第10章 蛋白质的分离与测定技术

1、(二二)、蛋白质分离提取的一般步骤、蛋白质分离提取的一般步骤 (1)(1)材料的材料的选择选择和和预处理预处理； (2)(2)破碎生物组织破碎生物组织( (原料是细胞外分泌物时无需此步原料是细胞外分泌物时无需此步) )，并用，并用 适当的缓冲液适当的缓冲液将将蛋白质提取蛋白质提取出来；出来； 用用离心法离心法将细胞的亚细胞颗粒及细胞碎片与溶液分开；将细胞的亚细胞颗粒及细胞碎片与溶液分开； (4)(4)应用应用盐析法或有机溶剂法盐析法或有机溶剂法将有关蛋白质组分沉淀下来；将有关蛋白质组分沉淀下来； (5)(5)进一步应用进一步应用层析法或电泳法层析法或电泳法使各种蛋白质分开；使各种蛋白质分开；

2、(6) (6) 结晶或制成冻干粉。结晶或制成冻干粉。 第十章第十章 蛋白质的分离与测定技术蛋白质的分离与测定技术 蛋白质分离纯化方法：蛋白质分离纯化方法： 溶解度不同：如盐析、有机溶剂分级沉淀法溶解度不同：如盐析、有机溶剂分级沉淀法 分配系数不同：如分配层析法分配系数不同：如分配层析法 吸附性不同：如吸附层析法吸附性不同：如吸附层析法 在电场中运动速度不同：如电泳法在电场中运动速度不同：如电泳法 沉降系数或密度不同：如离心法沉降系数或密度不同：如离心法 分子量不同：如凝胶过滤层析法、分子量不同：如凝胶过滤层析法、SDSSDSPAGEPAGE 法法 生物学特性不同：如亲和层析法生物学特性不同：如

3、亲和层析法 以上提取纯化方法的适当结合，在多数情况以上提取纯化方法的适当结合，在多数情况 下，足以获得纯化的蛋白质。下，足以获得纯化的蛋白质。 （三）提取后的进一步纯化（三）提取后的进一步纯化 1 1、选择性变性沉淀除去杂质；、选择性变性沉淀除去杂质； 2 2、分段盐析及有机溶剂沉淀、分段盐析及有机溶剂沉淀 3 3、吸附色谱法、吸附色谱法 4 4、多糖基离子交换色谱法；、多糖基离子交换色谱法； 5 5、凝胶过滤分离；、凝胶过滤分离； 6 6、亲和色谱法、亲和色谱法 7 7、制备超离心分离；、制备超离心分离； 8 8、其它分离纯化方法以及、其它分离纯化方法以及 后期结晶后期结晶 三、蛋白质的浓缩

4、和脱盐三、蛋白质的浓缩和脱盐 （一）、蛋白质的浓缩（一）、蛋白质的浓缩 1 1、沉淀法：、沉淀法：中性盐或有机溶剂。中性盐或有机溶剂。 2 2、吸附法、吸附法：如干葡聚糖凝胶：如干葡聚糖凝胶G G2525（或吸水（或吸水 棒）。棒）。 3 3、超滤法、超滤法： 4 4、减压蒸馏法、减压蒸馏法： 5 5、冷冻干燥法、冷冻干燥法： 6 6、离子交换层析法、离子交换层析法 7 7、有机聚合物干燥法、有机聚合物干燥法 聚乙二醇等聚合物进聚乙二醇等聚合物进 行干燥。行干燥。 （二）、蛋白质的脱盐（二）、蛋白质的脱盐 常用的脱盐方法：常用的脱盐方法： 透析法透析法 超滤法超滤法 分子筛层析法分子筛层析法

5、第三节第三节 蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定 一、双缩脲法一、双缩脲法 1 1、常量双缩脲法：、常量双缩脲法： 早期阶段的测定非常早期阶段的测定非常 有用。有用。 双缩脲法的原理是铜双缩脲法的原理是铜 离子与蛋白质的肽键离子与蛋白质的肽键 结合，形成结合，形成紫红色络紫红色络 合物合物，此物质在，此物质在 540nm540nm处有最大吸收，处有最大吸收， 可以比色测定，可以比色测定， 此法常用于此法常用于 0.5mg/mL-10mg/ml0.5mg/mL-10mg/ml蛋蛋 白质溶液的测定。白质溶液的测定。 2、微量双缩脲法、微量双缩脲法： 此法显色原理与双缩脲法相同，在此法显色原理与双缩脲

6、法相同，在 310330nm测定，干扰因素少。且比测定，干扰因素少。且比 540nm测定灵敏测定灵敏10倍以上。倍以上。 因此可选用因此可选用310nm进行比色测定，测进行比色测定，测 定范围为定范围为0.11.0mg/ml； 或用或用330nm测定，测定范围为测定，测定范围为0.2 2.0mg/ml。 二、二、FolinFolin酚试剂法酚试剂法(Lowry(Lowry法法) ) 原理原理: :在碱性条件下，在碱性条件下，蛋白质与蛋白质与碱性铜碱性铜 溶液中的溶液中的铜络合使得肽键伸展，铜络合使得肽键伸展， 暴露出的酪氨酸和色氨酸与磷钼钨酸反暴露出的酪氨酸和色氨酸与磷钼钨酸反 应，产生深蓝色

7、应，产生深蓝色,500nm,500nm处比色。处比色。 三、紫外吸收法测定蛋白质含量三、紫外吸收法测定蛋白质含量 是利用物质在紫外光区（是利用物质在紫外光区（200200400nm400nm） 特有的吸收光谱特有的吸收光谱 1.280nm1.280nm紫外吸收法紫外吸收法 利用蛋白质在利用蛋白质在280nm280nm有吸收峰进行测定有吸收峰进行测定 需同样条件爱下制作标准曲线。需同样条件爱下制作标准曲线。 准确性较差。准确性较差。 2 2280nm280nm和和260nm260nm处的吸收差法处的吸收差法 由于有核酸的干扰，可利用280nm和260nm 处的吸收差求： 蛋白质的浓度（g/L或m

8、g/ml） =(1.45A280nm- 0.74A260nm）稀释倍数 3 3215nm215nm和和225nm225nm的吸收差法的吸收差法 肽键在肽键在230nm230nm以下有强吸收，波长越短，光吸以下有强吸收，波长越短，光吸 收越强收越强. .用用215nm215nm和和225nm225nm光吸收差值与单一波光吸收差值与单一波 长测定相比，可减少非蛋白成分引起的误差。长测定相比，可减少非蛋白成分引起的误差。 蛋白质的质量浓度（蛋白质的质量浓度（g/Lg/L或或mg/mlmg/ml） =0.144(A215nm- 0.74A225nm=0.144(A215nm- 0.74A225nm）

9、四、考马斯亮蓝染色法（四、考马斯亮蓝染色法（BrodfordBrodford法）法） 蛋白质通过范德华键与染料考马斯亮蓝蛋白质通过范德华键与染料考马斯亮蓝GG 250250结合，引起染料最大吸收峰的改变（颜色结合，引起染料最大吸收峰的改变（颜色 由由棕红色变为蓝色棕红色变为蓝色），从），从465nm465nm变为变为595nm595nm处处 的光吸收值增加的光吸收值增加，即可进行定量。，即可进行定量。 五、凯氏定氮法五、凯氏定氮法 被测样品与浓硫酸共热时分解产生被测样品与浓硫酸共热时分解产生氨氨，氨和，氨和 硫酸结合生成硫酸结合生成硫酸铵硫酸铵。硫酸铵在强碱作用下。硫酸铵在强碱作用下 分解产生

10、分解产生氨氨。用水蒸气蒸馏法将氨收集于过。用水蒸气蒸馏法将氨收集于过 量的量的硼酸硼酸中，然后用标准酸溶液中，然后用标准酸溶液滴定滴定。根据。根据 所测得的含氮量，利用蛋白质中氮的含量约所测得的含氮量，利用蛋白质中氮的含量约 为为6.256.25，计算样品的蛋白质含量。，计算样品的蛋白质含量。 第四节第四节 蛋白质的纯度标准蛋白质的纯度标准 一、电泳法一、电泳法 如果样品在凝胶电脉上显示一条区带，说明样品在其荷如果样品在凝胶电脉上显示一条区带，说明样品在其荷 质比方面是均一的。质比方面是均一的。 不同不同pHpH下电泳下电泳，出现一条区带，说明样品的分子量是均一的，出现一条区带，说明样品的分子

11、量是均一的， 因此只适用于含有相同亚基的蛋白质。因此只适用于含有相同亚基的蛋白质。 等电聚焦电泳等电聚焦电泳 如果只出现一条区带，那么足以证明此蛋白如果只出现一条区带，那么足以证明此蛋白 质为均一蛋白质质为均一蛋白质 脲的凝胶电泳脲的凝胶电泳用于鉴定在低离子强度下难溶的蛋白质纯度。用于鉴定在低离子强度下难溶的蛋白质纯度。 双向电泳双向电泳 ：等电聚焦电泳：等电聚焦电泳 ：SDS-PAGE 水平方向反映出蛋白在水平方向反映出蛋白在pI上的差异上的差异; 垂直方向反映出它们在分子量上的差别垂直方向反映出它们在分子量上的差别 二、通过层析性质的检测二、通过层析性质的检测 各分级组分的比活力应当恒定各

12、分级组分的比活力应当恒定，则得到的组，则得到的组 分是均一的。分是均一的。 三、免疫化学法三、免疫化学法 免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳、放射免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳、放射 免疫、酶标免疫分析、发光免疫分析和免疫、酶标免疫分析、发光免疫分析和 Western blottingWestern blotting等。等。 四、蛋白质化学结构分析法四、蛋白质化学结构分析法 纯蛋白质：纯蛋白质：NN末端氨基酸末端氨基酸 总的氨基酸分析总的氨基酸分析 五、超速离心沉降分析法五、超速离心沉降分析法 脂蛋白和膜束缚的蛋白质脂蛋白和膜束缚的蛋白质最好用超速离心法。最好用超速离心法。 在离心管中若出现明

13、显的分界线，或者分部在离心管中若出现明显的分界线，或者分部 取出离心管中的样品，管号对样品浓度作图，取出离心管中的样品，管号对样品浓度作图， 若组分的分布是对称的，则表明样品是均一若组分的分布是对称的，则表明样品是均一 的。的。 六、其它方法六、其它方法 纯蛋白质的纯蛋白质的OD280/OD260OD280/OD260的值应为的值应为1.751.75。 污染蛋白质污染蛋白质生物活力的消失生物活力的消失也是一个间接的也是一个间接的 纯度评价标准。纯度评价标准。 利用利用蛋白质的特殊功能特性蛋白质的特殊功能特性( (如激素、酶、氧如激素、酶、氧 载体等载体等) )检验纯度。检验纯度。 (6) 离心

14、法：离心法：超速离心法超速离心法 蛋白質分子在蛋白質分子在 离离心時，其心時，其 分分 子量、分子密度、組成、形狀子量、分子密度、組成、形狀 等，均会影响其沉降速度。等，均会影响其沉降速度。 沉降系數沉降系數 ：单位离心力场下：单位离心力场下 的沉降速度的沉降速度 其其 单位单位 为为 S S (Svedberg unit)(Svedberg unit)， 不同不同蛋白蛋白 質的沉降質的沉降 系系數不同，可利用超數不同，可利用超 高速离心法，在密度梯度中作高速离心法，在密度梯度中作 分离。分离。 密度梯度的准备密度梯度的准备 (1) (1) 在樣本溶液中直接溶入在樣本溶液中直接溶入 CsClC

15、sCl， 经离经离心心 后自動形成梯度。后自動形成梯度。 (2) (2) 使用梯度制造器，在離心管內預先制使用梯度制造器，在離心管內預先制 好甘油好甘油 或或 蔗糖蔗糖 的梯度，加的梯度，加 样品后离样品后离心。心。 第五节第五节 蛋白质的结晶蛋白质的结晶 一、结晶原理一、结晶原理 当蛋白质溶液达到过饱和状态时会结晶。当蛋白质溶液达到过饱和状态时会结晶。 许多性质相同的粒子在三维空间有规律地排许多性质相同的粒子在三维空间有规律地排 列成格子状固体，称为列成格子状固体，称为晶体晶体。晶体。晶体具有方向具有方向 性性，具有一定对称性具有一定对称性。 晶体内部有规律的结构，决定了晶体的形成晶体内部有

16、规律的结构，决定了晶体的形成 必须是相同的离子或分子，所以能形成晶体必须是相同的离子或分子，所以能形成晶体 的物质是比较纯的的物质是比较纯的。 维持其基本水合状态，处于或接近生理维持其基本水合状态，处于或接近生理pHpH和和 温度。温度。 蛋白质结晶蛋白质结晶即在一定的溶剂条件下，降低分即在一定的溶剂条件下，降低分 散相的溶解度，使溶质处于散相的溶解度，使溶质处于过饱和状态过饱和状态，此，此 时溶质分子通过扩散、旋转、碰撞等运动形时溶质分子通过扩散、旋转、碰撞等运动形 式形成晶核，然后溶质分子再以相互对撞的式形成晶核，然后溶质分子再以相互对撞的 方式有序而反复地堆砌到晶核上。于是晶核方式有序而

17、反复地堆砌到晶核上。于是晶核 长大，晶体形成。长大，晶体形成。 二、结晶条件二、结晶条件 物质能否结晶主要决定于物质能否结晶主要决定于物质的本性物质的本性，但具，但具 有结晶能力的物质进行结晶时还必须具备一有结晶能力的物质进行结晶时还必须具备一 定条件，即定条件，即样品的纯度样品的纯度、溶液的饱和度溶液的饱和度和和溶溶 剂的性质剂的性质等三个主要条件，等三个主要条件， 1 1、蛋白质纯度、蛋白质纯度 2 2、蛋白质浓度、蛋白质浓度 3 3、溶剂的选择、溶剂的选择 4 4、温度、温度 5 5、pHpH值值 6 6、结晶时间、结晶时间 7 7、金属离子和离子强、金属离子和离子强 度度 8 8、晶种

18、、晶种 9 9、搅拌、搅拌 三、结晶方法三、结晶方法 盐析法盐析法 有机溶剂法有机溶剂法 等电点结晶等电点结晶 温差结晶温差结晶 脱盐结晶脱盐结晶 金属离子金属离子 第六节 干 燥 干燥是将潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液干燥是将潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液 体中的水或溶剂除尽的过程。体中的水或溶剂除尽的过程。 一、影响干燥的因素一、影响干燥的因素 ( (一一) )蒸发面积蒸发面积 ( (二二) )干燥速度干燥速度 ( (三）物料所处的状态三）物料所处的状态 ( (四四) )温度温度 ( (五五) )湿度湿度 （六（六) )压力压力 二、常压吸收干燥二、常压吸收干燥 常压干燥是在密闭空间内用干

19、燥剂吸收水或常压干燥是在密闭空间内用干燥剂吸收水或 溶剂。此法的关键是选用合适的干燥剂。溶剂。此法的关键是选用合适的干燥剂。 1 1干燥剂分类干燥剂分类 按照脱水方式可以分为三按照脱水方式可以分为三 类类: : (1)(1)能够与水可逆地结合为水合物。能够与水可逆地结合为水合物。 如无水氯化钙。如无水氯化钙。 (2)(2)能够与水作用生成新的化合物能够与水作用生成新的化合物， 如五氧化二磷、氧化钙等。如五氧化二磷、氧化钙等。 (3)(3)能够吸去微量的水及溶剂能够吸去微量的水及溶剂， 如分子筛如分子筛。 三、冷冻干燥三、冷冻干燥 冷冻干燥冷冻干燥(Lyophilization)(Lyophil

20、ization)，是先，是先 将溶液或混悬液冷冻成固态，然后将溶液或混悬液冷冻成固态，然后 在低温和高真空度下使冰升华，留在低温和高真空度下使冰升华，留 下干物。下干物。 四、真空干燥四、真空干燥 五、喷五、喷 雾雾 干干 燥燥 将料液将料液( (含水含水50%)50%)喷成雾滴分散于热喷成雾滴分散于热 气流中气流中 六、滚筒干燥六、滚筒干燥 将已经蒸发至相当稠度的液体在加将已经蒸发至相当稠度的液体在加 热面展成薄层进行干燥。热面展成薄层进行干燥。 七、红外线干燥 利用红外线辐射作为热源,向湿物料供热。 八、微波干燥 在微波电磁场的作用下,使物料内部的极 性分子产生振动,振动的能量使被干燥物 料发热,从而达到水分汽化除去的目的。 目前微波干燥技术在食品工业中已经应 用。 九、高压静电干燥 利用高压电晕电场对物料进行脱水干燥。 练 习 与 思 考 1 1、蛋白质纯化从原理上分可有哪几种方法？、蛋白质纯化从原理上分可有哪几种方法？ 2 2、蛋白质分离提取的一般步骤及注意事项。、蛋白质分离提取的一般步骤及注意事项。 3 3、举例说明沉淀分离蛋白质的方法。、举例说明沉淀分离蛋白质的方法。 4 4、蛋白质含量测定的方法有哪几种、蛋白质含量测定的方法有哪几种? ?原理如何原理如何? ? 5 5、蛋