第二章光谱分析技术

1、第二章第二章 光谱分析技术光谱分析技术 n本章内容概要：本章内容概要： * * 分光光度技术的基本原理分光光度技术的基本原理 * * 分光光度计的基本结构与操作分光光度计的基本结构与操作 * * 分光光度技术的定量方法分光光度技术的定量方法 * * 其他光谱分析技术其他光谱分析技术 波长波长 光谱光谱 区域区域 分析分析 方法方法 0.1A 0.1-1A200-400nm 400-760nm760100025-500m1cm 射线射线X射线射线紫外线紫外线可见光可见光红外光红外光微波微波无线电波无线电波 射线射线 光谱法光谱法 X射线射线 光谱法光谱法 紫外光紫外光 光度法光度法 可见光可见光

2、 光度法光度法 红红 外外 光度法光度法 微微 波波 光谱法光谱法 核磁共振核磁共振 光谱法光谱法 电磁波谱图电磁波谱图 第一节第一节 光谱分析技术的基本原理光谱分析技术的基本原理 一、光谱分析技术的概念一、光谱分析技术的概念 二、光谱分析技术的分类二、光谱分析技术的分类 利用各种化学物质（原子、基团、分子及高分子化合物）利用各种化学物质（原子、基团、分子及高分子化合物） 所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征来确定其性质、结构所具有的发射、吸收或散射光谱谱系的特征来确定其性质、结构 及含量的技术。及含量的技术。 光谱分析技术光谱分析技术 发射光谱分析发射光谱分析 吸收光谱分析（常用）吸收光谱

3、分析（常用） 散射光谱分析散射光谱分析 三、分光光度技术的基本原理三、分光光度技术的基本原理 1 1、光的吸收现象与吸收曲线、光的吸收现象与吸收曲线 * *光色互补光色互补 红红 紫紫 蓝蓝 青青 蓝蓝 青青 绿绿 黄黄 橙橙 白白 曲线绘制：曲线绘制： * *吸收曲线吸收曲线 概念：概念： 利用各种不同的波长测定物质的吸光度，以波长为横利用各种不同的波长测定物质的吸光度，以波长为横 坐标，吸光度为纵坐标，连接各点成光滑的曲线。坐标，吸光度为纵坐标，连接各点成光滑的曲线。 * *应用：应用： 定性分析定性分析吸收曲线的形状吸收曲线的形状 定量分析定量分析max max 为选择单色光的依据为选择

4、单色光的依据 A nm300 400500 600 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 700 0.800 0.900 max 脱氢皮质酮 睾丸酮 （nm） A minmaxsh * * * * * * *吸收曲线吸收曲线 制作者：制作者： 制作日期：制作日期： 制作仪器：制作仪器： (1)(1)吸光度（吸光度（A)A)（absorbanceabsorbance）与透光率（）与透光率（T)T)（transmittancetransmittance） T=T= I I IoIo 2 2、光吸收定律、光吸收定律Lambert-BeerLambert-

5、Beer定律定律 当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分 光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射 光强度为光强度为IoIo，透射光强度为，透射光强度为I I，I I和和I I0 0之比称为透光度之比称为透光度，即：即： A = -lgT = -lgI/IA = -lgT = -lgI/I0 0 = lgI = lgI0 0/I/I 条件：单色光，稀溶液条件：单色光，稀溶液 (2)Lambert-Beer(2)Lambert-Beer定律定律 Lambert-Bee

6、r Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，其表达式为：厚度之间关系的基本定律，其表达式为： A = K L C 式中式中A A为吸光度；为吸光度；K K为吸光系数；为吸光系数；L L为溶液层厚度（光径）；为溶液层厚度（光径）； C C为溶液浓度为溶液浓度 （Lambert-BeerLambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。）定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体。） 入射光入射光IoIo 透射光透射光I I 反射光反射光IrIr 散射光散射光IsIs 吸收光吸收

7、光IaIa 分类：分类： 1mol 1mol（ （摩尔吸光系数）摩尔吸光系数） 1cm1cm E E 1% 1% （ （百分吸光系数）百分吸光系数） 1cm1cm 应用：应用： 1.1.根据根据进行物质的定性、定量分析进行物质的定性、定量分析 2. 2. 的大小反映测定的灵敏度的大小反映测定的灵敏度，越大，灵敏度越高。越大，灵敏度越高。 意义：意义：表示物质对某一特定波长的吸收能力，表示物质对某一特定波长的吸收能力， 愈大，表示愈大，表示 对某波长光的吸收能力愈强。在一定条件下是特征性常数对某波长光的吸收能力愈强。在一定条件下是特征性常数 3.3.吸光系数吸光系数 概念：在一定条件下，物质浓度

8、为概念：在一定条件下，物质浓度为1mol/l1mol/l、液层厚度为、液层厚度为1cm1cm 时的吸光度值，与溶液的性质有关。时的吸光度值，与溶液的性质有关。 第二节第二节 分光光度计的基本结构与操作分光光度计的基本结构与操作 可见光及近红外线可见光及近红外线 紫外光紫外光 一、仪器结构一、仪器结构 光源光源 钨丝灯钨丝灯 氢灯或氘灯氢灯或氘灯 单色器单色器 棱镜棱镜 光栅光栅 检测器检测器 光电管光电管 光电倍增管光电倍增管 显示器显示器 检流计检流计 数码管显示数码管显示 吸收池（比色杯、比色皿）吸收池（比色杯、比色皿） 玻璃玻璃 石英石英 塑料塑料 二、操作方法（二、操作方法（72272

9、2光栅分光光度计）光栅分光光度计） 1 1、接通电源开关，通电、接通电源开关，通电2020分钟预热（打开比色室盖子）分钟预热（打开比色室盖子） 2 2、调节波长、调节波长 3 3、将样品放入比色室、将样品放入比色室 5 5、将开关置于、将开关置于A A位，读数不为零可用消光零调节为位，读数不为零可用消光零调节为0.00.0 6 6、拉动拉杆，读取待测溶液、拉动拉杆，读取待测溶液A A，记录，记录 4 4、将开关置于、将开关置于T T位，打开比色室盖子，调节位，打开比色室盖子，调节T T为为0.00.0，关上，关上 比色室盖子，调节比色室盖子，调节T T为为100.0100.0 样品室样品室 波

10、长调节波长调节 旋钮旋钮 控制面板控制面板 样品槽样品槽 拉杆拉杆 二、操作方法（二、操作方法（722722型分光光度计）型分光光度计） 1 1、开机预热（接通电源开关，通电、开机预热（接通电源开关，通电2020分钟预热）分钟预热） 2 2、波长调整、波长调整 3 3、将样品放入比色室、将样品放入比色室 5 5、“功能键功能键”切换切换“A A ” 模式，仪器显示模式，仪器显示“.000.000”或或“-.000-.000” 6 6、拉动拉杆，读取待测溶液、拉动拉杆，读取待测溶液A A，并记录，并记录 4 4、“功能键功能键”置于置于“T T”，用遮光体或拉动半格拉杆，调，用遮光体或拉动半格拉

11、杆，调0%0%， 取出遮光体或拉杆推到底，调取出遮光体或拉杆推到底，调100%100%。 三、分光光度计波长校正三、分光光度计波长校正 粗测：粗测：580nm580nm有均匀橙黄色光斑，光斑偏红或偏绿，说明有均匀橙黄色光斑，光斑偏红或偏绿，说明 已经偏移。已经偏移。 四、吸光度的校正四、吸光度的校正 铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。 在在2525，将，将4mg4mg铬酸钾溶于铬酸钾溶于100ml100ml的的0.05mol/L KOH0.05mol/L KOH中，放中，放 入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准入比色池中，在不

12、同波长下测定吸光度值，与己知的标准 吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度。吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度。 第三节第三节 分光光度技术的定性、定量方法分光光度技术的定性、定量方法 （一）分光光度技术的定性方法（一）分光光度技术的定性方法 2.2.摩尔消光系数摩尔消光系数检测法检测法 1.1.最大吸收波长最大吸收波长maxmax检测法检测法 一、比较法一、比较法 计算公式：计算公式：Cu= Cu= CsCsf f AuAu AsAs 将标准品与待测样品在相同条件下，显色并测定各自将标准品与待测样品在相同条件下，显色并测定各自 的的A A，由于测定体系的温度、厚度及入射光

13、波长一致，故，由于测定体系的温度、厚度及入射光波长一致，故 可用公式计算待测样品的浓度。可用公式计算待测样品的浓度。 概念：概念： （二）分光光度技术的定量方法（二）分光光度技术的定量方法 标准液的要求：其浓度尽量接近于样品浓度。（双标准）标准液的要求：其浓度尽量接近于样品浓度。（双标准） 二、标准曲线法（二、标准曲线法（standard curvestandard curve） 概念：配制一系列浓度的标准品溶液，按标本处理方法做相同概念：配制一系列浓度的标准品溶液，按标本处理方法做相同 处理，在特定的波长下测定吸光度，以标准液浓度为横处理，在特定的波长下测定吸光度，以标准液浓度为横 坐标，以

14、吸光度为纵坐标，连接成一条通过原点的直线。坐标，以吸光度为纵坐标，连接成一条通过原点的直线。 制作方法：制作方法： 作图法作图法主要主要 直线回归方程计算法直线回归方程计算法 制备标准液：制备标准液：5656个不同浓度梯度个不同浓度梯度 加样显色：加样显色：3 3个平行管个平行管 比色记录：平均比色记录：平均A A 作图：作图： 标准检量表的制作：标准检量表的制作： 作图法步骤作图法步骤 标准曲线（曲线） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Y=ax+b 注意事项：注意事项： 1.1.测定条件应一致，条件改变应重新绘制测定条件应一致，条件改变应重新绘制 2.2.标准液浓度应准确标准液浓度应

15、准确 3.3.重复、平行测定重复、平行测定 4.4.比例适当比例适当 5.5.吸光度范围应在吸光度范围应在0.050.05 1.0 1.0 之间之间 6.6.高浓度标本超出线性范围时，应将标本稀释后在测定。高浓度标本超出线性范围时，应将标本稀释后在测定。 三、差示法（三、差示法（differential spectrophotometrydifferential spectrophotometry） 原理：对物质浓度过高或过低时，可用一定浓度的标准液原理：对物质浓度过高或过低时，可用一定浓度的标准液 代替空白管做参比，提高测定的精确度。代替空白管做参比，提高测定的精确度。 A= Au-As =

16、 LA= Au-As = L（Cu-CsCu-Cs）= L c= L c 四、摩尔吸光系数法四、摩尔吸光系数法 原理：利用已知的吸光系数，由测得的吸光度计算样品的浓度原理：利用已知的吸光系数，由测得的吸光度计算样品的浓度 C=C= A A L L 五、五、多组分混合物的测定多组分混合物的测定 各组分吸收峰不互相重叠各组分吸收峰不互相重叠-可分别测定可分别测定 各组分吸收峰互相重叠各组分吸收峰互相重叠-等吸收点法、解联立方程法等吸收点法、解联立方程法 双波长法等双波长法等 第四节第四节 其他光谱分析技术其他光谱分析技术 一、火焰光度法一、火焰光度法 原理：某些金属的基态原子在受到火焰激发后，其外

17、层电子原理：某些金属的基态原子在受到火焰激发后，其外层电子 从基态跃迁到激发态，当返回基态时，可发出特征性从基态跃迁到激发态，当返回基态时，可发出特征性 的谱线，检测其强度可进行定量分析。的谱线，检测其强度可进行定量分析。 应用：钾、钠等碱金属和碱土金属的检测应用：钾、钠等碱金属和碱土金属的检测 仪器组成：雾化燃烧系统、光学系统、检测系统仪器组成：雾化燃烧系统、光学系统、检测系统 特点：操作烦琐、干扰因素多、被简便的离子选择电极法取代特点：操作烦琐、干扰因素多、被简便的离子选择电极法取代 二、原子吸收分光光度法二、原子吸收分光光度法 应用：体液中多种金属元素（钙、铁）的检测应用：体液中多种金属

18、元素（钙、铁）的检测 在环境检测、职业病防治中痕量有害元素（砷、汞）的检测在环境检测、职业病防治中痕量有害元素（砷、汞）的检测 特点：特点： 灵敏度高（灵敏度高（1010-9 -9 1010-6 -6g/L g/L），准确度较高），准确度较高 简便，快速简便，快速 可测全部金属元素和一些半金属元素可测全部金属元素和一些半金属元素 原理：根据待测元素的气态原子能吸收相同原子所发射的特征原理：根据待测元素的气态原子能吸收相同原子所发射的特征 谱线的分析技术，即在一定条件下，原子的吸光度与待谱线的分析技术，即在一定条件下，原子的吸光度与待 测元素的浓度成正比。测元素的浓度成正比。 仪器组成：光源（空心阴极灯）、原子化器、分光系统、检测系统仪器组成：光源（空心阴极灯）、原子化器、分光系统、检测系统 三、荧光光度分析法三、荧光光度分析法 原理：待测物质在激发光的照射下，可由基态跃迁至激发态，原理：待测物质在激发光的照射下，可由基态跃迁至激发态， 当从激发态返回基态时，可发出荧光，其强度与溶液当从激发态返回基态时，可发出荧光，其强度与溶液 的浓度成正比。的浓度成正比。 应用：激素及其代谢产物的测定应用：激素及其代谢产物的测定 生物活性物质