植物病原菌真菌毒素研究大学生创新项目申报书

1、附件1：项目编号：大学生创新性实验项目申 报 书项目名称：植物病原菌真菌毒素研究 项目负责人： 杜 晓 所在单位：六盘水师范学院生命科学系联系电话：子信箱：1229963005 申报日期： 2015年3月27日教务处制一、项目申报项 目 名 称植物病原真菌毒素活性除草剂的研究 所在实验室项目组概况负责人姓名性别年龄职称所在单位签名指导教师姓名性别年龄职称所在单位签名学生成员姓名性别学号学习专业签名杜晓女124111111009生物科学谢启雪女1241111110生物科学项目背景及立项意义：近几十年的研究成果表明，植物病原物的致病因子主要有三大类:毒素、酶和激素，其中毒

2、素是研究最多的，且被认为与病程密切相关的一类致病因子。毒素可以分为真菌毒素、病毒编码毒素、线虫毒素、细菌毒素，真菌是最大的一类植物病原物，对其毒素的研究也相对开展得较多。近15年没有新的真菌除草剂商品退出，但此领域的研究仍十分活跃，也取得了一大批研究成果。作为实验对象的紫茎泽兰、三叶鬼针草都是恶性外来入侵种。对许多地区造成了严重的经济和生态损失。由于其生境的复杂，难以用物理方法清除，而化学除草剂又易造成污染，残毒，且耗资巨大。微生物毒素除草剂具有无污染，安全，价格便宜等特点，故对紫茎泽兰、三叶鬼针草病原真菌毒素除草活性物质的深入研究，是十分有意义的。天然产物特殊的化学结构及生物活性不仅有利于人

3、们从天然产物源寻找新的除草作用机制，也可为合成新型除草剂提供新思路，还可为开发研究除草剂新的分子靶标部位提供较快的线索，有利于鉴定除草剂潜在的新作用靶标部位。项目主要内容和拟解决的关键问题：通过查阅相关文献，了解杂草对农作物的危害，同时也了解不同农药对土壤的危害性，并借鉴这些文献中研究内容的优点与总结微生物除草剂的发展前景，在此基础上通过大量的实验研究，以三叶鬼针草、紫茎泽兰为代表，通过对病原菌的分离、纯化、连续培养研制出一种抗杂草的真菌毒素，只对杂草的生长有抑制作用，而对农作物无毒害，对土壤无污染，并且能够大量生产的安全、高效的微生物农药。关键问题:1、材料的选择要具有代表性2、可以借鉴别人

4、的研究方式，但不能死搬硬套3、对杂草的消除，要做到比以往的除草剂更经济、实用、高效、安全4、能够大量的生产项目特色与创新点项目特色：1、资源和成本的约束性 生产每一种产品都要讲求资源的合理利用和成本的节约。本项目的资源面广，成本较低2、目标的明确性 本项目最终的实验结果只产生一种产品，即高效、安全的抗杂草微生物农药3、限时性 本项目自批准后即着手做，在一年之内完成4、项目实施的一次性 本次项目虽是在前人的基础上进行研究，但不是重复别人的实验或研究过程，或方式方法5、项目的唯一性 本项目是唯一的，研制的产品也是唯一的6，真菌毒素具有作用位点和作用方式的多样性的特点，不易引起杂草产生抗耐性，开发成

5、功率高。创新点：1、选择不同被病原菌感染的植物作真菌毒素的提取材料2、用不同代的发酵液去浇灌杂草和农作物的种子与生长旺盛的植株，观察它对不同植物的不同器官的影响，记录数据项目国内外现状：目前已知的微生物源致病毒素约80多种，其中一些已被证明具有除草活性。这些植物毒素侵入寄主杂草，可使杂草感病产生病斑或枯萎，破坏其细胞结构，从而达到防治的目的。从20世纪60年代起，在国外就已经开始研究微生物除草剂，20世纪80年代以来，利用微生物资源开发除草剂开始成为杂草微生物防治研究的热点。目前报道的有除草潜能的微生物类型包括：真菌、细菌、病毒、放线菌和线虫。截至目前已制剂化并登记的商品只有7个。它包括6个真

6、菌制剂：美国3个（devine）、（collegeo）和（dr.biosedge）,加拿大1个（biomal）,荷兰1个（biochon）,中国1个（鲁保一号）；一个细菌制剂：日本的campelyo。（1）茴香霉素与去草酮是第一个导向商品化除草剂的微生物产物，于1972年从链霉菌的培养液中分离获得（向梅梅等，2005）。茴香霉素可使马唐和稗草致病，茴香霉素本身没有商品化，但它为新型的合成除草剂去草酮的开发提供了化学基础。去草酮作为一种拟微生物源除草剂已商品化，主要用于芽前处理防除一年生杂草。双丙氨酰膦是第一个直接开发成商品除草剂的微生物毒素，20世纪80年代初由日本明治制果公司开发，常用于非耕

7、地和果园防除一年生和多年生杂草。它是一种生物激活除草剂，必须被靶标植物代谢一部分后才产生活性。德国赫斯特公司已人工合成了其代谢后具杀草活性的物质膦化麦黄酮，并进行了商品化生产，其商品名为草丁膦。（2）李树正等从alternaria solani 培养滤液中分离到的交链孢酸对稗草、油菜、苋菜均有一定的防除效果；（3）近年来，南京农业大学杂草研究室在野燕麦上分离到燕麦枯菌，并进行了致病性、寄主专一性和培养条件的研究这种菌有望应用于防除野燕麦，在澳大利亚被作为候选菌研究。该大学研究室从波斯婆婆纳上分离到胶孢炭疽菌专化菌株，证实有进一步开发价值。该大学研究室所在菟丝子的生物除草剂研究方面，将其范围从寄

8、生于大豆上的菟丝子扩大到危害果树的日本菟丝子及其他牧草上的田野菟丝子并获得了4个菌株，现正进行深入研究。（4）中国农业大学杂草研究室和中国农科院杭州水稻研究所也在进行稗草生物除草剂的研究并取得了重要进展。（5）目前已有多种真菌通过美国环保局注册并已商品化生产和推广使用，如防治柑桔园杂草莫伦腾的devine和防治水稻、大豆田杂草田皂角的collego。（6）南京农业大学从紫茎泽兰自然发生的病株上分离到链格孢菌株。其在20 h 内就可引起紫茎叶的严重病害，并击倒植株，从而在一周内将其杀死。该菌对主要作物安全，是开发紫茎泽兰生物除草剂很有潜力的菌种。现对紫茎泽兰真菌毒素除草剂的开发难，对三叶鬼针草病

9、原真菌除草剂的还没有有成果的研究，所以我们用不同的方法研究紫茎泽兰、三叶鬼针草真菌活性毒素。项目建设方案、技术路线：1、从植株上分离病原菌及纯化：选高温高湿的天气于6点左右，分别在紫茎泽兰、三叶鬼针草植株上采集发病严重典型的病原菌，经0.1%升汞消毒并用无菌水冲洗3次后接于pda平板上，待白色菌丝长出后挑取菌丝进行纯化得到各菌株，将分离得到的各菌株在室内环境下（温度35，相对湿度100%）离体和活体分别各自回接于紫茎泽兰、三叶鬼针草植株上，观察其发病情况2、筛选出产毒能力强的病原菌，并确定该菌株产毒的培养条件：转接菌种于pda培养基上，培养7天，然后取直径为6.5ml的菌丝块，接种到300ml

10、的psk液体培养基中（500ml三角瓶），培养6到7天3、粗毒素的提取方法，稳定性及致病范围的研究：将各供试的产毒培养基装于250ml三角瓶中，每瓶150ml定量接种菌丝，置于25黑暗条件下培养10天。将培养滤液用双层脱脂棉纱布滤去菌丝，再用粗履职过滤即得到培养滤液，备用。取100ml培养滤液，用乙酸乙酯等体积萃取3次，旋转蒸发浓缩尽干后用甲醇定容至5ml，得到粗毒素备用4、被测植株的温室栽培 在温室种植紫茎泽兰、三叶鬼针草各500株5、真菌毒素致病力测定及统计：（1）种子萌发抑制法：选择饱满一致、光泽明亮的种子各50粒为一组，用无菌滤液浸泡12h，洗净后移至铺有湿润滤纸的培养皿中，置于25左

11、右，12hl/12hd的条件下培养，一定时间后连续记录种子萌发情况。（2）幼苗浸渍法：取子叶期的紫茎泽兰幼苗，用无菌水清洗后移入加有5ml无菌滤液的培养皿的滤纸上，在25左右，12hl/12hd的条件下培养，观察幼苗发生萎蔫的时间与致萎程度。6、结果与分析项目主要工作计划与进度安排：1、5月中旬采集带有病原菌植株，进行分离纯化2、6月-7月 筛选出产毒能力强的病原菌，并确定该菌株产毒的培养条件3、8月-10月粗毒素的提取方法，稳定性及致病范围的研究，并收集植株的种子4、11月-12月被测植株的温室栽培，5、1月真菌毒素致病力测定及统计6、2-3月分析总结项目预期成果形式： 1、不同植株提取的病

12、原菌培养液对三叶鬼针草和紫茎泽兰的生长和其种子萌发都有不同程度的影响，对农作物生长和种子梦发没有明显的危害2、不同植株提取的病原菌培养液不仅对紫茎泽兰和三叶鬼针草有抑制作用，对农作物也有不同程度的危害3、这些植株提取的病原菌培养液只有部分植株提取的病原菌培养液对杂草的生长有影响，而部分没有影响4、不同植株提取的病原菌培养液，有的对杂草种子的萌发有抑制作用，有的则直接影响杂草的生长5、这些植株提取的病原菌培养液对杂草的种子萌发和植株的生长都有影响，对农作物的的植株生长没有影响，但对农作物种子的萌发有影响完成本项目的条件分析，包括人员、资料、设备等： 经费预算（资料费、实验材料费、调研差旅费、会议费、论文版面费等）序号开支内容金额（元）12345678项