食品分析第二章-光谱及色谱分析

1、第二章第二章 光谱及色谱分析光谱及色谱分析 一、光谱产生的原理一、光谱产生的原理 室温下物质主要处在它们的电子能级和振动能级的室温下物质主要处在它们的电子能级和振动能级的 基态。当不同能量的电磁波照射物质时，物质的分子或原基态。当不同能量的电磁波照射物质时，物质的分子或原 子吸收一定波长的电磁波后从基态跃迁到激发态，然后这子吸收一定波长的电磁波后从基态跃迁到激发态，然后这 些些激发态通过在各个方向上以相同的或较低的频率发射出激发态通过在各个方向上以相同的或较低的频率发射出 所吸收的辐射所吸收的辐射，或者，或者通过通过“无辐射无辐射”弛豫释放能量弛豫释放能量，一般，一般 在在10-8s左右回到基

2、态。左右回到基态。 二、紫外二、紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱 1、概述、概述 紫外紫外-可见吸收光谱（可见吸收光谱（ultraviolet-visible absorption spectra)是分子吸收紫外是分子吸收紫外-可见光区可见光区10-800nm的电磁波而产的电磁波而产 生的吸收光谱，简称紫外光谱（生的吸收光谱，简称紫外光谱（UV）。）。 其中其中10-190nm为原紫外区为原紫外区（真空紫外区），（真空紫外区），190- 400nm为近紫外区为近紫外区（石英紫外区），（石英紫外区），400-800nm可见光区可见光区。 分子中分子中价电子价电子经紫外或可见光照射时，电子从低能级经

3、紫外或可见光照射时，电子从低能级 跃迁到高能级，此时电子就吸收了相应波长的光，这样产跃迁到高能级，此时电子就吸收了相应波长的光，这样产 生的生的吸收光谱吸收光谱叫紫外光谱。叫紫外光谱。 可以跃迁的电子有：可以跃迁的电子有： 电子电子, 电子和电子和n电子。跃电子。跃 迁的类型有：迁的类型有： *, n *, *, n *。 *，对应，对应10-190nm的远紫外区；的远紫外区； n *, *, n *，对应，对应190nm以上的近紫外区和可见光以上的近紫外区和可见光 区；区； 常见的紫外谱图波长范围为常见的紫外谱图波长范围为200-400nm。 既然一般的紫外光谱是指近紫外区，即既然一般的紫外

4、光谱是指近紫外区，即 200-400nm， 那么就只能观察那么就只能观察 *和和 n *跃迁。也就是说跃迁。也就是说紫紫 外光谱只适用于分析分子中具有不饱和结构的化合物。外光谱只适用于分析分子中具有不饱和结构的化合物。 紫外紫外-可见吸收光谱的特点可见吸收光谱的特点 测量灵敏度和准确度高；测量灵敏度和准确度高； 应用范围广；应用范围广； 对多种金属元素和非金属元素及其化合物对多种金属元素和非金属元素及其化合物 都能进行测定都能进行测定 能定性或定量测定大部分有机化合物；能定性或定量测定大部分有机化合物； 仪器价格便宜；仪器价格便宜； 操作简单快速。操作简单快速。 2、基本原理、基本原理 通过测

5、定吸收池中溶液对某个波长范围通过测定吸收池中溶液对某个波长范围 单色光单色光的吸收强度，可以获得紫外的吸收强度，可以获得紫外-可见吸可见吸 收光谱。实际的波长范围是收光谱。实际的波长范围是190-400nm(紫紫 外区外区)和和400-780nm(可见光区可见光区)。 透射比（透光率）透射比（透光率）T： 溶质 溶液 I I I I T 0 以透光率对波长的函数作图，即得到所需样品的光以透光率对波长的函数作图，即得到所需样品的光 谱图，可以通过透射率进行定量和定性分析，但透谱图，可以通过透射率进行定量和定性分析，但透 光率并不直接正比于样品溶液中有吸收的待测组分光率并不直接正比于样品溶液中有吸

6、收的待测组分 浓度，而是吸收带的强度（吸光度）正比于吸收池浓度，而是吸收带的强度（吸光度）正比于吸收池 中光照部分吸光质点的数目。中光照部分吸光质点的数目。 吸光度吸光度A： Lamder-Beer定律：定律： A正比于光正比于光吸收池厚度吸收池厚度b(cm)、溶液浓度、溶液浓度 c(mol/L)以及摩尔吸光系数以及摩尔吸光系数L/(molcm)。 对于给定的体系，在低浓度对于给定的体系，在低浓度(c0.1mol/L)时，时， A和样品浓度之间存在线性关系。但在高浓度时，和样品浓度之间存在线性关系。但在高浓度时， 由于样品内分子间距离变小，其相互作用增强并由于样品内分子间距离变小，其相互作用增

7、强并 影响电荷分布，这种分子间的微扰明显地影响待影响电荷分布，这种分子间的微扰明显地影响待 测组分捕获特定波长的能力，测组分捕获特定波长的能力， 可能发生变化，可能发生变化， 使之偏离线性工作曲线。使之偏离线性工作曲线。 I I T 0 lglgA bcA 3、仪器、仪器 （1）光度计）光度计 单道系统：仅用一个检测器，单色器缓慢扫描通过光谱时，单道系统：仅用一个检测器，单色器缓慢扫描通过光谱时， 它依次测量每一个分辨单元的强度。高分辨率时对应较窄它依次测量每一个分辨单元的强度。高分辨率时对应较窄 的狭缝，的狭缝，200-400nm用氘灯用氘灯，400nm以上用钨灯以上用钨灯。 多道系统：阵列

8、检测器（多道系统：阵列检测器（n个硅二极管），所有强度的光谱个硅二极管），所有强度的光谱 被同时测量，测量时间减小至被同时测量，测量时间减小至1/n，信噪比增加，信噪比增加 倍。倍。 不需要窄的狭缝，不需要窄的狭缝，200-800nm均使用氘灯。均使用氘灯。 n （2）滤光片）滤光片 在光度计中，用一个或在光度计中，用一个或 多个干涉滤光片代替贵重的多个干涉滤光片代替贵重的 单色器元件，使得系统适合单色器元件，使得系统适合 于在指定波长下的特定应用。于在指定波长下的特定应用。 图图2-4是典型的光纤光度是典型的光纤光度 计的实验装置，适用于可见计的实验装置，适用于可见 光范围，不需要将样品装入

9、光范围，不需要将样品装入 吸收池再放入光度计，而是吸收池再放入光度计，而是 将光度计放在样品中，进行将光度计放在样品中，进行 原位样品测量。原位样品测量。 4、操作条件、操作条件 （1）样品制备）样品制备 样品需要有代表性样品需要有代表性 为了防止由于浑浊溶液的光散射所产生的为了防止由于浑浊溶液的光散射所产生的 “吸收吸收”，有必要先对溶液进行澄清处理。，有必要先对溶液进行澄清处理。 参比池溶剂的选择参比池溶剂的选择 （2）分析操作）分析操作 确定比色池确定比色池 （3）测定波长的选择）测定波长的选择 最好选择在待测组最好选择在待测组 分的最大吸收波长处测分的最大吸收波长处测 定，因为此处吸光

10、度值定，因为此处吸光度值 不随波长变化，且灵敏不随波长变化，且灵敏 度高，更符合度高，更符合Lamder- Beer定律。定律。 5、标准曲线、标准曲线 根据标准曲线可确定待测组分的浓度与吸光根据标准曲线可确定待测组分的浓度与吸光 度之间的关系，标准溶液最好采用与待测样品相度之间的关系，标准溶液最好采用与待测样品相 同的试剂同时制备。同的试剂同时制备。 6、仪器误差对吸光度测定精密度的影响、仪器误差对吸光度测定精密度的影响 （1）仪器误差：仪器噪声。）仪器误差：仪器噪声。 （2）在极高或极低的透光率范围内测定的误）在极高或极低的透光率范围内测定的误 差较大，通常选用中间值的透光率测定。差较大，

11、通常选用中间值的透光率测定。 （3）一般分光光度计上定量测定的最佳吸光一般分光光度计上定量测定的最佳吸光 度范围为度范围为0.2-0.8（或透光率（或透光率15%-65%）。）。 通常待测样品的吸光度应在小于通常待测样品的吸光度应在小于1.0取值。取值。 三、荧光光谱三、荧光光谱 1、概述、概述 当紫外线照射到某些物质的时候，这些当紫外线照射到某些物质的时候，这些 物质会发射出各种颜色和不同强度的可见物质会发射出各种颜色和不同强度的可见 光，而当紫外线停止照射时，所发射的光光，而当紫外线停止照射时，所发射的光 线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。 2、荧

12、光光谱分析、荧光光谱分析 荧光光谱法的灵敏度比一般的吸收光谱法高荧光光谱法的灵敏度比一般的吸收光谱法高1-3个个 数量级，所测得的信号是待测组分由数量级，所测得的信号是待测组分由激发电子弛激发电子弛 豫到其对应的基态豫到其对应的基态时时发射发射的电磁辐射。的电磁辐射。 激发和钝化过程是同时发生的。对每个单一分子激发和钝化过程是同时发生的。对每个单一分子 体系，都有一个供样品激发的最佳波长和另一个体系，都有一个供样品激发的最佳波长和另一个 用于检测荧光发射的更长的波长。用于激发和发用于检测荧光发射的更长的波长。用于激发和发 射的波长取决于待测体系的结构和化学性质。射的波长取决于待测体系的结构和化

13、学性质。 荧光仪和荧光分光光度计中包含两个波长选择器：荧光仪和荧光分光光度计中包含两个波长选择器： 一个用于一个用于激发光束激发光束；另一个用于；另一个用于发射光束发射光束。 当激发态的物质与气体分子碰撞时可产生当激发态的物质与气体分子碰撞时可产生荧光猝荧光猝 灭现象灭现象。 荧光束辐射能荧光束辐射能(PF): 其中：其中：PF:荧光比色池产生的光束的辐射能；荧光比色池产生的光束的辐射能； ：荧光量子效率或量子产率（等于荧光物：荧光量子效率或量子产率（等于荧光物 质吸收辐射后所发射的荧光的光子总量与吸收激质吸收辐射后所发射的荧光的光子总量与吸收激 发光的光子总数的比值）发光的光子总数的比值）；

14、 P0：入射光束的辐射能；：入射光束的辐射能； P：投射出的光束的辐射能。：投射出的光束的辐射能。 量子产率量子产率对任何一个给定系统都是定值。对任何一个给定系统都是定值。 )P(P 0 P F 其中：其中：摩尔吸光系数，摩尔吸光系数，L/(molcm); b光程，光程，cm; c待测组分的浓度，待测组分的浓度，mol/L。 当待测组分的浓度很低时，当待测组分的浓度很低时，bc8k的的 去离子水，石墨炉法对水的要求更高，需电阻率去离子水，石墨炉法对水的要求更高，需电阻率 800k的去离子水。的去离子水。 3、原子吸收分光光度计在食品分析中、原子吸收分光光度计在食品分析中 的应用的应用 （二）原

15、子发射光谱（二）原子发射光谱 1、概述、概述 1）原理）原理 AES是原子的外层电子受到外界能量激发后，由基态是原子的外层电子受到外界能量激发后，由基态 过渡到不同的激发态，处于激发态的电子不稳定，当其回过渡到不同的激发态，处于激发态的电子不稳定，当其回 到基态时，以光能的形式释放出多余的能量，因此就得到到基态时，以光能的形式释放出多余的能量，因此就得到 一条波长与辐射能量相对应的发射谱线。一条波长与辐射能量相对应的发射谱线。 由激发态直接回到基态所发射的谱线称为共振线，由由激发态直接回到基态所发射的谱线称为共振线，由 第一激发态回到基态发射的谱线称为第一共振线，第一共第一激发态回到基态发射的

16、谱线称为第一共振线，第一共 振线通常是最强的谱线，即最敏感的谱线，故其是振线通常是最强的谱线，即最敏感的谱线，故其是AES分分 析中最常用的分析线。析中最常用的分析线。 处于高能量激发态的电子可不直接回到基处于高能量激发态的电子可不直接回到基 态，而是回到为光谱线选择定则所允许的态，而是回到为光谱线选择定则所允许的 较低能量状态，从而发射出各种波长的谱较低能量状态，从而发射出各种波长的谱 线。线。 谱线强度与待测元素的含量有关，故谱线谱线强度与待测元素的含量有关，故谱线 强度是进行定量分析的依据。强度是进行定量分析的依据。 Ni:单位体积内处于高能级单位体积内处于高能级Ei的原子数；的原子数；

17、 Aij:Ei、Ej两能级的跃迁概率；两能级的跃迁概率； h:普朗克常量；普朗克常量； Vij:发射谱线的频率。发射谱线的频率。 Ni和和N0遵守波尔兹曼分布定律，将波尔兹曼分布式代入上式遵守波尔兹曼分布定律，将波尔兹曼分布式代入上式 中得：中得： 其中其中gi、g0：激发态、基态统计权重；：激发态、基态统计权重； k:波尔兹曼产量。波尔兹曼产量。 ijijiji hvANI )/( 00 )/(I kTE ijijiji i eNhvAgg 元素谱线的相对强度元素谱线的相对强度I1/I2与改元素在样品中的浓度与改元素在样品中的浓度c的的 关系如下所示：关系如下所示： I1/I2=acb即即l

18、g(I1/I2)=blgc+lga 其中其中a与样品的蒸发、激发过程及样品的组分等有关的参数；与样品的蒸发、激发过程及样品的组分等有关的参数； b与谱线的自吸收有关的参数。与谱线的自吸收有关的参数。 浓度很高时，浓度很高时，b趋于趋于0，此时谱线强度与样品浓度无关；，此时谱线强度与样品浓度无关； 一般浓度时，一般浓度时，I1/I2与与c的关系较复杂，的关系较复杂，b不是常数，但不是常数，但b1; 只有当待测元素浓度较低时，无自吸收存在，只有当待测元素浓度较低时，无自吸收存在，b=1，谱线强度，谱线强度 与浓度成正比。与浓度成正比。 2）原子发射光谱仪）原子发射光谱仪 原子发射光谱仪由激发光源、

19、分光系统、检原子发射光谱仪由激发光源、分光系统、检 测系统三部分组成。测系统三部分组成。 激发光源激发光源 激发光源提供能量使试样蒸发、激发光源提供能量使试样蒸发、 解离、原子化和激发跃迁发射谱线。解离、原子化和激发跃迁发射谱线。 激发能量可由热、光、电、无线电波激发能量可由热、光、电、无线电波 （电感耦合等离子体（电感耦合等离子体ICP）等产生。）等产生。 ICP由高频发生器、等离子炬管由高频发生器、等离子炬管 和雾化器组成。和雾化器组成。 分光系统分光系统 将气态原子激发产生的发射光谱信号按波长将气态原子激发产生的发射光谱信号按波长 的大小顺序分离展开成线光谱，分光元件可以是的大小顺序分离

20、展开成线光谱，分光元件可以是 棱镜或光栅。棱镜或光栅。 检测系统检测系统 光电倍增管光电倍增管(PMT)代替光谱板作为检测器。代替光谱板作为检测器。 3）AES的特点的特点 可以同时进行多元素的测定，并优于可以同时进行多元素的测定，并优于AAS，且分，且分 析速度快；析速度快； 分析的选择性高；分析的选择性高； ICP-AES可分析难以原子化的难熔化合物，优于可分析难以原子化的难熔化合物，优于 火焰火焰AAS； ICP-AES的分析浓度范围宽；的分析浓度范围宽； 灵敏度高；灵敏度高； 消耗试剂少；消耗试剂少； AES无法测定常见的非金属元素无法测定常见的非金属元素O、N、卤原子，、卤原子， 且

21、且ICP-AES仪器昂贵，也不能测定固体样品。仪器昂贵，也不能测定固体样品。 2、AES分析法分析法 1）定性分析）定性分析 铁光谱比较法铁光谱比较法 2）定量分析）定量分析 3）样品处理）样品处理 七、高效液相色谱七、高效液相色谱 1、概述、概述 2、高效液相色谱仪器的组成、高效液相色谱仪器的组成 五个主要部件：输液泵、进样器、色谱柱、五个主要部件：输液泵、进样器、色谱柱、 检测器和记录仪检测器和记录仪/数据系统。数据系统。 （1）输液泵）输液泵 输液泵的作用是输送流动相（流速一般为输液泵的作用是输送流动相（流速一般为0.5-0.5- 2.0mL/min2.0mL/min），主要使用恒流泵，

22、往复式柱塞泵使），主要使用恒流泵，往复式柱塞泵使 用较多。用较多。 单体泵单体泵等度等度HPLCHPLC洗脱洗脱 梯度洗脱梯度洗脱在一个色谱分析周期中，将两种或在一个色谱分析周期中，将两种或 两种以上的不同极性的溶剂，随时间按一定程序两种以上的不同极性的溶剂，随时间按一定程序 改变比例，以达到连续改变流动相极性的目的。改变比例，以达到连续改变流动相极性的目的。 低压梯度洗脱低压梯度洗脱 高压梯度洗脱高压梯度洗脱 （2）进样器）进样器 （3）色谱柱）色谱柱 色谱柱是色谱分析的核心。色谱柱是色谱分析的核心。HPLC分析对色谱柱的要分析对色谱柱的要 求是性能稳定、柱效高、柱容量大、分析速度快、适应溶

23、求是性能稳定、柱效高、柱容量大、分析速度快、适应溶 剂范围广。剂范围广。 柱组件柱组件 HPLC柱填充料柱填充料 要求：形成色谱床，参与或不参与实际的分离过程、要求：形成色谱床，参与或不参与实际的分离过程、 颗粒直径范围窄、良好的化学稳定性、有足够的机械强度、颗粒直径范围窄、良好的化学稳定性、有足够的机械强度、 能耐受在填充和使用过程中的高压。能耐受在填充和使用过程中的高压。 排阻色谱：分析物与填充料之间不发生其他相互作用。排阻色谱：分析物与填充料之间不发生其他相互作用。 吸附色谱：填充料同时起到了载体和固定相的作用。吸附色谱：填充料同时起到了载体和固定相的作用。 （4）检测器）检测器 将洗脱

24、液中的组分浓度（或质量）变化转换成将洗脱液中的组分浓度（或质量）变化转换成 电信号。电信号。 固定波长型固定波长型 紫外紫外-可见光检测器可见光检测器 可变波长型可变波长型 二极管阵列检测器（）二极管阵列检测器（） 荧光检测器灵敏度高荧光检测器灵敏度高 测定色谱柱流出液的折光指数的变化。测定色谱柱流出液的折光指数的变化。 折光指数检测器折光指数检测器 通用检测器，灵敏度低通用检测器，灵敏度低 对环境温度敏感，且不能采用梯度洗脱对环境温度敏感，且不能采用梯度洗脱 （）记录仪和数据处理系统（）记录仪和数据处理系统 电子积分仪自动判断每个色谱峰的开电子积分仪自动判断每个色谱峰的开 始、最高和结束时间

25、，给出保留时间、峰始、最高和结束时间，给出保留时间、峰 高、峰面积。高、峰面积。 3、高效液相色谱中的分离模式、高效液相色谱中的分离模式 （1）正相色谱）正相色谱 固定相是极性吸附剂；流动相是由非极性溶剂，可加固定相是极性吸附剂；流动相是由非极性溶剂，可加 入一些极性稍强的改性剂，以增加溶剂的洗脱能力和选择入一些极性稍强的改性剂，以增加溶剂的洗脱能力和选择 性。性。 （2）反相色谱）反相色谱 非极性固定相和极性流动相。非极性固定相和极性流动相。 辛基柱（辛基柱（C8） 化学键合相化学键合相 十八烷基柱（十八烷基柱（C18） 分析物由于和非极性固定相发生疏水相互作用而被分析物由于和非极性固定相发

26、生疏水相互作用而被 保留，其洗脱顺序是极性强的化合物先出峰，极性弱的后保留，其洗脱顺序是极性强的化合物先出峰，极性弱的后 出峰。出峰。 （3）离子交换色谱）离子交换色谱 流动相通常是水溶性缓冲液，通过调节流动流动相通常是水溶性缓冲液，通过调节流动 相的离子强度和（或）相的离子强度和（或）pH，就可控制分析物的保，就可控制分析物的保 留时间，逐步增加离子强度是常用的梯度洗脱方留时间，逐步增加离子强度是常用的梯度洗脱方 法。法。 （4）空间排阻色谱）空间排阻色谱 仅由分析物分子大小的差异来实现。仅由分析物分子大小的差异来实现。 亲水性排阻色谱：凝胶过滤色谱亲水性排阻色谱：凝胶过滤色谱 疏水性排阻色

27、谱：凝胶渗透色谱疏水性排阻色谱：凝胶渗透色谱 4、高效液相色谱分析方法的建立、高效液相色谱分析方法的建立 （1）色谱分析模式的选择）色谱分析模式的选择 （2）色谱分析条件的选择和优化）色谱分析条件的选择和优化 色谱柱色谱柱 仪器条件的选择仪器条件的选择 检测器检测器 其他其他 流动相流动相 色谱分析参数的优化色谱分析参数的优化 柱温柱温 检测波长检测波长 样品处理步骤的选择样品处理步骤的选择 色谱分析方法的评价色谱分析方法的评价 4、高效液相色谱法在食品分析中的应用、高效液相色谱法在食品分析中的应用 （1）糖类的分析）糖类的分析 （2）脂肪酸的分析）脂肪酸的分析 （3）氨基酸、肽和蛋白质的分析

28、）氨基酸、肽和蛋白质的分析 （4）有机酸的分析）有机酸的分析 （5）维生素的分析）维生素的分析 （6）食品添加剂的分析）食品添加剂的分析 （7）霉菌毒素的分析）霉菌毒素的分析 （8）农药残留的分析）农药残留的分析 （9）兽药残留的分析）兽药残留的分析 八、气相色谱八、气相色谱 1、概述、概述 2、气相色谱仪、气相色谱仪 气相色谱仪由气路、进样系统、色谱柱系统、气相色谱仪由气路、进样系统、色谱柱系统、 检测系统、控制和数据处理系统组成。检测系统、控制和数据处理系统组成。 （1）气路系统 气相色谱中的流动相又称载气，通常使用气相色谱中的流动相又称载气，通常使用 的载气有氢气、氦气和氮气（高纯度）；

29、的载气有氢气、氦气和氮气（高纯度）； 氢火焰离子检测器：氢气和空气；氢火焰离子检测器：氢气和空气； 气体经过调压阀减压，通过铜管或不锈钢气体经过调压阀减压，通过铜管或不锈钢 管输送，气路中配有在线捕集器，以去除管输送，气路中配有在线捕集器，以去除 气体中的微量的杂质和水分。气体中的微量的杂质和水分。 （2）进样系统）进样系统 进样口进样口 汽化室，使溶剂和分析物瞬间蒸发气化，进样口的温汽化室，使溶剂和分析物瞬间蒸发气化，进样口的温 度应接近或等于分析物的沸点温度。度应接近或等于分析物的沸点温度。 进样器进样器 气密型的微量注射器进样，手动和自动两种。气密型的微量注射器进样，手动和自动两种。 （

30、3）色谱柱系统）色谱柱系统 （1）柱温箱）柱温箱 控制色谱柱的温度，控温精度达士控制色谱柱的温度，控温精度达士0.1 （2）色谱柱和固定相）色谱柱和固定相 填充柱填充柱 采用不锈钢或玻璃制造，填充小颗粒固定相，采用不锈钢或玻璃制造，填充小颗粒固定相， 固定相由载体和涂渍在表面的固定液组成。固定相由载体和涂渍在表面的固定液组成。 毛细管柱毛细管柱 中空的熔融石英玻璃管，管壁非常薄，十分中空的熔融石英玻璃管，管壁非常薄，十分 容易弯曲，柱外壁涂有高聚物材料。容易弯曲，柱外壁涂有高聚物材料。 固定相固定相 气气-固色谱：固体固定相有分子筛、多孔氧化铝或人工合固色谱：固体固定相有分子筛、多孔氧化铝或人工合 成的高分子小球，主要用于分离永久性气体和低相对分子成的高分子小球，主要用于分离永久性气体和低相对分子 量的有机化合物。量的有机化合物。 气气-液色谱：固定液选择规律：极性固定液分离极性化合液色谱：固定液选择规律：极性固定液分离极性化合 物，非极性固定液分离非极性化合物，含苯基的固定液分物，非极性固定液分离非极性化合物，含苯基的固定液分 离芳香族化合物。离芳香族化合物。 （4）检测器）检测器 氢火焰离子检测器氢火焰离子检测器