第三节 代谢网络中碳架 物质流的调动

1、2021-7-1张星元：发酵原理1 第三节第三节 代谢网络中碳架代谢网络中碳架 物质流的调动物质流的调动 2021-7-1张星元：发酵原理2 处于一定环境条件下的微处于一定环境条件下的微 生物培养物中，参与代谢的物生物培养物中，参与代谢的物 质在代谢途径（网络）中按一质在代谢途径（网络）中按一 定规律流动，形成微生物代谢定规律流动，形成微生物代谢 的物质流。的物质流。 2021-7-1张星元：发酵原理3 代谢物质的流动过程是一种类似代谢物质的流动过程是一种类似 “流体流动流体流动” 的过程，它具备流动的的过程，它具备流动的 一切属性，诸如一切属性，诸如 方向性、连续性、有方向性、连续性、有 序

2、性、可调性等等，序性、可调性等等， 并且可以接受疏并且可以接受疏 导、阻塞、分流、汇流等导、阻塞、分流、汇流等 “ 治理治理 ”， 也可能发生也可能发生“ 干枯干枯 ”和和“溢出溢出 ( 泛泛 滥滥 ) ”等现象。此外，还有流速和流等现象。此外，还有流速和流 量等问题。量等问题。 2021-7-1张星元：发酵原理4 化能异养型微生物以有机化能异养型微生物以有机 化合物为碳源和能源。因此，化合物为碳源和能源。因此， 在讨论化能异养型微生物代谢在讨论化能异养型微生物代谢 流动时，首先抓住碳元素代谢流动时，首先抓住碳元素代谢 这个主要矛盾，研究微生物细这个主要矛盾，研究微生物细 胞的碳架物质流。胞的

3、碳架物质流。 2021-7-1张星元：发酵原理5 4.3.1 碳架物质在代谢途径（代碳架物质在代谢途径（代 谢网络）中的流动谢网络）中的流动 4.3.2 微生物的代谢流及其治理微生物的代谢流及其治理 2021-7-1张星元：发酵原理6 4.3.1 碳架物质在代谢途径（代谢碳架物质在代谢途径（代谢 网络）中的流动网络）中的流动 在典型的工业发酵过程中，微生在典型的工业发酵过程中，微生 物的代谢流包括营养物质进入细胞、物的代谢流包括营养物质进入细胞、 代谢中间物（碳架物质）在代谢途径代谢中间物（碳架物质）在代谢途径 中的流动和代谢产物从细胞进入环境中的流动和代谢产物从细胞进入环境 这样顺序发生的过

4、程。这样顺序发生的过程。 2021-7-1张星元：发酵原理7 4.3.1.1 有机化合物的组成元素及它们有机化合物的组成元素及它们 各自在生命活动中的作用（略）各自在生命活动中的作用（略） 2021-7-1张星元：发酵原理8 4.3.1.2 碳架物质在代谢途径中的流动碳架物质在代谢途径中的流动 以代谢流动的观点加深对代谢网络以代谢流动的观点加深对代谢网络 的认识：碳架物质在网络的有关途径中的认识：碳架物质在网络的有关途径中 流动，从原料到终端产物碳架物质流经流动，从原料到终端产物碳架物质流经 的路径叫做的路径叫做载流路径载流路径。 2021-7-1张星元：发酵原理9 4.3.1.3 典型工业发

5、酵的工作模式典型工业发酵的工作模式 典型的工业发酵要从发酵液中获典型的工业发酵要从发酵液中获 得微生物的代谢产物，也就是要让原得微生物的代谢产物，也就是要让原 料有机化合物在微生物细胞的有关的料有机化合物在微生物细胞的有关的 代谢途径（载流路径）中流动的过程代谢途径（载流路径）中流动的过程 中，转化成工业发酵的目的产物，最中，转化成工业发酵的目的产物，最 后目的产物分泌出细胞。后目的产物分泌出细胞。 2021-7-1张星元：发酵原理10 Working pattern of cell-machine in Industrial Fermentation 工业发酵细胞机器的工作模式工业发酵细胞机

6、器的工作模式 2021-7-1张星元：发酵原理11 上图中，白色椭圆代表细胞的上图中，白色椭圆代表细胞的界界 面面，界面包围部分是，界面包围部分是细胞机器细胞机器，界面，界面 外侧是细胞机器所在的外侧是细胞机器所在的环境环境。带箭头。带箭头 的黑线代表典型的工业发酵的细胞机的黑线代表典型的工业发酵的细胞机 器的器的载流路径载流路径。 N代表代表营养物质营养物质， P 代表代表目的产物目的产物。 2021-7-1张星元：发酵原理12 4.3.2 微生物的代谢流及其治理微生物的代谢流及其治理 2021-7-1张星元：发酵原理13 我们曾从我们曾从热力学热力学的角度把微生物的角度把微生物 看作远离平

7、衡状态的不平衡的开放体看作远离平衡状态的不平衡的开放体 系；我们曾借助系；我们曾借助电学电学的知识来讨论生的知识来讨论生 物氧化和代谢能的问题；我们曾借用物氧化和代谢能的问题；我们曾借用 互联网互联网的概念来讨论代谢网络的延伸的概念来讨论代谢网络的延伸 问题；在这里我们要借用问题；在这里我们要借用流体力学流体力学的的 常识来分析微生物细胞的代谢流。常识来分析微生物细胞的代谢流。 2021-7-1张星元：发酵原理14 如果把碳架物质流看作水一样的流如果把碳架物质流看作水一样的流 体，那么按照工业发酵的工作模式，就体，那么按照工业发酵的工作模式，就 可把微生物活细胞看作是有一个总的进可把微生物活细

8、胞看作是有一个总的进 水口和一个总的出水口的、包含特定的水口和一个总的出水口的、包含特定的 管道网的大容器，组成管道网的管道有管道网的大容器，组成管道网的管道有 粗有细，管道网的管道有分支、有交叉，粗有细，管道网的管道有分支、有交叉， 有可控的阀门。有可控的阀门。代谢物质流就如同自来代谢物质流就如同自来 水一样在管道和阀门的控制下流进和流水一样在管道和阀门的控制下流进和流 出细胞，形成代谢流。出细胞，形成代谢流。 2021-7-1张星元：发酵原理15 在这个认识的基础上，结合代在这个认识的基础上，结合代 谢能支撑假说和代谢网络假说的内谢能支撑假说和代谢网络假说的内 容，讨论微生物的代谢及代谢流

9、的容，讨论微生物的代谢及代谢流的 变动性；结合本章（变动性；结合本章（ 代谢调节的代谢调节的 3 个子系统个子系统 ）的内容，讨论代谢流对）的内容，讨论代谢流对 环境条件的响应和代谢流治理的可环境条件的响应和代谢流治理的可 能性。最后还要讨论有关代谢节点能性。最后还要讨论有关代谢节点 的刚性的问题。的刚性的问题。 2021-7-1张星元：发酵原理16 微生物的微生物的代谢途经的变动性和可代谢途经的变动性和可 调节性调节性，不但是代谢流飘移的内在原，不但是代谢流飘移的内在原 因，而且也是人工控制代谢流的生物因，而且也是人工控制代谢流的生物 学根据。学根据。工业发酵中，人的主观能动工业发酵中，人的

10、主观能动 作用表现在对代谢流的治理上。作用表现在对代谢流的治理上。治理治理 的直接的目的是让微生物细胞过量合的直接的目的是让微生物细胞过量合 成（成（ overproduction ）人们所需要的人们所需要的 代谢产物。代谢产物。 2021-7-1张星元：发酵原理17 4.3.2.1 碳架物质在代谢网络中流经的碳架物质在代谢网络中流经的 分支处及各分支的流量分配分支处及各分支的流量分配 4.3.2.2 过量合成与微生物的异常代谢过量合成与微生物的异常代谢 4.3.2.3 溢出代谢溢出代谢 4.3.2.4 代谢流治理的可能性和现实性代谢流治理的可能性和现实性 4.3.2.5 代谢网络的刚性代谢网

11、络的刚性 2021-7-1张星元：发酵原理18 4.3.2.1 碳架物质在代谢网络中流经的碳架物质在代谢网络中流经的 分支处及各分支的流量分配分支处及各分支的流量分配 我们把代谢网络中代谢途径的交我们把代谢网络中代谢途径的交 叉点叫做代谢网络的叉点叫做代谢网络的 “ 节点节点 ”， 实实 际上它们是碳架物质在代谢网络中流际上它们是碳架物质在代谢网络中流 经的经的代谢中间物代谢中间物。初级代谢网络的中。初级代谢网络的中 心板块上的心板块上的 12 种前体代谢物种前体代谢物是当然是当然 的的节点节点，而且还是代谢途径的，而且还是代谢途径的分流分流或或 汇流汇流处。处。 2021-7-1张星元：发酵

12、原理19 节点处不论发生汇流还是分流，节点处不论发生汇流还是分流， 都存在都存在流量分配流量分配的问题。这个分配的问题。这个分配 既与遗传因素有关，又与条件因素既与遗传因素有关，又与条件因素 有关。有关。不同微生物物种的代谢途径不同微生物物种的代谢途径 基本一致，基本一致，因此，可在微生物学有因此，可在微生物学有 关工具书查到有关的途径；关工具书查到有关的途径；而代谢而代谢 调节机制并不完全一样调节机制并不完全一样，不一致的，不一致的 情况可在有关论文或综述中找到。情况可在有关论文或综述中找到。 2021-7-1张星元：发酵原理20 在生物化学中，早有一套描述代谢途径在生物化学中，早有一套描述

13、代谢途径 的调节机制的方法，例如，用一个从效应物的调节机制的方法，例如，用一个从效应物 （途径的终端产物）引出的、指向途径中某（途径的终端产物）引出的、指向途径中某 个代表酶的短箭头的长箭头来标示反馈调节。个代表酶的短箭头的长箭头来标示反馈调节。 这种标示方法对于线状途径或偶有分支的途这种标示方法对于线状途径或偶有分支的途 径来说，是很有用的，但是，如果在代谢网径来说，是很有用的，但是，如果在代谢网 络图中使用，代表调节的箭头与代表酶的箭络图中使用，代表调节的箭头与代表酶的箭 头交织在一起，容易引起误解。头交织在一起，容易引起误解。 因此我们要因此我们要启用一种新的代谢调节图图启用一种新的代谢

14、调节图图 例，用来标记代谢网络图例，用来标记代谢网络图。这种标记方法有。这种标记方法有 四个要点：四个要点： 2021-7-1张星元：发酵原理21 标明调节方式标明调节方式 用用“I”表示表示抑制抑制（inhibition），），用用 “A”表示表示激活激活（ activation ），），用用 “R” 表示表示阻遏阻遏（repression）；）； 标明效应物标明效应物 一般用三个字母标示效应物（一般用三个字母标示效应物（ 调节特调节特 定的酶的水平或活性的化合物定的酶的水平或活性的化合物 叫做这种酶叫做这种酶 的效应物）的效应物） ； 2021-7-1张星元：发酵原理22 标明受调节的酶：

15、标明受调节的酶： 代谢网络图中箭头所代表的酶的代谢网络图中箭头所代表的酶的 名称放在括号内，名称放在括号内， 标在该箭头旁边；标在该箭头旁边； 对酶的调节的对酶的调节的具体的表示方法具体的表示方法： 在代表酶的箭头旁边标上代表效在代表酶的箭头旁边标上代表效 应物的应物的 3 个字母和代表调节机制的特个字母和代表调节机制的特 定字母。定字母。 2021-7-1张星元：发酵原理23 例如：某效应物名称后面加上例如：某效应物名称后面加上 “I”， 标在代表酶的箭头旁边，表示该效应物对该标在代表酶的箭头旁边，表示该效应物对该 酶的酶的抑制作用抑制作用；效应物名称后面加上；效应物名称后面加上 “A”，

16、标在代表酶的箭头旁边，表示该效应物对该标在代表酶的箭头旁边，表示该效应物对该 酶的酶的激活作用激活作用；效应物名称后面加上；效应物名称后面加上 “R”， 标在代表酶的箭头旁边，表示该效应物对该标在代表酶的箭头旁边，表示该效应物对该 酶的酶的阻遏作用阻遏作用。如果。如果 2 种效应物种效应物协同作用协同作用， 则在两个效应物的名称都写上，再在后面加则在两个效应物的名称都写上，再在后面加 上对应的英文字母。上对应的英文字母。 2021-7-1张星元：发酵原理24 2021-7-1张星元：发酵原理25 上图（碳架物质在上图（碳架物质在 EMP和和 HMP途径途径 上的分流控制图）是一张按此方法标示的

17、上的分流控制图）是一张按此方法标示的 网络图，网络图，请按此方法读图，并从以下说明请按此方法读图，并从以下说明 中得到帮助。中得到帮助。 大肠杆菌细胞磷酸果糖激酶（大肠杆菌细胞磷酸果糖激酶（PFK） 的酶水平随条件而变动，有氧生长中细胞的酶水平随条件而变动，有氧生长中细胞 的的PFK水平低于厌氧生长中的细胞，有氧水平低于厌氧生长中的细胞，有氧 生长中的细胞的生长中的细胞的PFK（由二聚体组成），由二聚体组成）， 对对ATP不敏感，厌氧生长中的细胞的不敏感，厌氧生长中的细胞的PFK （由四聚体组成），对由四聚体组成），对ATP敏感。敏感。 2021-7-1张星元：发酵原理26 在有氧条件下在有氧

18、条件下，由于，由于PFK的低水平和的低水平和 FDP 醛缩酶（醛缩酶（FDPA）的极端低水平，的极端低水平，大大 肠杆菌主要经肠杆菌主要经 HMP 途径降解葡萄糖途径降解葡萄糖。因因 为在有氧条件下为在有氧条件下 PFK 对对 ATP不敏感，且不敏感，且 其活力高于其活力高于FDP醛缩酶（醛缩酶（FDPA ），），FDP 有累积有累积，所以它可能对，所以它可能对 HMP 途径的途径的 6-磷磷 酸葡萄糖酸脱氢酶（酸葡萄糖酸脱氢酶（ 6PGDH ）起抑制物起抑制物 的作用，使的作用，使6PGDH成为成为HMP降解流上的降解流上的 一个一个“阀门阀门”（有氧条件下的控制（有氧条件下的控制“阀阀 门

19、门”）。）。 2021-7-1张星元：发酵原理27 在厌氧条件下在厌氧条件下，PFK和和FDPA水平较有水平较有 氧时高，因而氧时高，因而 EMP 途径对葡萄糖降解代谢途径对葡萄糖降解代谢 的参与程度增加的参与程度增加。 因为因为 PFK 的水平仍高于的水平仍高于 FDPA，FDP 仍然累积并继续抑制仍然累积并继续抑制 6PGDH， 但随着但随着EMP参与程度的增加，参与程度的增加，EMP 途径所途径所 产生的产生的NADH浓度增高浓度增高。NADH是是6-磷酸葡磷酸葡 萄糖脱氢酶（萄糖脱氢酶（ G6PDH ）的效应物，的效应物，NADH 浓度上升浓度上升就会抑制就会抑制 G6PDH，使使 G

20、6PDH 成成 为为 HMP降解流上的另一个降解流上的另一个 “ 阀门阀门 ” （ 厌厌 氧条件下的控制氧条件下的控制 “ 阀门阀门 ” ）。）。 2021-7-1张星元：发酵原理28 这种抑制作用是必要的，因为提高葡这种抑制作用是必要的，因为提高葡 萄糖浓度可以使萄糖浓度可以使 FDPA水平上升许多倍，水平上升许多倍， 而而 PFK 水平基本保持不变，这样水平基本保持不变，这样 FDP 浓浓 度势必是低的，以致无法控制度势必是低的，以致无法控制 6PGDH ， 这时这时 NADH就通过对就通过对 G6PDH 的抑制作用的抑制作用 控制控制 HMP 降解流。这种两个降解流。这种两个“阀门阀门

21、”交交 替控制的机制可以解释为什么在替控制的机制可以解释为什么在严格厌氧严格厌氧 条件下，大肠杆菌经条件下，大肠杆菌经 HMP 途径降解的葡途径降解的葡 萄糖只占葡萄糖降解总量的萄糖只占葡萄糖降解总量的2030。 2021-7-1张星元：发酵原理29 4.3.2.2 过量合成和微生物的异常代谢过量合成和微生物的异常代谢 野生菌株在它们天然栖息地在其野生菌株在它们天然栖息地在其 生长或维持，需要时也能合成人们所生长或维持，需要时也能合成人们所 希望的代谢产物，但在其固有的代谢希望的代谢产物，但在其固有的代谢 调节机制的控制下合成的量不多不少，调节机制的控制下合成的量不多不少， 只够细胞自身生长或

22、维持的需要。体只够细胞自身生长或维持的需要。体 现了微生物细胞的现了微生物细胞的经济性经济性。 2021-7-1张星元：发酵原理30 适用于发酵生产的微生物必须具有适用于发酵生产的微生物必须具有 有过量合成的能力，也就是说是其目的有过量合成的能力，也就是说是其目的 产物的合成量必须大大高于它通常的合产物的合成量必须大大高于它通常的合 成量。要做到这一点，不仅要求合成目成量。要做到这一点，不仅要求合成目 的产物的途径畅通，还必须有将目的产的产物的途径畅通，还必须有将目的产 物排出细胞的满意的机制。物排出细胞的满意的机制。过量合成的过量合成的 速率取决于微生物的遗传性能，以及在速率取决于微生物的遗

23、传性能，以及在 培养条件下细胞的生理状态。培养条件下细胞的生理状态。 2021-7-1张星元：发酵原理31 把自然界中自然竞争中幸存的微把自然界中自然竞争中幸存的微 生物称为生物称为野生型微生物野生型微生物，它们具有比，它们具有比 较严密的代谢调节功能，至少在它们较严密的代谢调节功能，至少在它们 幸存的环境条件下不会过量合成初级幸存的环境条件下不会过量合成初级 代谢产物。代谢产物。在这样的细胞经济体系中，在这样的细胞经济体系中， 细胞的生产力体现在其自身的增殖。细胞的生产力体现在其自身的增殖。 细胞固有的生产关系支持细胞自身的细胞固有的生产关系支持细胞自身的 增殖（生产细胞），不支持（人的）增

24、殖（生产细胞），不支持（人的） 目的产物的过量生产（生产特定的初目的产物的过量生产（生产特定的初 级代谢产物）。级代谢产物）。 2021-7-1张星元：发酵原理32 要解放细胞对于目的产物（特要解放细胞对于目的产物（特 定的初级代谢产物）的生产力，就定的初级代谢产物）的生产力，就 有必要改变细胞原有的生产关系。有必要改变细胞原有的生产关系。 对微生物进行遗传改造，就是要对微生物进行遗传改造，就是要修修 正原有的生产关系。正原有的生产关系。 2021-7-1张星元：发酵原理33 微生物过量合成目的产物（微生物过量合成目的产物（特特 定的代谢中间产物定的代谢中间产物）的过程，实质）的过程，实质 上

25、是上是功能残缺功能残缺或或遗传失常遗传失常的微生物的微生物 细胞在人为的特定条件下进行细胞在人为的特定条件下进行异常异常 代谢代谢的过程。因此，的过程。因此，研究微生物过研究微生物过 量合成指定的初级代谢产物的机理，量合成指定的初级代谢产物的机理， 就是研究工业就是研究工业微生物的病理学微生物的病理学。 2021-7-1张星元：发酵原理34 微生物排出某些微生物排出某些能量代谢副产物能量代谢副产物 的过程，实质上是兼性厌氧微生物在的过程，实质上是兼性厌氧微生物在 环境条件逼迫下（如缺氧），变通地环境条件逼迫下（如缺氧），变通地 维持生计维持生计的过程。的过程。兼性厌氧微生物细兼性厌氧微生物细

26、胞在缺氧的条件下，以变通的方式实胞在缺氧的条件下，以变通的方式实 现还原力的平衡和辅酶的再生和回用，现还原力的平衡和辅酶的再生和回用， 使细胞的能量代谢得以维持，与此同使细胞的能量代谢得以维持，与此同 时形成并分泌出能量代谢副产物。时形成并分泌出能量代谢副产物。例例 如酿酒酵母在发酵液中累积能量代谢如酿酒酵母在发酵液中累积能量代谢 副产物乙醇的过程，就是这样的过程。副产物乙醇的过程，就是这样的过程。 2021-7-1张星元：发酵原理35 4.3.2.3 溢出代谢溢出代谢 发生溢出代谢（发生溢出代谢（overflow metabolism） 的原因是，代谢途径前段的运转速率大于的原因是，代谢途径

27、前段的运转速率大于 后段的运转速率。采用改变环境条件或限后段的运转速率。采用改变环境条件或限 制营养供应等方法，可促使微生物进行溢制营养供应等方法，可促使微生物进行溢 出代谢。出代谢。 这里介绍两个溢出代谢的实例：这里介绍两个溢出代谢的实例： TCA环中间产物柠檬酸的溢出代谢，环中间产物柠檬酸的溢出代谢， 导致能量代谢的副产物乙醇生成的溢出导致能量代谢的副产物乙醇生成的溢出 代谢。代谢。 2021-7-1张星元：发酵原理36 柠檬酸的溢出代谢：柠檬酸的溢出代谢： 多种微生物均能因受激而过量合成柠多种微生物均能因受激而过量合成柠 檬酸。研究柠檬酸溢出代谢的最好的例子檬酸。研究柠檬酸溢出代谢的最好

28、的例子 无疑是黑曲霉。无疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定环黑曲霉之所以能在特定环 境条件下累积柠檬酸，是因为在这种环境境条件下累积柠檬酸，是因为在这种环境 条件下代谢途径前段的运转速率大于后段条件下代谢途径前段的运转速率大于后段 的运转速率。的运转速率。柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉柠檬酸的溢出代谢是黑曲霉 特有的遗传和生化机制与培养条件共同起特有的遗传和生化机制与培养条件共同起 作用的结果。引起溢出代谢的原因包括以作用的结果。引起溢出代谢的原因包括以 下三个方面：下三个方面： 2021-7-1张星元：发酵原理37 GlcG-6-P (PFK)CTA ,NH4I + A FDP PYR OAA Ac

29、CoA CTA CAA ICA - KG (PC) (CS) (KD) 黑曲霉中柠檬酸的代谢溢出黑曲霉中柠檬酸的代谢溢出 2021-7-1张星元：发酵原理38 高水平的柠檬酸合成能力高水平的柠檬酸合成能力。这个能力。这个能力 由由 3 个因素构成。第一是在有高浓度草酰乙个因素构成。第一是在有高浓度草酰乙 酸（酸（OAA ）的情况下对的情况下对 AcCoA 具有高度亲具有高度亲 和力的组成型的和力的组成型的柠檬酸合成酶柠檬酸合成酶 （ CS ） 的存的存 在；第二是催化丙酮酸在；第二是催化丙酮酸 （ PYR ）固定固定 CO2 生成草酰乙酸反应的高水平的组成型的生成草酰乙酸反应的高水平的组成型的

30、丙酮丙酮 酸羧化酶酸羧化酶（ PC ） 的存在；第三是在缺少锰的存在；第三是在缺少锰 的条件下，蛋白质分解或蛋白质合成受阻造的条件下，蛋白质分解或蛋白质合成受阻造 成的成的铵的高浓度能解除柠檬酸（铵的高浓度能解除柠檬酸（CTA）对磷对磷 酸果糖激酶（酸果糖激酶（PFK）的抑制。此外，柠檬酸的抑制。此外，柠檬酸 的分泌降低其胞内浓度。的分泌降低其胞内浓度。 2021-7-1张星元：发酵原理39 较低的降解柠檬酸的能力。较低的降解柠檬酸的能力。这能这能 力由两个因素构成。第一是力由两个因素构成。第一是低水平的低水平的-酮酮 戊二酸脱氢酶戊二酸脱氢酶（ KD ）影响影响 TCA环运行环运行 的畅通程

31、度，的畅通程度， 使使TCA环前半部的中间产环前半部的中间产 物积压；物积压； 第二，在锰缺乏的条件下，第二，在锰缺乏的条件下，顺顺 乌头酸酶（乌头酸酶（ AE ）和和 异柠檬酸脱氢酶异柠檬酸脱氢酶 （ID）的活性降低的活性降低，从而使柠檬酸的累，从而使柠檬酸的累 积比其它几种酸（积比其它几种酸（ 顺乌头酸、异柠檬酸顺乌头酸、异柠檬酸 和和-酮戊二酸）更明显。酮戊二酸）更明显。 2021-7-1张星元：发酵原理40 在柠檬酸过量合成阶段，在柠檬酸过量合成阶段， 培养基的培养基的 pH 值值显然会影响细显然会影响细 胞膜对目的产物柠檬酸和的跨胞膜对目的产物柠檬酸和的跨 膜输送；柠檬酸的分泌也会影

32、膜输送；柠檬酸的分泌也会影 响响培养基的培养基的 pH 值值。锰与铁的。锰与铁的 缺乏有利于柠檬酸的排出。缺乏有利于柠檬酸的排出。 2021-7-1张星元：发酵原理41 乙醇的溢出代谢：乙醇的溢出代谢： 葡萄糖为碳源，对酿酒酵母进葡萄糖为碳源，对酿酒酵母进 行批式培养，出现二段生长（行批式培养，出现二段生长（ two growth phase）现象：在现象：在第一阶段第一阶段， 葡萄糖浓度较大，萄萄糖的消耗伴葡萄糖浓度较大，萄萄糖的消耗伴 随着随着乙醇的产生乙醇的产生；第二阶段，葡萄；第二阶段，葡萄 糖浓度下降到某值以下，糖浓度下降到某值以下，乙醇被氧乙醇被氧 化化。 2021-7-1张星元：

33、发酵原理42 这样的二段生长现象曾被认为这样的二段生长现象曾被认为 是呼吸途径的阻遏和解阻遏，而且是呼吸途径的阻遏和解阻遏，而且 认为是分解代谢物阻遏（此名称已认为是分解代谢物阻遏（此名称已 被营养阻遏代替，见本章被营养阻遏代替，见本章4.1.2.1 ）。）。 后来才认识到，酿酒酵母之所以在后来才认识到，酿酒酵母之所以在 葡萄糖培养基中累积乙醇，是因为葡萄糖培养基中累积乙醇，是因为 该微生物有限的呼吸能力，并把这该微生物有限的呼吸能力，并把这 种现象称为瓶颈效应（种现象称为瓶颈效应（ bottleneck effect）。）。 2021-7-1张星元：发酵原理43 细胞并不会因为葡萄糖的高速细

34、胞并不会因为葡萄糖的高速 消耗而附带地形成足够高的呼吸能消耗而附带地形成足够高的呼吸能 力（指呼吸链使力（指呼吸链使NADH再生的能力）再生的能力） 与之配套；而且葡萄糖的异生成途与之配套；而且葡萄糖的异生成途 径（需径（需NADH）因受到高浓度的葡因受到高浓度的葡 萄糖的调节而受阻，更加强了瓶颈萄糖的调节而受阻，更加强了瓶颈 效应。因此瓶颈是对生物氧化中呼效应。因此瓶颈是对生物氧化中呼 吸链电子传递通道的相对狭窄而言吸链电子传递通道的相对狭窄而言 的。的。 2021-7-1张星元：发酵原理44 在供氧情况下，酿酒酵母细胞中葡萄糖在供氧情况下，酿酒酵母细胞中葡萄糖 主要经主要经 EMP-TCA

35、 途径（途径（ 少量经少量经HMP途径途径 ） 氧化降解。这些途径运行中形成的氧化降解。这些途径运行中形成的NADH和和 FADH2分子上的电子需经电子传递链（呼吸分子上的电子需经电子传递链（呼吸 链）传递给分子氧。链）传递给分子氧。 当葡萄糖浓度较低时，葡萄糖氧化降解当葡萄糖浓度较低时，葡萄糖氧化降解 过程所需配套的电子传递能力处于电子传递过程所需配套的电子传递能力处于电子传递 链传递能力范围以内，这时氧的吸收速率与链传递能力范围以内，这时氧的吸收速率与 细胞的生长速率成线性关系。辅酶细胞的生长速率成线性关系。辅酶NADH 和和 辅基辅基 FADH2 完全可以在电子传递链释放电完全可以在电子

36、传递链释放电 子而得到再生。子而得到再生。 2021-7-1张星元：发酵原理45 当葡萄糖的浓度超过某值，葡萄糖氧当葡萄糖的浓度超过某值，葡萄糖氧 化降解过程所需配套的电子传递能力超越化降解过程所需配套的电子传递能力超越 微生物细胞电子传递链传递能力范围，一微生物细胞电子传递链传递能力范围，一 部分部分NADH不能通过电子传递链而再生成不能通过电子传递链而再生成 NAD+， 只好将电子交给内源的有机化合只好将电子交给内源的有机化合 物乙醛，将乙醛还原成乙醇，从而实现还物乙醛，将乙醛还原成乙醇，从而实现还 原力的平衡。从而导致生成乙醇的溢出代原力的平衡。从而导致生成乙醇的溢出代 谢。谢。由此可见

37、，乙醇的溢出代谢实际上是由此可见，乙醇的溢出代谢实际上是 细胞内生物氧化过程中形成的还原力相对细胞内生物氧化过程中形成的还原力相对 于电子传递链的呼吸能力的溢出，推动了于电子传递链的呼吸能力的溢出，推动了 乙醛还原生成乙醇的发酵过程。乙醛还原生成乙醇的发酵过程。 2021-7-1张星元：发酵原理46 从以上实例可以看到，溢出从以上实例可以看到，溢出 代谢的发生，不但要求微生物本代谢的发生，不但要求微生物本 身具有相应的遗传根据，还必须身具有相应的遗传根据，还必须 具备相应的环境条件。具备相应的环境条件。 对于工业发酵来说，就是特对于工业发酵来说，就是特 定的生产菌种和与其对应的生产定的生产菌种

38、和与其对应的生产 工艺条件。工艺条件。 2021-7-1张星元：发酵原理47 4.3.2.4 代谢流代谢流“治理治理”的可能性和的可能性和 现实性现实性 代谢流具有流体流动的基本属代谢流具有流体流动的基本属 性，因此具有性，因此具有“治理治理”的可能性；的可能性； 微生物代谢的变动性和微生物遗传微生物代谢的变动性和微生物遗传 的保守性，加上人的主观能动性，的保守性，加上人的主观能动性， 能使可能变为现实。能使可能变为现实。 本课程主要讨论初级代谢产物本课程主要讨论初级代谢产物 的过量合成，兼顾次级代谢产物的的过量合成，兼顾次级代谢产物的 合成。合成。 2021-7-1张星元：发酵原理48 现代

39、发酵工程依靠微生物活细现代发酵工程依靠微生物活细 胞来完成发酵工厂生产线上不可缺胞来完成发酵工厂生产线上不可缺 少的加工（或转化）步骤，在这个少的加工（或转化）步骤，在这个 意义上，意义上，微生物活细胞就是工业发微生物活细胞就是工业发 酵生产线上不可缺少的微生物生物酵生产线上不可缺少的微生物生物 机器（或称细胞机器）机器（或称细胞机器），是发酵工，是发酵工 厂里关键的生产机器。厂里关键的生产机器。 2021-7-1张星元：发酵原理49 细胞机器与普通意义上的机器不细胞机器与普通意义上的机器不 同，它们同，它们必须由代谢能必须由代谢能 （ metabolic energy）直接驱动直接驱动。在发

40、酵工厂的生。在发酵工厂的生 产线上，微生物必须完成微生物细胞产线上，微生物必须完成微生物细胞 机器的机器的在线制造（细胞增殖）和生产在线制造（细胞增殖）和生产 运行（目的产物的合成和输出）的双运行（目的产物的合成和输出）的双 重任务。重任务。 2021-7-1张星元：发酵原理50 根据工业发酵的现状，根据工业发酵的现状，把依靠化能把依靠化能 异养型微生物合成某最终被分泌到胞外异养型微生物合成某最终被分泌到胞外 的初级代谢产物的过程，作为工业发酵的初级代谢产物的过程，作为工业发酵 的典型过程来研究，并把代谢研究的重的典型过程来研究，并把代谢研究的重 点放在碳的代谢上。点放在碳的代谢上。从而建立了

41、从而建立了生物机生物机 器器（又称（又称细胞机器细胞机器）工作的基本模式。）工作的基本模式。 在此在此工作模式工作模式的基础上，提出了工业发的基础上，提出了工业发 酵中微生物代谢的酵中微生物代谢的五段式五段式和初级代谢产和初级代谢产 物的过量合成的物的过量合成的五字策略五字策略。 2021-7-1张星元：发酵原理51 在物竞天择的基础上建立的细胞经在物竞天择的基础上建立的细胞经 济体系已经经受长期的实践检验，并已济体系已经经受长期的实践检验，并已 成为微生物细胞生命活动的保障体系。成为微生物细胞生命活动的保障体系。 微生物通过生存竞争而获得的一整套自微生物通过生存竞争而获得的一整套自 我调节机

42、制，原本服务于微生物的自然我调节机制，原本服务于微生物的自然 竞争和生命保障，因此它不会大量的合竞争和生命保障，因此它不会大量的合 成维持自我生存之外的代谢产物。而人成维持自我生存之外的代谢产物。而人 类因自我发展的需要，却希望微生物能类因自我发展的需要，却希望微生物能 够大量地合成能满足人类需求为目的产够大量地合成能满足人类需求为目的产 物（微生物的代谢产物）。物（微生物的代谢产物）。 2021-7-1张星元：发酵原理52 微生物代谢产物的生物合成是系微生物代谢产物的生物合成是系 统工程，要完成这一类系统工程，必统工程，要完成这一类系统工程，必 须依靠微生物的高度有序的生命活动，须依靠微生物

43、的高度有序的生命活动， 决不是打乱它，而是在可能的范围内决不是打乱它，而是在可能的范围内 对它进行有效的引导。对它进行有效的引导。 工业发酵呼唤人与微生物的合作，工业发酵呼唤人与微生物的合作， 而在合作中，人处于主导的地位，人而在合作中，人处于主导的地位，人 应该发挥主观能动作用。应该发挥主观能动作用。 2021-7-1张星元：发酵原理53 初级代谢产物的合成初级代谢产物的合成 初级代谢产物是指这样一些低初级代谢产物是指这样一些低 分子质量的合成途径的终产物，它分子质量的合成途径的终产物，它 们们是构建生物大分子的分子模块是构建生物大分子的分子模块， 是微生物营养性生长所必需的生长是微生物营养

44、性生长所必需的生长 因子，如氨基酸、嘌呤和嘧啶的核因子，如氨基酸、嘌呤和嘧啶的核 苷与核苷酸以及维生素。苷与核苷酸以及维生素。 2021-7-1张星元：发酵原理54 初级代谢产物都是从中心代谢途径初级代谢产物都是从中心代谢途径 的中间产物（的中间产物（12种前体代谢物）开始合种前体代谢物）开始合 成的。成的。因为它们都是微生物营养性生长因为它们都是微生物营养性生长 所必需的，除了遗传上有缺陷的菌株外，所必需的，除了遗传上有缺陷的菌株外， 微生物细胞具有齐全的初级代谢途径基微生物细胞具有齐全的初级代谢途径基 因，也就是说因，也就是说在合适的环境条件下它们在合适的环境条件下它们 的初级代谢途径是普

45、遍存在的的初级代谢途径是普遍存在的。初级途。初级途 径上的酶的特异性比次级代谢的酶的特径上的酶的特异性比次级代谢的酶的特 异性要高。异性要高。 2021-7-1张星元：发酵原理55 各种微生物的初级代谢产物的合成途各种微生物的初级代谢产物的合成途 径基本相同，在同一属微生物中，初级代径基本相同，在同一属微生物中，初级代 谢产物合成途径的差异是十分罕见的，但谢产物合成途径的差异是十分罕见的，但 在合成的调节机制上有较大的差异。在合成的调节机制上有较大的差异。 初级代谢产物合成的途径是稳定的，初级代谢产物合成的途径是稳定的， 不同微生物物种的调节机制是可以弄清楚不同微生物物种的调节机制是可以弄清楚

46、 或基本弄清楚的，这就是对这种合成代谢或基本弄清楚的，这就是对这种合成代谢 流流“治理治理”的基础。的基础。这种这种“治理治理”要用到要用到 遗传手段（遗传手段（遗传脱钩遗传脱钩），并辅之以培养条），并辅之以培养条 件的优化（件的优化（环境协调环境协调），以求达到），以求达到初级代初级代 谢产物过量合成的目的。谢产物过量合成的目的。 2021-7-1张星元：发酵原理56 . 初级代谢产物过量合成的五字策略初级代谢产物过量合成的五字策略 在分析细胞机器的生产运行时，可把在分析细胞机器的生产运行时，可把 它看作是分步进行的过程。首先细胞外的它看作是分步进行的过程。首先细胞外的 营养物质从环境（培养

47、基）跨膜进入细胞；营养物质从环境（培养基）跨膜进入细胞； 然后，一般要经过向心、中心和离心然后，一般要经过向心、中心和离心 3 段段 连续的代谢途径的代谢，才能在胞内生成连续的代谢途径的代谢，才能在胞内生成 目的产物；最后，目的产物经过膜排出细目的产物；最后，目的产物经过膜排出细 胞，回到环境（发酵醪液）。胞，回到环境（发酵醪液）。 2021-7-1张星元：发酵原理57 “载流途径载流途径”泛指承载代谢物流泛指承载代谢物流 的代谢途径。的代谢途径。“载流路径载流路径”泛指由不泛指由不 止一条载流途径按序首尾衔接而组成止一条载流途径按序首尾衔接而组成 的代谢通道。的代谢通道。 在发酵工程领域，在

48、发酵工程领域，“载流路径载流路径” 作为发酵工程的专用术语，被定义为作为发酵工程的专用术语，被定义为 从主要有机原料到目的产物一组载流从主要有机原料到目的产物一组载流 途径的有序组合。途径的有序组合。 2021-7-1张星元：发酵原理58 典型的典型的载流路径载流路径是指存在于代谢网是指存在于代谢网 络中的这样的代谢通道，即络中的这样的代谢通道，即由多至五段由多至五段 承担不同代谢分工的、依次衔接的代谢承担不同代谢分工的、依次衔接的代谢 途径组成的代谢通道。途径组成的代谢通道。因此有因此有载流路径载流路径 的五段式的五段式之称。在这条载流路径上流动之称。在这条载流路径上流动 的代谢主流对应地也

49、有五段，从而派生的代谢主流对应地也有五段，从而派生 出出代谢主流的五段式代谢主流的五段式。载流途径的五段。载流途径的五段 式和代谢主流的五段式统称为式和代谢主流的五段式统称为微生物代微生物代 谢的五段式谢的五段式。 2021-7-1张星元：发酵原理59 在此五段式的基础上，从不同的角度在此五段式的基础上，从不同的角度 出发，提出能作为一个整体，用于设计育出发，提出能作为一个整体，用于设计育 种以及发酵工艺控制的五字策略（简称种以及发酵工艺控制的五字策略（简称工工 业发酵的五字策略业发酵的五字策略）：进、通、节、堵、）：进、通、节、堵、 出。出。“ 五字策略五字策略 ” 就是从合作的良好愿就是从

50、合作的良好愿 望出发，发挥人的主观能动作用，主动与望出发，发挥人的主观能动作用，主动与 微生物合作实现工业发酵效益的策略。这微生物合作实现工业发酵效益的策略。这 个策略来自初级代谢产物过量合成的研究，个策略来自初级代谢产物过量合成的研究， 故实际上是故实际上是初级代谢产物过量合成的五字初级代谢产物过量合成的五字 策略策略。 2021-7-1张星元：发酵原理60 N PP 进进出出通通节节堵堵 工业发酵的工业发酵的“五字策略五字策略” 2021-7-1张星元：发酵原理61 高产菌种的代谢特征：不同来源的碳高产菌种的代谢特征：不同来源的碳 架物质畅通地架物质畅通地“注入注入”载流路径，高速生载流路

51、径，高速生 成并顺利释出目的产物，如下图。成并顺利释出目的产物，如下图。 2021-7-1张星元：发酵原理62 进进：在育种和发酵控制方面都要促进细胞：在育种和发酵控制方面都要促进细胞 对营养物质的吸收。在发酵过程中，一般对营养物质的吸收。在发酵过程中，一般 都希望菌体能迅速达到一定的浓度，因此，都希望菌体能迅速达到一定的浓度，因此， 就必需选用生长旺盛的菌株，这类菌株吸就必需选用生长旺盛的菌株，这类菌株吸 收营养物质的能力往往也较强。同时要选收营养物质的能力往往也较强。同时要选 择适当的容易吸收的培养基，和适宜的培择适当的容易吸收的培养基，和适宜的培 养条件，以促进微生物的生长。为了消除养条

52、件，以促进微生物的生长。为了消除 底物在培养过程中的抑制作用，有的还采底物在培养过程中的抑制作用，有的还采 用流加的培养方法。为了促进微生物的生用流加的培养方法。为了促进微生物的生 长和支持目的产物的合成，还要从代谢生长和支持目的产物的合成，还要从代谢生 理学的角度优化流加条件。理学的角度优化流加条件。 2021-7-1张星元：发酵原理63 通通：在育种方面，解除对途径中某些酶的：在育种方面，解除对途径中某些酶的 反馈调节；在发酵控制方面，诱导这些酶反馈调节；在发酵控制方面，诱导这些酶 的合成或激活这些酶，从而使来自各代谢的合成或激活这些酶，从而使来自各代谢 物流（除碳架物流外还包括其他支持生

53、物物流（除碳架物流外还包括其他支持生物 合成的物流）能够畅通地注入载流路径，合成的物流）能够畅通地注入载流路径， 汇入代谢主流，流向目的产物。特别是当汇入代谢主流，流向目的产物。特别是当 发酵进入目的产物合成阶段后，必需确保发酵进入目的产物合成阶段后，必需确保 载流路径畅通，代谢主流优势明显。载流路径畅通，代谢主流优势明显。 2021-7-1张星元：发酵原理64 这些酶包括用于目的产物自身合成的酶这些酶包括用于目的产物自身合成的酶 （如下图中酶）和用于目的产物的前（如下图中酶）和用于目的产物的前 体合成的酶（体合成的酶（ 如下图中酶和，用于前体如下图中酶和，用于前体C 的合成，酶，用于前体的合

54、成，酶，用于前体D的合成）。的合成）。 2021-7-1张星元：发酵原理65 例如在谷氨酸的发酵过程中，作为例如在谷氨酸的发酵过程中，作为 谷氨酸合成原料的谷氨酸合成原料的 NH4+ 的缺乏，的缺乏， 就可就可 能使谷氨酸合成途径的中断，导致谷氨能使谷氨酸合成途径的中断，导致谷氨 酸产量下降，大量酸产量下降，大量-酮戊二酸积累。当酮戊二酸积累。当 然，合成途径中的任何一个限制因子，然，合成途径中的任何一个限制因子， 都可能产生类似的情况。因此，在发酵都可能产生类似的情况。因此，在发酵 过程中应尽可能的使通向载流路径的代过程中应尽可能的使通向载流路径的代 谢途径畅通无阻，使不同的营养物质能谢途径

55、畅通无阻，使不同的营养物质能 顺利地注入代谢主流，最终流向目的产顺利地注入代谢主流，最终流向目的产 物。物。 2021-7-1张星元：发酵原理66 节节：采用育种或发酵控制手段，节制载流路：采用育种或发酵控制手段，节制载流路 径上与目的产物的形成无关或关系不大的代径上与目的产物的形成无关或关系不大的代 谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产谢支流，使碳架物质相对集中地流向目的产 物。这里所谓的物。这里所谓的 “ 节制节制 ” 是指封闭或削弱是指封闭或削弱 以目的产物合成途径的起始底物（如下图中以目的产物合成途径的起始底物（如下图中 的的A）或各中间产物（如下图中的或各中间产物（如下图中的B、C

56、 和和D） 为起始底物的分支途径（为起始底物的分支途径（ 即下图中通向即下图中通向 K， G，I，J 的途径）。的途径）。 2021-7-1张星元：发酵原理67 2021-7-1张星元：发酵原理68 经过千千万万年的物竞天择，微生物经过千千万万年的物竞天择，微生物 细胞已经成为自我保障的经济体系。细胞细胞已经成为自我保障的经济体系。细胞 严格的调节机制不允许代谢中间产物的过严格的调节机制不允许代谢中间产物的过 量合成，要想实现目的产物的过量合成，量合成，要想实现目的产物的过量合成， 就必需对其代谢进行导向（包括遗传根据就必需对其代谢进行导向（包括遗传根据 和培养条件的导向），迫使代谢朝着过量和

57、培养条件的导向），迫使代谢朝着过量 合成目的产物方向进行。因此，不是目的合成目的产物方向进行。因此，不是目的 产物生产所必需的途径，应做到不同程度产物生产所必需的途径，应做到不同程度 的关闭，也就是的关闭，也就是“节节”。 2021-7-1张星元：发酵原理69 堵堵：采用育种或发酵控制手段堵塞或削弱：采用育种或发酵控制手段堵塞或削弱 目的产物进一步代谢的途径（如上图中目的产物进一步代谢的途径（如上图中 F 以后的途径），包括目的产物参与的分解以后的途径），包括目的产物参与的分解 代谢和合成代谢。如果菌株生产目的产物代谢和合成代谢。如果菌株生产目的产物 的途径畅通，但同时目的产物进一步代谢的途径

58、畅通，但同时目的产物进一步代谢 （包括目的产物参与的分解代谢和合成代（包括目的产物参与的分解代谢和合成代 谢）的途径也畅通，或者随着生产的进行谢）的途径也畅通，或者随着生产的进行 目的产物进一步的代谢加强，都会最终影目的产物进一步的代谢加强，都会最终影 响目的产物的溢出代谢，降低工业发酵的响目的产物的溢出代谢，降低工业发酵的 效益。效益。 2021-7-1张星元：发酵原理70 为了消除这种影响，就必须降低目的为了消除这种影响，就必须降低目的 产物进一步代谢的酶的酶活力或酶量，以产物进一步代谢的酶的酶活力或酶量，以 消除或削弱目的产物进一步的代谢。若不消除或削弱目的产物进一步的代谢。若不 能对菌

59、株进行有效的改造，也可以通过工能对菌株进行有效的改造，也可以通过工 艺手段来达到堵的目的。例如，采用及时艺手段来达到堵的目的。例如，采用及时 将目的产物从发酵液的分离出来的办法，将目的产物从发酵液的分离出来的办法， 也可以间接地消除或削弱胞内目的产物的也可以间接地消除或削弱胞内目的产物的 进一步代谢，甚至能拉动溢出代谢。进一步代谢，甚至能拉动溢出代谢。 2021-7-1张星元：发酵原理71 出出：促进目的产物向胞外空间分泌。根据微：促进目的产物向胞外空间分泌。根据微 生物细胞经济学原理（节约原理、适应原理、生物细胞经济学原理（节约原理、适应原理、 生命保障原理），如果细胞内某代谢中间产生命保障

60、原理），如果细胞内某代谢中间产 物浓度超过其阈值，必将受到细胞内相关代物浓度超过其阈值，必将受到细胞内相关代 谢调节机制的干预。胞内目的产物的浓度过谢调节机制的干预。胞内目的产物的浓度过 高，就会对合成目的产物的代谢过程施加负高，就会对合成目的产物的代谢过程施加负 反馈调节，迫使其回到正常浓度。因此，及反馈调节，迫使其回到正常浓度。因此，及 时将目的产物转移到细胞外，无论从化学平时将目的产物转移到细胞外，无论从化学平 衡的角度，还是从生物学信息反馈的角度，衡的角度，还是从生物学信息反馈的角度， 都将有利于载流路径上代谢主流的流动。都将有利于载流路径上代谢主流的流动。 2021-7-1张星元：发