作用模

12、式（solvent initeraction model）“双层吸附模型双层吸附模型” 。 两种模型两种模型 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 竞争模式竞争模式 v竞争模式认为在被溶剂平衡的色谱柱中，弱极性或竞争模式认为在被溶剂平衡的色谱柱中，弱极性或 中等极性的溶剂分子先被吸附剂吸附，覆盖于吸附中等极性的溶剂分子先被吸附剂吸附，覆盖于吸附 剂表面形成单分子层，当溶质分子进入色谱体系后，剂表面形成单分子层，当溶质分子进入色谱体系后， 便竞争置换（或顶替）溶剂分子而形成吸附。便竞争置换（或顶替）溶剂分子而形成吸附。 X. 溶质分子溶质分子 Y. 溶剂分子溶剂分子 s. 吸附

13、剂吸附剂 m. 流动相流动相 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 双层吸附模型双层吸附模型 v双层吸附模型假定吸附剂表面先被流动相中极性较双层吸附模型假定吸附剂表面先被流动相中极性较 强的组分以双层溶剂分子的形式所完全覆盖，双层强的组分以双层溶剂分子的形式所完全覆盖，双层 的结构及形成的程度取决于流动相中极性溶剂的浓的结构及形成的程度取决于流动相中极性溶剂的浓 度，溶质通过柱子时与双层溶剂的第二层发生取代度，溶质通过柱子时与双层溶剂的第二层发生取代 或缔合而使溶质保留。或缔合而使溶质保留。 X. 溶质分子溶质分子 Y. 溶剂分子溶剂分子 s. 吸附剂吸附剂 m. 流动相流动

14、相 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 流动相流动相 吸附剂吸附剂 溶质溶质 诱导力诱导力 静电力静电力 氢键力氢键力 色散力色散力 电荷电荷 转移转移 络合物络合物 形成形成 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 v组分分子中的极性官能团与固定相表面上活组分分子中的极性官能团与固定相表面上活 性作用点（如硅羟基）之间的相互作用强弱性作用点（如硅羟基）之间的相互作用强弱 决定了它的竞争能力，即保留程度的大小，决定了它的竞争能力，即保留程度的大小， 这种极性相互作用的强弱归纳如下表所示。这种极性相互作用的强弱归纳如下表所示。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室

15、中国药科大学药分教研室 硅胶上各类化合物或官能团吸附强弱的分类硅胶上各类化合物或官能团吸附强弱的分类 样品的吸附样品的吸附 能力能力 样品类型样品类型 无吸附无吸附脂肪烃脂肪烃 弱吸附弱吸附 烯烃、硫醇、硫醚、单环和双环芳烃、烯烃、硫醇、硫醚、单环和双环芳烃、 卤代烃卤代烃 中等吸附中等吸附 稠环芳烃、醚类、腈类、硝基化合物和稠环芳烃、醚类、腈类、硝基化合物和 大多数羰基化合物大多数羰基化合物 强吸附强吸附 醇类、酚类、胺类、酰胺类、亚胺类、醇类、酚类、胺类、酰胺类、亚胺类、 亚砜类、酸类亚砜类、酸类 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 一般保留规律一般保留规律 v F化物

16、化物Cl化物化物Br化物化物I化物；化物； v 顺式几何异构体比反式几何异构体保留值大；顺式几何异构体比反式几何异构体保留值大； v 官能团之间的分子内氢键将使保留值减小；官能团之间的分子内氢键将使保留值减小； v 极性基团旁边有庞大烷基存在时，保留值减小；极性基团旁边有庞大烷基存在时，保留值减小； v 环己烷衍生物和甾体化合物的中位取代基比轴端环己烷衍生物和甾体化合物的中位取代基比轴端 取代基有更强的保留。取代基有更强的保留。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 4 4、液固吸附色谱法的流动相、液固吸附色谱法的流动相 v液固吸附色谱中使用的流动相为各种有机溶剂，液固吸附色

17、谱中使用的流动相为各种有机溶剂， 主要为非极性的烃类（如己烷、庚烷），某些有机主要为非极性的烃类（如己烷、庚烷），某些有机 溶剂（如二氟甲烷、甲醇、三乙胺等）作为缓和剂溶剂（如二氟甲烷、甲醇、三乙胺等）作为缓和剂 加入其中以调节流动相的溶剂强度、极性及加入其中以调节流动相的溶剂强度、极性及pH值，值， 即进行所谓正相色谱。流动相溶剂极性越大，洗脱即进行所谓正相色谱。流动相溶剂极性越大，洗脱 能力越强，溶质保留越小；流动相溶剂极性越小，能力越强，溶质保留越小；流动相溶剂极性越小， 洗脱能力越弱，溶质保留越大。洗脱能力越弱，溶质保留越大。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 己

18、烷己烷 环己烷环己烷 甲苯甲苯 苯苯 乙醚乙醚 氯仿氯仿 一氯甲烷一氯甲烷 丙酮丙酮 硝基甲烷硝基甲烷 乙腈乙腈 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇甲醇 己烷己烷 环己烷环己烷 异丙醚异丙醚 甲苯甲苯 苯苯 乙醚乙醚 氯仿氯仿 一氯甲烷一氯甲烷 二氯甲烷二氯甲烷 丙酮丙酮 乙酸乙酯乙酸乙酯 硝基甲烷硝基甲烷 乙腈乙腈 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇甲醇 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 （1 1）混合溶剂）混合溶剂 v液固色谱中广泛使用混合溶剂（二元、三元液固色谱中广泛使用混合溶剂（二元、三元 体系等），这是因为虽然不同的纯溶剂有不体系等），这是因为虽然不同的纯溶剂有不 同的溶剂强度。但

19、他们不一定是进行液固同的溶剂强度。但他们不一定是进行液固 吸附色谱的最佳溶剂强度，我们可以利用不吸附色谱的最佳溶剂强度，我们可以利用不 同组成的混合溶剂获得任意需要的溶剂强度。同组成的混合溶剂获得任意需要的溶剂强度。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 流动相主体：弱极性的戊烷、己烷、庚烷等。流动相主体：弱极性的戊烷、己烷、庚烷等。 改改 性性 剂：调节流动相的洗脱强度与峰形。剂：调节流动相的洗脱强度与峰形。 中等极性：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯。中等极性：二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯。 极性溶剂：四氢呋喃、乙腈、异丙醇、极性溶剂：四氢呋喃、乙腈、异丙醇、 甲醇、水等。甲醇、水等

20、。 碱性物质：如三乙胺等，分离碱性品，碱性物质：如三乙胺等，分离碱性品， 避免峰拖尾或不可逆的保留。避免峰拖尾或不可逆的保留。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 （2 2）水的影响）水的影响 v硅胶及氧化铝为良好的干燥剂。水的含量对硅胶及氧化铝为良好的干燥剂。水的含量对 该类吸附剂的活度有很大的影响，即使有极该类吸附剂的活度有很大的影响，即使有极 微量的水吸附在其表面上，也会使吸附剂活微量的水吸附在其表面上，也会使吸附剂活 性大大降低。性大大降低。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 5 5、液固吸附色谱的应用、液固吸附色谱的应用 v随着随着HPLC技

21、术的发展，虽然原来许多使用技术的发展，虽然原来许多使用 液固吸附色谱模式的分离分析被更方便、液固吸附色谱模式的分离分析被更方便、 稳定的化学键合相所代替，但在以下几个方稳定的化学键合相所代替，但在以下几个方 面仍有其独特的意义。面仍有其独特的意义。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 （1 1）异构体的分离）异构体的分离 v许多异构体使用化学键合相来分离是不可能的或者许多异构体使用化学键合相来分离是不可能的或者 是很困难的，而采用以硅胶为固定相的液固吸附是很困难的，而采用以硅胶为固定相的液固吸附 色谱却很容易分开。色谱却很容易分开。 图图 液固吸附色谱法拆分苯基丁氨酸衍生物

22、异构体液固吸附色谱法拆分苯基丁氨酸衍生物异构体 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 （2 2）样品预处理）样品预处理 v许多生物样品可使用经典液固吸附色谱来许多生物样品可使用经典液固吸附色谱来 进行纯化，除去蛋白质等干扰物，然后再进进行纯化，除去蛋白质等干扰物，然后再进 一步以一步以GC或或HPLC等分离分析。等分离分析。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 （3 3）制备色谱）制备色谱 v由于硅胶比较便易，所以进行分离比较有利，由于硅胶比较便易，所以进行分离比较有利， 同时流动相为有机溶剂，容易挥发，便于产同时流动相为有机溶剂，容易挥发，便于产 物提取

23、。物提取。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 （4 4）常用于）常用于HPLC-GCHPLC-GC联用技术联用技术 v由于流动相为有机溶剂，易于气化，所以目由于流动相为有机溶剂，易于气化，所以目 前前90%的的HPLC-GC中的中的HPLC部分采用液部分采用液 固吸附色谱，进行正相固吸附色谱，进行正相HPLC。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 33 二、液液分配色谱法二、液液分配色谱法 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 1 1、液、液- -液分配色谱法的定义液分配色谱法的定义 液液分液液分 配色谱配色谱 基于样品组分在固定液和

24、流动相之基于样品组分在固定液和流动相之 间间分配系数分配系数不同而分离的色谱法称不同而分离的色谱法称 为液为液-液分配色谱法（液分配色谱法（Liquid-Liquid Chromatography，LLC）。）。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 v流动相极性小于固定相极性的液液色谱法称为流动相极性小于固定相极性的液液色谱法称为正正 相液液色谱法相液液色谱法，如以烷烃作为流动相，以含水硅，如以烷烃作为流动相，以含水硅 胶作为固定相的色谱系统。正相液液色谱法适合胶作为固定相的色谱系统。正相液液色谱法适合 于分离极性化合物。于分离极性化合物。 v流动相极性大于固定相极性的液液

25、色谱法称为流动相极性大于固定相极性的液液色谱法称为反反 相液液色谱法相液液色谱法，如以水为流动相，烷烃为固定相，如以水为流动相，烷烃为固定相 的色谱系统。反相液液色谱法适合于分离芳烃、的色谱系统。反相液液色谱法适合于分离芳烃、 稠环芳烃及烷烃等化合物。稠环芳烃及烷烃等化合物。 v这两种系统由于固定液易流失、重复性差，已被键这两种系统由于固定液易流失、重复性差，已被键 合相色谱法所代替，但正相液液分配色谱法在薄合相色谱法所代替，但正相液液分配色谱法在薄 层色谱法中还广泛使用。层色谱法中还广泛使用。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 v液液分配色谱的固定相为涂渍在载体上的固定

26、液。液液分配色谱的固定相为涂渍在载体上的固定液。 涂渍了固定液的载体涂渍了固定液的载体 1流动相；流动相；2固定液液膜；固定液液膜；3毛细深孔和渗入的固定液；毛细深孔和渗入的固定液； 4液固界面；液固界面；5液液界面液液界面 2 2、液液分配色谱法的固定相、液液分配色谱法的固定相 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 (1)(1)载体载体 v原则上，所有多孔性的吸附材料均可作为固原则上，所有多孔性的吸附材料均可作为固 定液的载体。一般常用硅胶、硅藻土等。结定液的载体。一般常用硅胶、硅藻土等。结 构类型主要采用多孔层微珠及全多孔微粒型构类型主要采用多孔层微珠及全多孔微粒型 二种

27、。二种。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 多孔层微珠多孔层微珠 柱效好，分析时间短；柱效好，分析时间短； 但它的多孔层很薄，但它的多孔层很薄， 只能涂渍少量固定液只能涂渍少量固定液 （最大涂渍（最大涂渍12%），）， 故柱容量低，柱稳定故柱容量低，柱稳定 性也差，因为少量的性也差，因为少量的 固定液流失将大大改固定液流失将大大改 变保留体积。变保留体积。 全多孔微粒全多孔微粒 全多孔微粒（如硅胶）全多孔微粒（如硅胶） 孔容大（孔容大（1ml/g），）， 可涂渍较多的固定液，可涂渍较多的固定液， 涂渍量可达涂渍量可达1 1克固定液克固定液 / /每克载体（称为每克载体（称

28、为100100 %涂渍），其柱效比涂渍），其柱效比 前者高，且柱容量高，前者高，且柱容量高， 柱子稳定性也好。柱子稳定性也好。 载体上涂渍的固定液越多，则因固定液流失载体上涂渍的固定液越多，则因固定液流失 对样品保留体积的影响就越不显著。对样品保留体积的影响就越不显著。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 理想的载体应该具有如下特点：理想的载体应该具有如下特点： v 孔容大孔容大； 孔径应为孔径应为100500埃之间埃之间。孔径太小，较大。孔径太小，较大 的分子可能被完全排阻，而保留时间更短，的分子可能被完全排阻，而保留时间更短， 分离不佳；孔径太大，则固定液易流失，柱分离

29、不佳；孔径太大，则固定液易流失，柱 稳定性差，由于毛细管作用，固定液在小孔稳定性差，由于毛细管作用，固定液在小孔 要比大孔内保持的好。要比大孔内保持的好。 理想的载体理想的载体 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 (2)(2)固定液固定液 v固定液可采用气相色谱中常用的某些固定液，如不固定液可采用气相色谱中常用的某些固定液，如不 同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、丙撑二醇等。然而，同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、丙撑二醇等。然而， 对这些固定液，适合作为流动相的只有非极性链烃，对这些固定液，适合作为流动相的只有非极性链烃， 最多再加入少量（最高最多再加入少量（最高10%）的氯仿，四氢

30、呋喃和）的氯仿，四氢呋喃和 其它醚类。所有常见的洗脱液都是这些固定液的良其它醚类。所有常见的洗脱液都是这些固定液的良 溶剂。但由于许多有机物样品在上述洗脱液中的溶溶剂。但由于许多有机物样品在上述洗脱液中的溶 解度很小，所以这类体系的适用性是有限的。解度很小，所以这类体系的适用性是有限的。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 v液液分配色谱法的固定液的选择也可参考纸色谱液液分配色谱法的固定液的选择也可参考纸色谱 法中使用的体系或从多组分中萃取已知组分的分配法中使用的体系或从多组分中萃取已知组分的分配 体系。如在纸色谱里，甾体药物可以在浸渍甲酰胺体系。如在纸色谱里，甾体药物可以

31、在浸渍甲酰胺 的纸上容易地分离，如果把甲酰胺涂在硅胶上，那的纸上容易地分离，如果把甲酰胺涂在硅胶上，那 么甾族化合物就能用高效液相色谱分离，因为甲酰么甾族化合物就能用高效液相色谱分离，因为甲酰 胺即使在中等极性的溶剂苯、二氯甲烷中也几乎是胺即使在中等极性的溶剂苯、二氯甲烷中也几乎是 不溶解的。不溶解的。 v载体的涂渍采用载体的涂渍采用GC中常用的固定液涂渍方法。中常用的固定液涂渍方法。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 sss mmm = cXV K cXV 3 3、液液分配色谱法的保留机理、液液分配色谱法的保留机理 v液液分配色谱法的保留机理是根据样品组分溶入液液分配色

32、谱法的保留机理是根据样品组分溶入 固定相（固定相（s）与流动相（）与流动相（m）达到）达到“平衡平衡”后的分配后的分配 系数系数 K 的差异而分离。的差异而分离。 m： 流动相流动相 s： 固定液固定液 Xm：在流动相中的溶质分子：在流动相中的溶质分子 Xs： 在固定液中的溶质分子在固定液中的溶质分子 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 v分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个分配色谱过程与两种互不相溶的液体在一个 分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。分液漏斗中进行的溶剂萃取相类似。 v当流动相体积和固定液体积一定时，物质在当流动相体积和固定液体积一定时，物质在 固定液中的溶解

33、度越大，分配系数越大，保固定液中的溶解度越大，分配系数越大，保 留时间越长；反之，在固定液中的溶解度越留时间越长；反之，在固定液中的溶解度越 小，分配系数越小，保留时间越小。小，分配系数越小，保留时间越小。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 4 4、液液分配色谱法的流动相、液液分配色谱法的流动相 v在液液分配色谱中，流动相一般采用与固定液性在液液分配色谱中，流动相一般采用与固定液性 质相差很大的不混溶的溶剂为流动相，质相差很大的不混溶的溶剂为流动相，流动相对固流动相对固 定相的溶解度尽可能小定相的溶解度尽可能小，因此固定液和流动相的性，因此固定液和流动相的性 质往往处于两

34、个极端，例如当选择固定液是极性物质往往处于两个极端，例如当选择固定液是极性物 质时，所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非质时，所选用的流动相通常是极性很小的溶剂或非 极性溶剂。极性溶剂。 v流动相使用前需流动相使用前需预先用固定液饱和预先用固定液饱和，或在分析柱前，或在分析柱前 增加预饱和柱，以避免固定液流失。增加预饱和柱，以避免固定液流失。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 45 三、正相硅胶反相洗脱色谱法三、正相硅胶反相洗脱色谱法 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 NS/RENS/RE的简介的简介 v1975年年Jane首次报道在普通正相硅胶柱

35、上，用强极首次报道在普通正相硅胶柱上，用强极 性的水为流动相成功分离了碱性药物。性的水为流动相成功分离了碱性药物。 v1987年年Law研究了这种称之为正相硅胶研究了这种称之为正相硅胶/反相洗脱反相洗脱 （NS/RE）色谱中碱性药物的保留机理，认为其保）色谱中碱性药物的保留机理，认为其保 留主要由于离子交换所引起。留主要由于离子交换所引起。 vNS/RE具有不需反相高效液相色谱（具有不需反相高效液相色谱（RP-HPLC）中）中 复杂的处理手段、碱性药物保留时间大大缩短及拖复杂的处理手段、碱性药物保留时间大大缩短及拖 尾改善、峰形对称等优点，是一种分析中药中的生尾改善、峰形对称等优点，是一种分析

36、中药中的生 物碱成分，或化学合成的生物碱类药物及其代谢物物碱成分，或化学合成的生物碱类药物及其代谢物 的简便、有效、理想的方法。的简便、有效、理想的方法。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 1 1、固定相、固定相 v本法采用未改性的本法采用未改性的原形硅胶原形硅胶为固定相，以水性溶液为固定相，以水性溶液 作流动相。作流动相。 v以普通硅胶作固定相简单、方便，不需以普通硅胶作固定相简单、方便，不需HPLC众多众多 的键合相就能达到满意的分离效果。在高的键合相就能达到满意的分离效果。在高pH值值 （pH8）的水有机溶剂混合液中，固定相稳定，）的水有机溶剂混合液中，固定相稳定，

37、 硅胶不溶于高浓度极性有机溶剂硅胶不溶于高浓度极性有机溶剂高高pH值的流动相值的流动相 中，可使用数月不影响柱效中，可使用数月不影响柱效 。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 2 2、保留机理、保留机理 vNS/RE对碱性药物的保留主要是由于对碱性药物的保留主要是由于离子交换机理离子交换机理。 v在高在高pH值的条件下，硅胶表面弱酸性的硅羟基存在值的条件下，硅胶表面弱酸性的硅羟基存在 一定的离子化特征，因而硅胶在高一定的离子化特征，因而硅胶在高pH值的情况下可值的情况下可 作为阳离子交换剂。而许多碱性化合物在高作为阳离子交换剂。而许多碱性化合物在高pH值值 （pH10）时

38、也能部分质子化，这样）时也能部分质子化，这样NS/RE中具备了中具备了 阳离子交换的物质条件。阳离子交换的物质条件。 vNS/RE系统种组分主要系统种组分主要依碱性强弱出峰依碱性强弱出峰，色谱峰的，色谱峰的 对称性很好，峰形尖锐。对称性很好，峰形尖锐。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 3 3、流动相、流动相 vNS/RE法常用的流动相为甲醇水相缓冲液或乙腈法常用的流动相为甲醇水相缓冲液或乙腈 水相缓冲液，合适的缓冲剂有三乙胺、硝酸铵水相缓冲液，合适的缓冲剂有三乙胺、硝酸铵 氨水、甲酸铵氨水、高氯酸铵氨水、醋酸铵氨水、甲酸铵氨水、高氯酸铵氨水、醋酸铵 氨水及磷酸氢二铵磷酸

39、等，由于氨水及磷酸氢二铵磷酸等，由于NS/RE利用被测利用被测 组分与硅醇基相互作用，因此不需要加硅醇基掩蔽组分与硅醇基相互作用，因此不需要加硅醇基掩蔽 剂等特殊添加剂，仅用一、二种洗脱液就能对大范剂等特殊添加剂，仅用一、二种洗脱液就能对大范 围内的碱性药物进行分离分析。围内的碱性药物进行分离分析。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 4 4、影响色谱保留因素、影响色谱保留因素 v 保持流动相一定的保持流动相一定的pH值和离子强度，随着流值和离子强度，随着流 动相中水的比例增加，洗脱能力减小。动相中水的比例增加，洗脱能力减小。 v 流动相中三乙胺浓度升高，对含碱性基团组流动

40、相中三乙胺浓度升高，对含碱性基团组 分的洗脱能力提高，保留时间缩短。三乙胺分的洗脱能力提高，保留时间缩短。三乙胺 为阴离子竞争离子，用于竞争硅羟基，以消为阴离子竞争离子，用于竞争硅羟基，以消 除硅羟基对生物间的吸附。除硅羟基对生物间的吸附。 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 v 碱性组分的保留随缓冲盐浓度的增加（离子强度增碱性组分的保留随缓冲盐浓度的增加（离子强度增 加）而减少，这与典型的离子交换系统类似。加）而减少，这与典型的离子交换系统类似。 固定相：固定相：Radial-PAK硅胶；硅胶； 流动相：乙腈水（流动相：乙腈水（60：40， pH 7.8）; 1.异丙嗪异丙嗪 2. 扑尔敏扑尔敏 3.奎尼丁奎尼丁 离子强度对保留的影响离子强度对保留的影响 4 4、影响色谱保留因素、影响色谱保留因素 宋宋 敏敏中国药科大学药分教研室中国药科大学药分教研室 v pH值对值对NS/RE的色谱保留具有两面性。随的色谱保留具有两面性。随pH值的值的 增加，碱性药物的保留先增加后减小。增加，碱性药物的保留先增加后减小。 pH对保留的影响对保留的影响 固定相：固定相：Radial-PAK硅胶；硅胶； 流动相：乙腈水（流动相：乙腈水（60：40， 4mmol/L NaCl）; 1.异丙嗪异丙嗪 2. 去甲麻