外源蛋白在CHO细胞株中高效表达的策略

1、外源蛋白在 cho 细胞株中高效表达的策略魏 韬1 ，王 菡2 ，代海兵1( 1 牡丹江医学院基础医学院机能学教研室( 黑龙江 牡丹江 157011) ;2 牡丹江医学院临床医学院检验实验室( 黑龙江 牡丹江157011 )摘 要 目的: 随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质。真核细胞中 cho 细胞与其他表达系统相比具有许多优点，是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。本 文着重阐述外源蛋白在 cho 细胞中高效表达的策略。关键词: 外源蛋白; cho 细胞; 高效表达; 策略中图分类号: q786文献标识码: a文章编号: 1006 288

2、2( 2011) 04 561 03在哺乳动物细胞中高效表达外源蛋白 依 赖 于 许 多 因素，如转录和 翻 译 控 制 因 子、rna 加 工、基因拷贝的数目、mrna 的稳定性、外源基因在染色体上的整合位点、重 组 蛋白对宿主细胞的 潜 在 毒 性和宿主细胞的基因组偏好性等。为重组蛋白选择一个合适的表达系统，由许多因素决定，这 些因素包括: 细胞生长的特点、表达的水平、胞内或胞外表结构，因此本研究 采 用 较 易获得的乙肝高效价免疫球蛋白 作为模型抗体，微 球 也 采 用较经济的未包裹药物的空载微 球作为模型微球，并且为便于观察结果，在穿膜肽上融合了 报 告 蛋 白 egfp，但仍具有穿膜

3、活 性7。尽管本研究采用 spdp 交联法成功实 现 了 穿 膜 肽 抗 体 牛白蛋白微球的 偶联，但尚未对其穿膜活性、抗体的靶向性及该药物传递系 统的杀伤活性进行检验，这有待进一步研究解决。参考文献9 洪孝庄，孙曼霁 蛋白质连接技 术m 北 京: 中 国 医 药 科 技出版社，1993: 1 5110hermanson gt bioconjugate techniquesm 2nd ed san di-ego: academic press，2008: 277 335stuchbury t，shipton m，norris r，et al a reporter group de-livery

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11、的 目 的产物易于分离纯化等优点而成 为目前外源蛋白表达的首先体系。1 cho 细胞株的研究cho 属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白质，利 于外源蛋白的分 离，该 表 达系统虽然是生物制药最理想的 表达系统，但这种系统也存在诸多缺点，如: 大 规 模 培 养 中cho 细胞会面临对无血清培养基的适应性差，细 胞 无 限 度 增殖以及 细 胞 凋 亡 等 难 题。因 此，改 造 cho 细 胞 对 优 化 cho 表达系统，提高外源蛋白表达量有着巨大的应用潜力。1 1 改造 cho 细胞，增强抗细胞凋亡活性 理论上讲，防止 或延长细胞凋亡，可以极大地提高重组蛋白的产量，而阻断任何一个凋亡信

12、号传递步骤，均可抑制凋亡的发生。bcl 2基因是目前最有效的抗凋亡基因。bcl 2 基因转染的 cho细胞，在丁酸钠( 可引起凋亡) 的存在下，细胞培养时间显著延长，而分泌抗体的产量是原来的 3 倍1。1 2 改造 cho 细 胞，使其可在无蛋白培养基 ( pfm) 中 自分泌生长 无血清培养基中必需两种蛋白成份，即 胰 岛 素 和转铁蛋白。这两种蛋白都是动物来源的，因而未能消除血 清带来的安全隐 患。研 究 发 现，胰 岛 素 样 生 长 因 子 ( igf 1) 能代替胰岛 素 发挥相同的作用。若 在 cho 细 胞 内 同 时 表达 igf 1 和转铁 蛋 白，此 cho 细 胞 就 能

13、 在 pfm 中 生 长良好2。关键要素之一。在构建或选择 cho 细胞表达载体时，应考虑以下一些调控元 件: 启动子和增强子 多 聚 腺 苷 酸 加尾信号 内 含 子 序 列 ( ivs ) 选 择 标 记 多 克 隆 位 点( mcs) 原核复制起始区( ori) 和抗性基因。启动子是影响外源基因表达效率的 关 键 因 素 启 动 子2 1大多位于基因 5端上游区，是一种与基因转录 起 始 有 关 的5端 dna 序列，在 30bp 区有 tata box，可引导 rna 聚合酶转录起始，在 70 80bp 区还有 gc box，可协同调节转录起始频率和提高转录效率。sv40、admlp、

14、ltr 和 cmv启动子在 cho 细胞中都能较好地发挥作用。其中，cmv 启动子活 性 分 别 是 sv40 启 动 子 和 ltr 启 动 子 的 10 倍 和 30倍。1989 年，uetsuki 等人从人成纤维细胞的染色体中分离 到人延伸因子的启动子 ef1 ，它是目前发现的最强的启动子之一5。2 2增强子 增强子是一类可使启动子的基因转录效率显 著提高的顺式作用元件，本身无启动子活性，可独立存在于上游区、下游区或 基 因 内 部，可进行远距离增强启动作用，而且无方向性。它有特征性序列，常由 812bp 组 成，以 单 拷贝或多拷贝的形式存在。增强子可使转录效率增强 10 100 倍，

15、通常来源于 sv40、rsv 或 cmv 病毒，cho 细胞中一般使用 sv40 和 cmv 增强子6。一旦增强子的作用使表达产物对细胞有毒 性 时，最好改用诱导型启动子来表达外源 基因，如热休克启动子、金属硫蛋白启动子。2 3 多聚腺苷酸加尾信号 真核基因的 hnrna 的加工过程 需要多聚腺苷酸加尾信号 ( pa) 。实验表明: 除去 pa 后，外 源蛋白表达量降低 90% 。研究表明: 有两处 dna 序列决定 着前体 mrna 的多聚腺苷酸化。一是在多聚腺苷酸化位点 上游 11 30 个核苷酸处的五聚体保守序列 aauaaa; 二是 切割和多聚腺苷酸加尾反应的识别位点。实 验 表 明:

16、 该 处 的缺失和点突变将阻止多聚腺苷酸化反应的正常进行。另 一处不太保守的序列是 tg 共有序列。实验表明: 除去该共 有序列可能影响 前 体 mrna3 端 加 工 的 位 置7。目 前 多 采 用 sv40 的晚期及早期 pa，牛生长素基因的 pa 和人工合成 的 pa 。改造 cho 细胞，阻遏细胞增殖 研究发现，在一定的细1 3胞密度条件下，目的蛋白的产量与细胞生长速率成正相关，但当细胞密度过 大 时，目的蛋白产量与质量下降。细 胞 增 殖阻遏是指在自然条件下，当细胞增殖到高密度后，采取一 定的手段，抑制细胞进一步增殖，使细胞增殖处于相对停滞 状态。但细 胞的代谢并没有停止，一 直

17、表 达 并 分 泌 蛋 白。 依赖于细胞周期的激酶 p21、p27 和肿瘤抑制因子 p53 被用 于在 g1 期阻遏 cho 细 胞 的 增 殖。p53 是细胞周期和细胞 凋亡中的关键调 控 因 子，这两种功能都能影响细胞凋亡或 诱导 p21 的产生，并启动 dna 修复和细胞的存活。过量表 达这三种蛋白质中的任何一种，都将抑制细胞周期中的 cy- clin e cdk2 复合体的磷酸化酶的活性，并阻止细胞进入s 期，从而使细胞被滞留在 g1 期。用携带上述三种蛋 白 质基因的多顺反子表达载体转染 cho 细胞，表现出不同的反应。当 p21 过度表达，可以阻遏细胞增殖，而且没有细胞凋 亡的表现

18、，能提高目的蛋白表达 15 倍3。在 另 一 个 实 验中，构建了双顺反子表达载体，其 中 携带编码分化因子 c /ebp a ( caat 增强子结合蛋白) ，它具有诱导和稳定 p21的作用，运 用这一表达方式，cho 细胞周期被阻遏长达 2周，外源蛋白的表达量比对照细胞提高了 10 15 倍4。2 优化表达载体系统2 4运用共扩增基因做选择标记 在 cho 细胞表达载体中有两类选择标记，neo 等是非扩增基因，这种选择标记对目 的基因的拷贝数没有影响，主要用于构建瞬时表达载体，另一类选择标记具有扩增基因的功能，也称共扩增基因，如二 氢叶酸还原酶 ( dhfr) 、谷 氨 酰 氨 合 成 酶

19、 ( gs) 等。当 携 带 共扩增基因的表达载体转染 cho 细胞后，随着培养基中选 择性药物浓度的逐渐增加，共扩增基因的拷贝数不断增加; 同时，其侧翼的 dna 片段也会相应得到扩增，使目的基因的 拷 贝数增加几百到几千倍，从而达到外源基因的高效表 达8。表达外源蛋白最成功的这类载体受体系统主要有 cho / dhfr 和 cho / gs。近 年 发 现，若弱化选择标记基因 基因 3端下游，三是将标记基因插入到 人工合成的内含子 中9。2 5 表达元件在染色体上的整 合 当环状质粒 dna 导 入 cho 细胞后，环状质粒首先随机断裂，然后随机整合到 cho 细胞染色体 dna 中 (

20、采用同源重组的定点整 合 除 外 ) 。为 了最大限度地保 证 表 达 元 件 的 完 整 性，一般在转染前要选 择合适的酶切位点将 dna 线性化。另一方面: dna 进入细 胞后，在染色体中的整合是随机的，表达元件整合部位的上 游及下游的 dna 的遗传组成将影响外源蛋白的表达水平。 能够提高外源基因表达水平的整 合部位被称做热点 ( hot spot) 。鉴于此，有人设计载体来筛选 cho 细胞染色体上的 热点，以提高目 的 基 因 表 达。采取两种方法弱化选择标记 neo 基因的表达。一是在上游进行突变，弱化 neo 的表达翻 译起始效率。二是在 neo 的内部插入一个人工合成的内含

21、子，内含子中 not i 切点插入目的基因和 dhfr 基 因，在 这 种表达载 体 中 neo 的表达受到了极大的弱化。在 一 定 的 g418 浓度的培养基里，只有当人工组建的 neo 基 因 整 合 在 染色体 dna 的热点部位时，neo 基因的表达量足够高，才能 保证细胞存活。分离 neo 抗性的克隆，进一步在 mtx 的培 养基中培 养，以提高基因的拷贝数。据 报 道: 使 用 这 种 载 体，在 cho 细胞中 的 cd20 的单克隆抗体 表达量最高能达 到 2g / l10。2 6 内含子序列( ivs) 实验表明，表达载体中引入天然或 人工合成的内含 子 序 列 ( ivs)

22、 有利于外源蛋白前体 mrna 的稳定性，从而增加翻译效率，提高蛋白质表达量11。有利 于内含子的 剪 切 的 共 有序列由三部分组成: 供 体 ( splicing并非易事。本文着重探讨了与遗传因素有关的几个方面。这些策略的运用，将不同程度改善外源蛋白在 cho 细胞中 的表达水平。当然，外源蛋白在 cho 细胞中的高效表达是 一个涉及多学科 的 问 题，尚需多个研究领域的共同合作探 讨。参考文献1kim n s，lee g m，overexpression of bcl 2 inhibits sodium buty-rate induced apoptosis in chinese ham

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