RNA 干扰技术及其应用

1、葛芹玉葛芹玉 学习科学研究中心学习科学研究中心 RNARNA干扰技术及其应干扰技术及其应 用用 RNARNA干扰技术干扰技术(RNA interference)(RNA interference) RNAiRNAi（RNA interferenceRNA interference，RNARNA干扰）干扰） 近年来的研究表明，将与近年来的研究表明，将与mRNAmRNA对应的正义对应的正义RNARNA和反义和反义 RNARNA组成的双链组成的双链RNA(dsRNA)RNA(dsRNA)导入细胞，可以使导入细胞，可以使mRNAmRNA发生特发生特 异性的降解，异性的降解，导致其相应的基因沉默导致其相

2、应的基因沉默。这种转录后基因沉默。这种转录后基因沉默 机制机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为被称为RNARNA干扰干扰 （RNAiRNAi）。 RNAiRNAi相关技术是相关技术是研究转录后调控研究转录后调控的有效工具，可用于的有效工具，可用于功功 能基因组学研究以及基因治疗等临床用途能基因组学研究以及基因治疗等临床用途。 RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与 DNA 和蛋白质一起构成生 命的框架。但长久以来， RNA 分子一直被认为是小角色

3、。它从 DNA 那儿 获得自己的顺序，然后将遗传信息转化成蛋白质。然而，一系列发现表明 这些小分子 RNA 事实上操纵着许多细胞功能。它可通过互补序列的结合 反作用于 DNA ，从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子 RNA 可以 通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。 利用双链小RNARNA高效、从而阻断 靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。近年来研究表明，将与近年来研究表明，将与mRNAmRNA 对应的正义对应的正义RNARNA和反义和反义RNARNA组成的双链组成的双链RNARNA（dsRNAdsRNA）导入细胞，可以使）导入细胞，可以使 mRNAmRNA发生特异性降解，导致其相

4、应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制发生特异性降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制 (post-transcriptional gene silencing,PTGS)(post-transcriptional gene silencing,PTGS)被称之为被称之为（RNAiRNAi） RNARNA干扰技术干扰技术(RNA interference)(RNA interference) 研究发现，双链RNARNA是RNAi RNAi 的触发物，引发与之互补的单 链RNA RNA ( ssRNA, single-stranded RNAssRNA, single-stranded

5、 RNA)的降解。经过Dicer Dicer (一种 具有RNAase IIIRNAase III活性的核酸酶)的加工，细胞中较长的双链 RNARNA(3030个核苷酸以上)首先被降解形成21212525个核苷酸的小分 子干扰核糖核酸(siRNA siRNA ，short interfering RNA short interfering RNA )， 并 有 效 地 定 位 目 标mRNAmRNA。 siRNA siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNARNA降解的重要 中间媒介，它具有特殊的结构特征，即55端磷酸基团和33端 的羟基，其两条链的33端各有两个碱基突出于末端。 由 si

6、RNA siRNA 中 的反义链参与指导合成被称为RNA RNA 诱导的沉默 复合体（RISC RISC ）的核蛋白体，再由RISCRISC介导切割目的mRNAmRNA分 子中与siRNAsiRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的 功能。 双链RNA（dsRNA）对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰（RNA interference， RNAi）。 双链RNA（dsRNA）经酶切后会形成很多小片段，siRNA 和 miRNA 。 siRNA一旦与信使 RNA(mRNA) 中的同源序列互补结合，会导致 mRNA 失去功 能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。 1990年，为

7、加深矮牵牛花( petunias)的紫色，Jorgensen 等导入了一个强启动子控制 的色素基因。可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色。 这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了，Jorgensen把这个现象命名为共 抑制(cosuppression) 19901990年年Rich Jorgensen Rich Jorgensen 在矮牵牛在矮牵牛 花中发现转基因沉默。花中发现转基因沉默。 19981998年，年，FireFire发现线虫的发现线虫的RNARNA干扰现象。干扰现象。 mex-3mex-3 RNA RNA oA control: not stain

8、edA control: not stained oB: wtB: wt oC: wt + antisense RNAC: wt + antisense RNA oD: wt + ds RNAD: wt + ds RNA 1995 年，康奈尔大学的 Su Guo 博士用反义RNA阻断线虫基因表达 的试验中发现，反义RNA（antisense RNA和正义RNA（sense RNA） 都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。 直到1998年，Andrew Fire的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达 的试验中，真正起作用的是双链RNA 。这些双链RNA是体外转录正 义RNA时生成的。于

9、是提出了RNAiRNAi这个词。 2002年，Zernicka-Coetz等用双链RNA注射小鼠受精卵和着床前的胚 胎，结果发现导入的双链RNA可以特异性的抑制C-mos ， E-cadherin 和GFP基因的表达。Judy Lieberman 和 Premlata Shankar首先向公众宣 布了在动物中利用RNAi技术治疗疾病的研究进展。 同样在2002年，科学家研究了酵母和四膜虫两种生物体的RNAi现象， 他们发现RNAi对染色体的形状有着极大的控制作用。RNAi能永久性 关闭或删除一部分DNA，而不只是简单地使DNA暂时沉默。 2004年，Tomoko和他的同事们发现一种小dsRNA

10、能够作用于神经基 因的表达，并且能在转录水平上直接诱导神经干细胞向神经细胞分化。 这种RNA在基因转录水平上直接参与调控，它被命名为smRNA 。 r 随后，随后，RNAiRNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、 水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 r 这种存在揭示了这种存在揭示了RNAiRNAi很可能是出现于生命进化的很可能是出现于生命进化的 早期阶段。早期阶段。 r 随着研究的不断深入，随着研究的不断深入，RNAiRNAi的机制正在被逐步阐的机制正在被逐步阐 明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工明，

11、而同时作为功能基因组研究领域中的有力工 具，具，RNAiRNAi也越来越为人们所重视。也越来越为人们所重视。 20012001年年ElbashirElbashir等等 Nature Nature上首次报道通过上首次报道通过2121个核苷酸的个核苷酸的siRNAsiRNA成功地在哺乳动物成功地在哺乳动物 培养细胞中诱导特异性基因沉默。培养细胞中诱导特异性基因沉默。 RNAi = RNA interferenceRNAi = RNA interference siRNA = small interfering RNAsiRNA = small interfering RNA siRNP = sma

12、ll interfering RibonucleoproteinsiRNP = small interfering Ribonucleoprotein RISC = RISC = RNA Induced Silencing ComplexRNA Induced Silencing Complex p 越来越多的研究人员开始采用小分子干扰越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNARNA （small interfering RNAssmall interfering RNAs，siRNAssiRNAs）来抑制特定）来抑制特定 的哺乳动物基因表达。的哺乳动物基因表达。 p siRNAsiRNA即为

13、能够以同源互补序列的即为能够以同源互补序列的mRNAmRNA为靶为靶 目标并将其降解而介导目标并将其降解而介导RNARNA干扰途径的短片断干扰途径的短片断 双链双链RNARNA分子。分子。 p 如何设计有效的如何设计有效的siRNAsiRNA一直是当前一直是当前RNAiRNAi研究的研究的 热点话题，不同的实验室有不同的结果。热点话题，不同的实验室有不同的结果。 RNAi作用机制作用机制 r 体外实验表明：体外实验表明：RNAiRNAi反应中，加入的反应中，加入的dsRNAdsRNA被切割为被切割为 21-2321-23核苷酸长的核苷酸长的RNARNA片段，后者会使目的片段，后者会使目的mRN

14、AmRNA被被切割切割 为为21-2321-23核苷酸长的片段核苷酸长的片段。 r 从已经发生从已经发生RNAiRNAi的果蝇的果蝇S2S2细胞中，细胞中，HammondHammond等人部分等人部分 纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降 解与引起解与引起RNAiRNAi的的dsRNAdsRNA具有同源序列的具有同源序列的mRNAmRNA。 r 那么这种核酸酶是如何确定哪些那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNAmRNA该降解而哪些不该降解而哪些不 该呢？该呢？ r 由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21

15、-2321-23核苷酸长核苷酸长 的的dsRNAdsRNA片段，这暗示该核酸酶对片段，这暗示该核酸酶对mRNAmRNA的切割有可能的切割有可能 是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果， 人们提出一种人们提出一种RNAiRNAi作用的简单模型。作用的简单模型。 r 当当dsRNAdsRNA导入细胞后，被一种导入细胞后，被一种dsRNAdsRNA特异的核酸内切酶识特异的核酸内切酶识 别，别，切割成切割成21-2321-23核苷酸长的小片段核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸，这些片段可与该核酸 酶的酶的dsRNAdsRNA结合结构域结合，

16、并且作为模板识别目的结合结构域结合，并且作为模板识别目的 mRNAmRNA。 r 识别之后，识别之后，mRNAmRNA与与dsRNAdsRNA的有义链发生链互换，原先的有义链发生链互换，原先 dsRNAdsRNA中的有义链被中的有义链被mRNAmRNA代替，从酶代替，从酶-dsRNA-dsRNA复合物中释复合物中释 放出来，而放出来，而mRNAmRNA则处于原先的有义链的位置。则处于原先的有义链的位置。 r 核酸酶在同样位置对核酸酶在同样位置对mRNAmRNA进行切割，这样进行切割，这样又产生了又产生了21-2321-23 核苷酸长的核苷酸长的dsRNAdsRNA小片段小片段，与核酸酶形成复合

17、物，继续，与核酸酶形成复合物，继续对对 目的目的mRNAmRNA进行切割进行切割，从而使目的基因沉默从而使目的基因沉默，产生，产生RNAiRNAi现现 象象。 r 通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-RDE- 2,RDE-32,RDE-3和和Mut-7Mut-7等等RNAiRNAi相关的基因。相关的基因。 r （1 1）从）从mRNA mRNA 的的AUGAUG起始密码开始起始密码开始，寻找，寻找“AA”AA” 二连序列二连序列，并记下其，并记下其3 3端的端的1919个碱基序列个碱基序列，作为潜，作为潜 在的在的siRNAsiRNA靶位

18、点。有研究结果显示靶位点。有研究结果显示GCGC含量在含量在 30%50%30%50%左右的左右的siRNAsiRNA要比那些要比那些GCGC含量偏高的更含量偏高的更 为有效。为有效。 r （2 2）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人， 或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他 编码序列编码序列/ /ESTEST同源的序列。例如使用同源的序列。例如使用BLAST.BLAST. r （3 3）选出合适的目标序列进行合成选出合适的目标序列进行合成。通常一个基。通常一个基 因需要设计多个靶序列的因需要设计多个靶

19、序列的siRNAsiRNA，以，以找到最有效的找到最有效的 siRNAsiRNA序列序列。 r 一个完整的一个完整的siRNAsiRNA实验应该有实验应该有负对照负对照。 r 作为负对照的作为负对照的siRNAsiRNA应该和选中的应该和选中的siRNAsiRNA序序 列有相同的组成，但是列有相同的组成，但是和和mRNAmRNA没有明显没有明显 的同源性的同源性。 r 通常的做法通常的做法是是将选中的将选中的siRNAsiRNA序列打乱序列打乱， 同样要检查结果以保证它和其他基因没有同样要检查结果以保证它和其他基因没有 同源性。同源性。 （1 1）化学合成）化学合成; ; （2 2）体外转录）

20、体外转录; ; （3 3）用）用RNase III RNase III 消化长片断双链消化长片断双链RNARNA制备制备 siRNAsiRNA。这种方法。这种方法制备一份混合有各种制备一份混合有各种siRNAs siRNAs “混合鸡尾酒混合鸡尾酒”, siRNA, siRNA混合物中有许多不同的混合物中有许多不同的 siRNAssiRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。，通常能够保证目的基因被有效地抑制。 r 尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的 研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可 以根据

21、用户要求提供高质量的化学合成以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNAsiRNA。 r 主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特 殊需求的。殊需求的。 r 由于价格比其他方法高，为一个基因合成由于价格比其他方法高，为一个基因合成3-43-4对对 siRNAs siRNAs 的成本就更高了，的成本就更高了，比较常见的做法是用其比较常见的做法是用其 他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 r 最适用于最适用于：已经找到最有效的已经找到最有效的siRNAsiRNA的情况下，需的情况下，需 要大量要大量siRNA

22、siRNA进行研究；进行研究； r 不适用于不适用于：筛选筛选siRNAsiRNA等长时间的研究，主要原因等长时间的研究，主要原因 是价格因素。是价格因素。 化学合成法化学合成法 r 相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的 筛选筛选siRNAssiRNAs的好方法。的好方法。 r 更重要的是能够更快的得到更重要的是能够更快的得到siRNAssiRNAs。 r 值得一提的是体外转录得到的值得一提的是体外转录得到的siRNAssiRNAs只要较低的浓度只要较低的浓度 就可以达到化学合成就可以达到化学合成siRNAssiRNAs较高浓度得到的效果

23、。较高浓度得到的效果。 r 不足之处不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录 合成能提供足够做数百次转染的合成能提供足够做数百次转染的siRNAssiRNAs，但是反应规，但是反应规 模和量始终有一定的限制。模和量始终有一定的限制。 r 最适用于最适用于：筛选：筛选siRNAssiRNAs，特别是需要制备多种，特别是需要制备多种siRNAssiRNAs， 化学合成的价格成为障碍时。化学合成的价格成为障碍时。 r 不适用于不适用于：实验需要大量的，一个特定的：实验需要大量的，一个特定的siRNAsiRNA；长；长 期研究。期研究。 r 其他制备其他制备

24、siRNAsiRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个的方法的缺陷是需要设计和检验多个 siRNAsiRNA序列以便找到一个有效的序列以便找到一个有效的siRNAsiRNA。 r 这种方法这种方法制备一份混合有各种制备一份混合有各种siRNAs “siRNAs “混合鸡尾混合鸡尾 酒酒”就可以避免这个缺陷。就可以避免这个缺陷。 r 这个方法是选择通常是这个方法是选择通常是20010002001000碱基的靶碱基的靶mRNAmRNA模版，模版， 用体外转录的方法制备长片断双链用体外转录的方法制备长片断双链dsRNAdsRNA，然后用，然后用 RNase IIIRNase III (or (or D

25、icerDicer) ) 在体外消化，得到一众在体外消化，得到一众siRNAs“siRNAs“混混 合鸡尾酒合鸡尾酒”。 r 在除掉没有被消化的在除掉没有被消化的dsRNAdsRNA后，这个后，这个siRNAsiRNA混合物就可混合物就可 以直接转染细胞，方法和单一的以直接转染细胞，方法和单一的siRNAsiRNA转染一样。转染一样。 r 由于由于siRNAsiRNA混合物中有许多不同的混合物中有许多不同的siRNAssiRNAs，通常能够保，通常能够保 证目的基因被有效地抑制。证目的基因被有效地抑制。 4 4、RNARNA干扰的技术流程干扰的技术流程 vsiRNAsiRNA（ Small i

26、nterfering RNASmall interfering RNA）的设计与合）的设计与合 成成 vsiRNAsiRNA的体内、体外转运的体内、体外转运 vRNAiRNAi的检测（核酸及蛋白水平）的检测（核酸及蛋白水平） siRNA的一般结构： 哺乳动物：哺乳动物：21-23bp dsRNA21-23bp dsRNA 其它生物：更长的片段其它生物：更长的片段 dTdT（UU） （UU）dTdT 4.1 siRNA4.1 siRNA的设计与合成的设计与合成 设计流程（选择设计流程（选择siRNAsiRNA靶位点）靶位点） 从从转录本转录本AUGAUG起始密码子起始密码子开始，搜寻开始，搜寻下

27、游下游AAAA序列序列，记录跟每，记录跟每 个个AA 3AA 3端相邻的端相邻的1919个核苷酸个核苷酸作为候选的作为候选的siRNAsiRNA靶位点；根据靶位点；根据 55和和33非翻译区（非翻译区（UTR)UTR)及靠近起始密码子（及靠近起始密码子（7575个碱基之内）个碱基之内） 等富含调节蛋白结合位点区域来设计等富含调节蛋白结合位点区域来设计siRNAsiRNA。 将候选靶位点与相应的基因组数据库比较，去掉哪些与其它将候选靶位点与相应的基因组数据库比较，去掉哪些与其它 编码序列同源的靶序列。编码序列同源的靶序列。 设计阴性对照设计阴性对照：阴性对照：阴性对照siRNAsiRNA应与应与

28、siRNAsiRNA的核苷酸组成相同的核苷酸组成相同 但没有与基因组明显同源的序列。一般通过改变但没有与基因组明显同源的序列。一般通过改变siRNAsiRNA核苷酸核苷酸 顺序并经同源序列比较确证而得。顺序并经同源序列比较确证而得。 5 UTRCD8 ORF3 UTR CD8 siRNAs CD8 mRNA 5 UTRCD4 ORF3 UTR CD4 mRNA CD4 siRNAs mRNA被干扰的区域效应被干扰的区域效应 + + 化学合成化学合成 体外转录（载体体外转录（载体/ /反应体系）反应体系） DICER/RNaseIIIDICER/RNaseIII消化消化dsRNAdsRNA si

29、RNAsiRNA表达框架表达框架(siRNA (siRNA expression cassettesexpression cassettes，SECs) SECs) 质粒载体体内转录质粒载体体内转录 病毒载体体内转录病毒载体体内转录 siRNAsiRNA的合成的合成 体外转录体外转录 expressi on siRNA表达框架表达框架 r siRNAsiRNA表达框架表达框架(siRNA expression cassettes(siRNA expression cassettes，SECs)SECs)是一种是一种 由由PCRPCR得到的得到的siRNAsiRNA表达模版，能够表达模版，能够直

30、接导入细胞进行表直接导入细胞进行表 达而无需事前克隆到载体中达而无需事前克隆到载体中。 r 这个方法最早是由这个方法最早是由CastanottoCastanotto采用，采用，包括一个包括一个RNA pol IIIRNA pol III 启动子，一段发夹结构启动子，一段发夹结构siRNAsiRNA，一个，一个RNA pol IIIRNA pol III终止位点终止位点。 r 和和siRNAsiRNA表达载体不同的是，表达载体不同的是，SECsSECs不需要载体克隆、测序不需要载体克隆、测序 等颇为费时的步骤，可以直接由等颇为费时的步骤，可以直接由PCRPCR得到，不用一天的时得到，不用一天的时

31、 间。间。 r 因此，因此，SECsSECs成为筛选成为筛选siRNAsiRNA的最有效工具，甚至可以用来的最有效工具，甚至可以用来 筛选在特定的研究体系中启动子和筛选在特定的研究体系中启动子和siRNAsiRNA的最适搭配！的最适搭配！ r 如果在如果在PCRPCR两端添加酶切位点两端添加酶切位点，那么通过，那么通过SECsSECs筛选出的最有筛选出的最有 效的效的siRNAsiRNA后，可以直接克隆到载体中后，可以直接克隆到载体中构建构建siRNAsiRNA表达载体表达载体。 r 构建好的载体可以用于构建好的载体可以用于稳定表达稳定表达siRNAsiRNA和长效抑制的研究和长效抑制的研究。

32、 r 这个方法的主要缺点是这个方法的主要缺点是PCRPCR产物很难转染到细胞中产物很难转染到细胞中。如果有。如果有 适合的新型转染试剂能提高适合的新型转染试剂能提高SECSEC的转染效率的话，那问题就的转染效率的话，那问题就 可以解决了。另外，可以解决了。另外，没有克隆到载体中的没有克隆到载体中的PCRPCR片断并不适于片断并不适于 大规模制备大规模制备。 r 最适用于最适用于：筛选：筛选siRNAsiRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动序列，在克隆到载体前筛选最佳启动 子；子； r 不适用于不适用于：长期抑制研究。如果克隆到载体后就可以了：长期抑制研究。如果克隆到载体后就可以了 72 ho

33、urs post-transfection, the cells were assessed using nuclear staining with DAPI and immunofluorescence using a c-FOS antibody. Non-transfected cells (NT) as well as cells transfected with an SEC expressing a negative control siRNA (scramble) demonstrate wild-type levels of c-FOS. The relative level

34、of reduction in gene expression was quantified and is provided in the bar graph. Variable Reduction in Target Gene Expression Using SECs with Different Promoters. siRNA Expression Cassettes featuring the mouse U6 (Mo-U6), human U6 (Hu-U6), and human H1 (Hu- H1) promoters and encoding a c- fos-specif

35、ic hairpin siRNA were transfected into HeLa cells. 4.2 siRNA4.2 siRNA的体内的体内 、体外转运、体外转运 机械法比如显微注射和基 因枪（biolistic particle） 电转法 脂质体转染法 r siRNAssiRNAs需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑 制，因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否制，因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否 的关键步骤。的关键步骤。 r 例如，一个例如，一个siRNAsiRNA对某个特定基因表达的抑制效对某个特定基因表达的抑制效 率是率是90%90%，

36、但是其转染效率只有，但是其转染效率只有10%10%，那么总的，那么总的 抑制率只有抑制率只有9%9%。 r 目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想。目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想。 r 但是有专门的但是有专门的RNARNA转染试剂转染试剂，其原理也是基于脂，其原理也是基于脂 质体技术，可用于多种真核细胞的质体技术，可用于多种真核细胞的RNAiRNAi研究。研究。 4.3 RNAi4.3 RNAi的检测（核酸及蛋白水平）的检测（核酸及蛋白水平） r 可从可从mRNAmRNA和和蛋白质蛋白质两方面进行：两方面进行： mRNAmRNA：RT-PCRRT-PCR；定量；定量PCRPCR

37、；NorthernNorthern杂交等。杂交等。 蛋白质：蛋白质：WesternWestern杂交；杂交；ELISAELISA；免疫荧光等。；免疫荧光等。 r 细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变 化是化是RNAiRNAi效果最终和最大的体现。效果最终和最大的体现。 5 5、RNARNA干扰的应用干扰的应用 v研究基因功能的新工具研究基因功能的新工具 v线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新 基因，基因，RNAiRNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲

38、将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲 除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势。除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势。 v开展基因治疗的新策略开展基因治疗的新策略 vRNAiRNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止基因序列过量增殖具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止基因序列过量增殖 等作用，因此可以利用等作用，因此可以利用RNAiRNAi现象产生抗病毒的植物和动物，并可利现象产生抗病毒的植物和动物，并可利 用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNAdsRNA抵抗多种病毒。抵抗多种病毒。 v进行药物筛

39、选的工具进行药物筛选的工具 r 在功能基因组研究中，需要对在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功能丧失或降特定基因进行功能丧失或降 低突变低突变，以确定其功能。，以确定其功能。 r 由于由于RNAiRNAi具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因具有高度的序列专一性，可以特异地使特定基因 沉默，获得功能丧失或降低突变，因此沉默，获得功能丧失或降低突变，因此RNAiRNAi可以作为一种可以作为一种 强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。强有力的研究工具，用于功能基因组的研究。 r 将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，以反将功能未知的基因的编码区（外显子）或启动子区，以反 向重复的

40、方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体向重复的方式由同一启动子控制表达。这样在转基因个体 内转录出的内转录出的RNARNA可形成可形成dsRNAdsRNA，产生，产生RNARNA干涉，使目的基干涉，使目的基 因沉默，从而进一步研究目的基因的功能因沉默，从而进一步研究目的基因的功能-RNAi-RNAi技术。技术。 r 根据所选用序列的不同，可将其分为根据所选用序列的不同，可将其分为编码区编码区RNAiRNAi和和启动子启动子 区区RNAiRNAi技术技术。 r 自自19981998年在线虫中发现年在线虫中发现RNAiRNAi现象以来，以基因编码区为靶序现象以来，以基因编码区为靶序 列的编码区

41、列的编码区RNAiRNAi技术已用于技术已用于线虫功能基因组线虫功能基因组的研究。的研究。 r 最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性最初这种技术是通过注射或浸泡等方法直接导入到线虫的性 腺或早期胚胎中。腺或早期胚胎中。这些方法虽然可以关闭目的基因的表达这些方法虽然可以关闭目的基因的表达， 产生突变表型产生突变表型，但这种表型变化却不能遗传但这种表型变化却不能遗传。 r 这种早期的这种早期的RNAiRNAi技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的技术可以用于研究与胚胎发育有关的基因的 功能，但由于细胞分裂造成功能，但由于细胞分裂造成dsRNAdsRNA的稀释，使得这种方法在的稀释，

42、使得这种方法在 研究成体的基因功能时有一定的局限性研究成体的基因功能时有一定的局限性。 r 为弥补早期为弥补早期RNAiRNAi技术的上述不足，技术的上述不足，TavernarakisTavernarakis等对等对RNAiRNAi技术技术 进行了改进，将进行了改进，将目的基因的靶序列以反向重复的方式目的基因的靶序列以反向重复的方式，由热由热 激启动子控制在转基因生物中表达激启动子控制在转基因生物中表达。 r 热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形热激处理后，反向重复序列在细胞内开始转录，其产物会形 成具发夹环结构的成具发夹环结构的dsRNAdsRNA，从而产生，从而产生RNAi

43、RNAi，使目的基因沉默。，使目的基因沉默。 r 这种改进的这种改进的RNAiRNAi技术与传统的技术与传统的RNAiRNAi技术相比，具有明显技术相比，具有明显 的优点：的优点： 首先首先转基因可以遗传给后代转基因可以遗传给后代，有利于突变的分析；，有利于突变的分析； 其次其次dsRNAdsRNA可以被诱导产生可以被诱导产生，RNAiRNAi能够在发育特定阶段能够在发育特定阶段 出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能出现，从而使研究发育早期必需基因在发育晚期的功能 成为可能；成为可能； 另外，当用细胞特异性启动子控制另外，当用细胞特异性启动子控制dsRNAdsRNA的表达时，可的表

44、达时，可 以研究特定基因在不同器官中的功能。以研究特定基因在不同器官中的功能。 r Kennerdell J. R.Kennerdell J. R.和和CarthewR. W.CarthewR. W.用用GAL4/UASGAL4/UAS系统控制系统控制 dsRNAdsRNA在果蝇中的表达，实现了诱导性或细胞特异性控在果蝇中的表达，实现了诱导性或细胞特异性控 制制RNAiRNAi的发生。的发生。 r 随着应用随着应用RNAiRNAi技术研究线虫功能基因组工作的开展，技术研究线虫功能基因组工作的开展， 研究人员对该技术在植物中应用的可能性进行了探研究人员对该技术在植物中应用的可能性进行了探 索。索

45、。 r 加州理工大学的加州理工大学的Chuang C. F.Chuang C. F.和和Megerowitz E. M.Megerowitz E. M.使用使用 此技术研究了拟南芥的此技术研究了拟南芥的AG, CLV3, AP1, PANAG, CLV3, AP1, PAN四个开四个开 花相关基因。花相关基因。 r 结果表明使用结果表明使用RNAiRNAi技术可以技术可以产生功能丧失产生功能丧失或或降低突降低突 变体变体，其表型与以前通过其它方法鉴定的突变体类，其表型与以前通过其它方法鉴定的突变体类 似。似。RNARNA原位杂交表明，原位杂交表明，RNAiRNAi突变体的目的突变体的目的mRN

46、AmRNA 显著降低显著降低。 r 该结果说明该结果说明RNAiRNAi技术亦可以成为功能基因组研究中技术亦可以成为功能基因组研究中 的有力工具的有力工具。 r M. F. MettM. F. Mett等证明含有启动子区的等证明含有启动子区的dsRNAdsRNA在植物体内同样被切在植物体内同样被切 割成割成21-2321-23核苷酸长的片段，这种核苷酸长的片段，这种dsRNAdsRNA可使内源相应的可使内源相应的DNADNA 序列甲基化序列甲基化，从而使，从而使启动子失去功能启动子失去功能，使，使其下游基因沉默其下游基因沉默。 r 由于多基因家族的各成员之间高度同源，因而使用编码区由于多基因家

47、族的各成员之间高度同源，因而使用编码区 RNAiRNAi技术很难将各个成员区分开来研究，而多基因家族内的技术很难将各个成员区分开来研究，而多基因家族内的 启动子序列通常比编码区变化大，采用启动子序列通常比编码区变化大，采用启动子区启动子区RNAiRNAi技术有技术有 望将多基因家族的各个成员区分开来研究望将多基因家族的各个成员区分开来研究。 r 这样综合编码区这样综合编码区RNAiRNAi技术和启动子区技术和启动子区RNAiRNAi技术的信息即可技术的信息即可 更全面地了解多基因家族地各成员的功能。更全面地了解多基因家族地各成员的功能。 r RNAiRNAi现象存在的广泛性远远超过人们的预期，

48、对此问题的深现象存在的广泛性远远超过人们的预期，对此问题的深 入研究结果将为进化的观点提供有力佐证入研究结果将为进化的观点提供有力佐证。 r 与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比，与其它几种进行功能丧失或降低突变的技术相比，RNAiRNAi技术具技术具 有明显的优点，它比反义有明显的优点，它比反义RNARNA技术和同源共抑制更有效，更容技术和同源共抑制更有效，更容 易产生功能丧失或降低突变。易产生功能丧失或降低突变。 r 而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，可以在而且通过与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用，可以在 发育的不同时期或不同器官中有选择地进行，与发育的不同时期或

49、不同器官中有选择地进行，与T-DNAT-DNA技术造技术造 成的功能永久性缺失相比，这是更受科学家偏爱的。成的功能永久性缺失相比，这是更受科学家偏爱的。 r 作为一种新的、强有力的研究工具，作为一种新的、强有力的研究工具，RNAiRNAi在功能基因组学领域在功能基因组学领域 呈现出巨大的应用前景，成为当今研究领域最引人注意的话题呈现出巨大的应用前景，成为当今研究领域最引人注意的话题 之一。之一。 r 相对于相对于基因敲除技术基因敲除技术(knockout)(knockout)，RNAiRNAi具有快速、有效、容易操具有快速、有效、容易操 作和序列特异性强等优点，被称为基因抑制作和序列特异性强等

50、优点，被称为基因抑制(knockdown)(knockdown)技术，技术， 是研究特定基因功能的有效方法。是研究特定基因功能的有效方法。 r 因此，在某种程度上可以替代操作复杂和费用昂贵的基因敲除因此，在某种程度上可以替代操作复杂和费用昂贵的基因敲除 技术。技术。 治疗治疗HIVHIV感染感染 r 由于由于RNAiRNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制，是机体中古老而天然的抗病毒机制，HIVHIV病毒病毒 感染是我们亟待解决的问题，将感染是我们亟待解决的问题，将RNAiRNAi技术应用于艾滋病技术应用于艾滋病 治疗是顺理成章之事。治疗是顺理成章之事。 r 针对针对HIVHIV病毒研究有病毒研

51、究有JacqueJacque等设计的抑制等设计的抑制HIV 1HIV 1长末端重复长末端重复 序列、附件基因序列、附件基因vifvif和和nefnef表达的表达的siRNAsiRNA，LeeLee等针对等针对revrev转录转录 子设计的子设计的siRNAsiRNA及及NovinaNovina等等 针对针对HIVHIV病毒病毒gaggag基因设计的基因设计的 siRNAsiRNA，其，其基本策略都是选择基本策略都是选择HIVHIV病毒或宿主细胞基因为病毒或宿主细胞基因为 靶点靶点。 r Jude LiebermanJude Lieberman等已经成功地利用等已经成功地利用 RNAiRNAi技

52、术治愈了实验鼠技术治愈了实验鼠 的肝炎。的肝炎。 r 他们干扰的目标是他们干扰的目标是“凋亡相关蛋白质（凋亡相关蛋白质（FASFAS）基因）基因”。 FAsFAs存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。存在于细胞表面，它能够启动细胞的自杀程序。 r 据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒据认为，许多肝病是由于病毒、免疫系统失常或慢性酒 精中毒激活了精中毒激活了FAsFAs基因所导致的。基因所导致的。 r Jude LiebermanJude Lieberman等给实验鼠尾部血管注入旨在等给实验鼠尾部血管注入旨在“沉默沉默” ” FAsFAs基因的基因的siRNAsiRNA，发现有，

53、发现有9090的肝细胞接收到了这种的肝细胞接收到了这种 RNARNA分子，分子，FAsFAs蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果，蛋白质的产量变成原先的十分之一。结果， 未接受未接受RNAiRNAi治疗的实验鼠有治疗的实验鼠有4040在天内死亡。而在天内死亡。而4040只只 接受过治疗的实验鼠有接受过治疗的实验鼠有3333只活了下来，只活了下来，1010天后研究人员检天后研究人员检 查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。查这些实验鼠的肝部，发现完全正常。 r 多种癌基因可以作为靶点设计相对应的多种癌基因可以作为靶点设计相对应的siRNAsiRNA 。 r Brummelkamp Brummelka

54、mp 等用逆转录病毒载体将等用逆转录病毒载体将siRNAsiRNA导入肿瘤细胞导入肿瘤细胞 中中, ,特异性抑制了癌基因特异性抑制了癌基因k ras (v12)k ras (v12)的表达的表达。 r 对对急性髓性白血病的研究急性髓性白血病的研究已经取得了乐观的结果。已经取得了乐观的结果。 r Scher Scher 等以引起慢性髓性白血病和等以引起慢性髓性白血病和bcr ab1bcr ab1阳性急性成淋巴阳性急性成淋巴 细胞白血病的细胞白血病的bcr ab1bcr ab1癌基因为靶基因癌基因为靶基因, ,设计了对应的设计了对应的siRNA,siRNA, 并获得了并获得了87%87%的有效抑制

55、率。的有效抑制率。 r WildaWilda等用等用siRNAsiRNA抑制白血病抑制白血病bcr/ablbcr/abl融合基因表达融合基因表达也取得了也取得了 成功。成功。 因此因此基于基于RNAiRNAi技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨技术的抗肿瘤治疗药物开发潜力巨 大大。 多数的多数的siRNAsiRNA表达载体依赖表达载体依赖3 3种种RNARNA聚合酶聚合酶IIIIII启动子启动子(pol III)(pol III)中中 的一种，操纵一段小的发夹的一种，操纵一段小的发夹siRNAsiRNA在哺乳动物细胞中的表达。在哺乳动物细胞中的表达。 包括的人源和鼠源的包括的人源和鼠源的U6U6启动

56、子和人启动子和人H1H1启动子。启动子。 之所以采用之所以采用RNA pol IIIRNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中 表达更多的小分子表达更多的小分子RNARNA，而且它是，而且它是通过添加一串（通过添加一串（3 3到到6 6个）个）U U 来终止转录的来终止转录的。 使用这类载体，需要使用这类载体，需要2 2段编码短发夹段编码短发夹RNARNA序列的序列的DNADNA单链，退单链，退 火，克隆到相应载体的火，克隆到相应载体的pol III pol III 启动子下游。启动子下游。 由于涉及到克隆，这个过程需由于涉及到克隆，这个过程需

57、要几天的时间，同时也需要经要几天的时间，同时也需要经 过测序以保证克隆的序列是正过测序以保证克隆的序列是正 确的。确的。 不过幸好载体容易大量扩增，不过幸好载体容易大量扩增， 这个优点足以弥补所有缺陷，这个优点足以弥补所有缺陷， 特别是当载体在实验中确实有特别是当载体在实验中确实有 效的时候。效的时候。 r siRNAsiRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究长期研究 的方法的方法带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的 表达，持续数星期甚至更久。表达，持续数星期甚至更久。

58、r 即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行即使是对转染带有筛选标记质粒的细胞进行瞬时筛选瞬时筛选，也有助于富，也有助于富 集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效集带质粒的细胞。这也可以帮助解决一些难转染的细胞由于转染效 率低造成的问题。率低造成的问题。 r 开始研究开始研究逆转录病毒和其他病毒载体逆转录病毒和其他病毒载体用于用于siRNAsiRNA表达，其优势在于表达，其优势在于 可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染 效率低而带来的种种不便。效率低而带来的种种不便。 r 最适用于：最适用于：已知

59、一个有效的已知一个有效的siRNAsiRNA序列，序列，需要维持较长时间的基因需要维持较长时间的基因 沉默沉默，或者，或者需要用抗生素筛选能表达需要用抗生素筛选能表达siRNAsiRNA的细胞的细胞，长期研究。，长期研究。 r 不适用于：不适用于：筛选筛选siRNAsiRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等 较为费时、繁琐的工作）较为费时、繁琐的工作） Following transfection, the cells were selected with hygromycin. Three Following transfection, the c

60、ells were selected with hygromycin. Three weeks following selection, the cells were analyzed for GFP expression by weeks following selection, the cells were analyzed for GFP expression by fluorescence microscopy. Green: GFP. Blue: DAPI stained nuclei. GFP fluorescence microscopy. Green: GFP. Blue: D