动物固体组织蛋白提取Protocol

1、动物固体组织蛋白提取-pr。tocol作者:日期:动物固体组织蛋白提取p r o tocol1、前夜将磁珠及匀浆管洗净置入75%乙醇中浸泡。早晨取出磁珠和匀浆管，自然晾干；也可放入烤箱中，速度较快。2、裂解液配制：r ipa:pmsf=10 0 : 1,现配现用。（1000ulripa+10ul p msf）。置入 4c冰3、抽蛋白（应冰上进行）：a、适量组织（最好放入液氮中反复研磨成粉状）加入裂解液中。一般10ml管体系中加入：7-8粒磁珠、100mg 组织、1mlripa+1 0 u 1pmsf、1 tablet c ock t a i 1。b、匀浆。手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中

2、，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（68分钟），充分研碎，使组织匀浆化。机器匀浆：用组织捣碎机10000150 0 0r/min上下研磨制成1 0%组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续35次,在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎， 可用soni prep150型超声波发生器以振幅1 4微米超声 处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用4 0安培，5秒/次， 间隙1

3、0秒反复35 次。反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右 （即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复 3次左右），但有部分酶活力会受影响。c、将组织匀浆转入 1.5ml的ep管中（eppe n dorf管、离心管）120o0r/min 4 c 离心15mi n。d、离心后e p管中液体分三层，提取中间无色液相，移入新的ep管中。可-8 0 c保存。4、蛋白浓度测定。a、配工作液：溶液a:溶液 b=50: 1 （200ul: 4ul）。需测试复孔。标本x ，则需a量=2*（ x+ 1+1 ） * 2 00; b =2*（x+1

4、+1）*4 。尸 、wtl-losc、复孔，取蛋白6ul加入0.6mlep管，再/入54ulh2o,混匀。即1 0倍稀释。d、取2 0-25ul 1 0倍稀释蛋白样本加入 96孔板平底板内，再加入2 00u 1 ab工作液，混匀振 荡后，37 c incubate 3 0min。注：应现加蛋白样本，再加工作液。因为每次加蛋白后需换tip,再加入工作液即起反应，应缩短时间。e、酶标仪检测 5 6 2 nm吸光度。p rogramf、计算蛋白浓度。根据标准曲线，如 y=1.27 4 5x-0. 1 68 4其中y :蛋白浓度；x :吸光度。最终蛋白浓度为：10*y（ug/ul、mg/ml）g、蛋白

5、样本放-8 0c冻存。大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由 分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲 线作比较。博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。如果样品数量较多,可以同时使用两种测定用酶标仪自 动检测。当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个 因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。comm a ssie 法（bradford 法）：原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料g -250结合，颜色从棕色变为蓝色，在595nm 处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。bc a 法：原

6、理：在碱性条件下，蛋白将cu+ +还原为c u +,cu+与b c a试剂形成紫色络合物， 测定其在5 6 2 nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。现对这两种方法进行比较：一、实耳材料：细胞总蛋白提取试剂盒（ar0 1 0 3）m2 3 1bca蛋白定量试 剂盒（ar01 4 6 ）c o mmass i e改良增强型蛋白质定量试剂盒（ ar 0 1 4 5 ）二、操作步骤：c om m as s i e 法：1 .将b s a冻干标准品（1 0mg/支）用生理盐水或 pb s稀释成2000ug/ m 1 ,1000 u g /m 1 ,500 u g/m 1,2 5 0

7、 ug/m 1,125 ug/ ml, 6 2 . 5 ug/m l, 3 1 .2 5 u g /ml, 1 5 .625 u g /ml八个浓度的蛋白标准溶液。2 . m 2 31用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。3 .各取20ul蛋白标准品和待测 m231样品至相应标记的微孔板中。4 .滴加200ul考马斯增强型试剂（溶液a）至每孔混匀并充分震荡30s5 .停止震荡，在室温孵育样品1 omin6 .在酶标仪中测量5 95nm时的吸光值。7 .绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。bca 法：1 .按5。体积b ca试剂a加入1倍体积bca试剂b配置适量b ca工作液，充分混 匀。

8、2 .将bs a冻干标准品（1 0 mg/支）用生理盐水或p b s稀释成2 00 0 u g / ml, 1000 ug/ml,5o0 ug/ml,2 5 0 ug/ml , 125 ug/ml, 62.5 ug/m l,31.25 ug/ml, 15. 6 25 u g /ml八个浓度的蛋白标准溶液。3 .m2 3 1用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。4 .各取2 0 u l蛋白标准品和待测m 2 3 1样品至相应标记的微孔板中。5 .滴加200ulb c a工作液至每孔混匀并充分震荡30s6 .停止震荡，在37度孵育样品3 0 min7 .在酶标仪中测量 562n m时的吸光值。8 .绘制

9、标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。三、实验结果1234567comm s ie去吸光值0. 5 30.5220.431 0 .2620. 1 180.0410 .001bc a法吸。8 1 0.4 44 o4； 0. 1 40. 0 60.037 0.0 174 /其中 1 至u 8 为 200 0 ug/ml , 1 0 00, 5 0 0, 25 0 ,12 5 ,62 . 5,31.25, 1 5.6 2 5 的标准浓度的bsa蛋白，9为空白孔，样品1为8倍稀释m 2 3 1总蛋白，样品2为3 2倍稀释m231 总蛋白conassi%标准独线(宣苣-一)理境山盟c o m m

10、a s sie 法：为了测试准确，应在试剂加入后的 5 2 0 m in内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是 最稳定的。由标准曲线可以算出样品原始浓度为14. 4 mg/m 1c o mmass i e 法优点是：1 .灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1ug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。2 .测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至2。

11、分钟之间，颜色的稳定性最好。3 .干扰物质少。如干扰 l。wry法的k+、n a +、m g2+离子、t r is缓冲液、糖和蔗 糖、甘油、萌基乙醇、e dt a等均不干扰此测定法。此法的缺点是：1 .由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此 bradford法用于不同 蛋白质测定时有较大的偏差， 在制作标准曲线时通常选用g 一球蛋白为标准蛋白质， 以减少 这方面的偏差。2 .仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、tr 1 to n x- 1 0 0、十二烷基硫酸钠（s ds）和0 .1 m的n a oh。（如同0 .1m的酸干扰lo wa r y法一样）。3 .

12、标准曲线也有轻微的非线性 ，在0-1000u g/m 1浓度范围内有较好线性。因而不 能用be er定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。bca 法：由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.28m g/mlbca法特点：1.灵敏度高，检测浓度下限达到 25 dg /ml,最小检测蛋白量达到 0.5科g, 待测样品体积为1-2 01 o 2.测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5 %的sds,5 %的t r iton x-1 0 0,5%的tween 20,60,8 0。 3.在2 0-2 0 00 d g/ml浓度范围内有良好的线性关系。4

13、.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。5.受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：e dt a小于10mm。dtt小于1 mm 前基乙酉i低于 1m mbca法和comma ssie法各有优势，在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种 方法配合使用，以消除定量的误差。(r a di o i m m un o p r ecipitati o n ass ay) ri pa 裂解液(ripa lys is bu f f er)是一种传 统的细胞组织快速裂解液。 ri p a裂解液裂解得到的蛋白样品可以用于常规的west ern、i p等。ripa使用方法对于培养细胞样品：1 . 融

14、解r i p a裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入 pmsf，使pmsf 的最终浓度为1mm。2 .对于贴壁细胞：去除培养液，用pbs、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150 - 2 50微升裂解液的比例加入裂解液。 用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞 1-2秒后，细胞就会被裂解。对于悬7?细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入 150- 2 50微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-1 0 0

15、万细胞/管,然后再裂解。裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入 15 0微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常 高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。对于组织样品：1 .把组织剪切成细小的碎片。2 .融解ripa裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入pm sf,使pms f的最终浓度为1 mm。3 .按照每2 0毫克组织加入150-25 0微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。）4 .用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。5 .充分裂解后，1000 0-1400 0 g离心3-5分钟，取上

16、清，即可进行后续的p age、we st ern和免疫沉淀等操作。6 .如果组织样品本身非常细小 ，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清 ，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便 ，不必使用 匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。注：rip a裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物 为含有基因组dna等的复合物。在不检测和基因组dna结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物， 随后离心取上清用于后续实验。

17、如果检测一些常见的转录因子，例如nf k b、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。各种rip a的差别及用途产品名称west e rn 及ip细胞裂解 液r ipa裂解液（强）ripa裂解液（中）ripa裂解液（弱）np-40裂解液sds裂解液有效裂解成分1% tr 1 ton x-10 01% t r ito n x-100 ,1 %d eoxyc h 01a t e , 0. 1 %sds1% np-40, 0 . 5% d e oxychol a te, 0. 1% sds1% np-40, 0.25% d e o x ycholate1%np-401% sds裂

18、解强度温和强中温和温和强对膜蛋白的提 取一般很好较好一般一般很好对胞浆蛋白的 提取很好很好很好很好很好很好对核蛋白的提 取较好很好较好较好较好很好胞浆磷酸化蛋 白提取很好很好很好很好很好很好细胞核转录因子提取很好很好很好很好很好很好含蛋白酶抑制 剂是是是是是是含磷酸酯酶抑 制剂是是是是是是主要用途wb, ip,co- i pwb , ipwb , ipw b, ip,co- i pwb, ip , c 0-ipwb, ch ip蛋白酶及蛋白酶抑制剂大全摘要：破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白

19、水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同因此需要调整各种蛋白酶的浓度。蛋白酶抑制剂破碎细胞提取蛋白质的同时可释放出蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解。在蛋白质提取过程中，需要加入蛋白酶抑制剂以防止蛋白水解。以下列举了5种常用的蛋白酶抑制剂和他们各自的作用特点，因为各种蛋白酶对不同蛋白质的敏感性各不相同，因此需要调整各种蛋白酶的浓度。由于蛋白酶抑制剂在液体中的溶解度极低，尤其应注意在缓冲液中加人蛋白酶抑制剂时应充分混匀以减少蛋白酶抑制剂的沉淀。在宝灵曼公司的目录上可查到更完整的蛋白酶和蛋白酶抑制剂表。常用抑制剂pm

20、 s f p heny 1 meth a nes ulfonyl fluo ride （剧毒）1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，凝血酶）和疏基蛋白酶（如木瓜蛋白 酶）；2）10 m g/ml溶于异丙醇中；3）在室温下可保存一年；2-8 c可以存放数月之久。欲长期保存，可冻存在-2 0c4）工作浓度：1 71 7 4 u g/ml （0.11.0mm o 1 /l）;储存液浓度为 10 0 或 200mm 5 ）在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的pms foedta1）抑制金属蛋白水解酶；2）0. 5 m ol/l 水溶液，ph8 9 ;3）溶液在4 c稳定

21、六个月以上；4）工作浓度：0.51 . 5mm ol/l. （0.2 0 .5mg/m 1 ）;5）加入naoh调节溶液的ph值，否则ed ta不溶解。胃蛋白酶抑制剂（p ep s t a n t i n）l）抑制酸性蛋白酶如胃蛋白酶，血管紧张肽原酶，组织蛋白酶d和凝乳酶；2）1mg/ml溶于甲醇中；3储存液在4 c一周内稳定，一2 0c稳定6个月；4）1 作浓度:0.7 u g / ml（1 u mol/l ）5）在水中不溶解。亮抑蛋白酶肽（le u pept i n ）1）抑制丝氨酸和疏基蛋白酶，如木瓜蛋白酶，血浆酶和组织蛋白酶b;2 ）lomg/m 1 溶于水；3）储存液4 c稳定一周，

22、-2 0c稳定6个月；4）工作浓度0 .5 mg/ml。胰蛋白酶抑制剂（apr o tin i n）1）抑制丝氨酸蛋白酶，如血浆酶，血管舒缓素，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶；2） 1 om g/m l 溶于水，ph 7 83储存液4c稳定一周，-2 0c稳定6个月；4）工作浓度：0. 0 62. 0 ug/ml（ 0 .01 0.3u mol/l）;5）避免反复冻融：6）在p h12.8时失活。蛋白酶抑制剂混合使用3 5 ug/ml p m s f 丝氨酸蛋白酶抑制剂0 . 3 m g/m 1 ed ta 金属蛋白酶抑制剂0 .7ug/ml胃蛋白酶抑制剂(p ep s tat i n)酸性蛋白酶抑制

23、剂0 . 5ug/ m 1亮抑蛋白肽酶(leupep t in)广谱蛋白酶抑制剂常用蛋白酶抑制剂表抑制剂靶蛋白酶有效浓度储藏溶液注解anti p ain木瓜酶和胰酶5 0a g/ml1mg / m 1水溶液对胰凝蛋白酶，胃液 素，纤溶酶无影响apms f胰蛋白酶样丝氨酸 蛋白酶10- 4 0 心 g/ml或 1 0-20 am10 0 mm ol/l 水溶液毒性比pmsf低， 不能抑制胰凝蛋白 酶或乙酰胆碱酯酶抑肽酶丝氨酸蛋白酶0.06-2 心 g/m l10 m g/ml pbs 溶液避免反复动冻融抑氨肽酶b氨基肽酶4 0a g/ml溶于甲醇不能抑制短肽酶ca 1 pain抑制剂i、nc a

24、 1 pa i n (钙依 赖性半胱氨酸蛋白 酶)i : 1 7 a g /ml n ： 7 a g/m 1溶于乙醇可渗透薄膜抑糜肮酶素胰凝乳蛋白酶6 6 0 心 g /ml溶于dmsob.m.综合酶片丝氨酸，半胱氨酸和 金属蛋白酶每10-5 0 ml细胞 提取液内加一片不含e dt aedta金属蛋白酶0 .2-0.5 m g/ml 或0 . 5 -1 . 3 amo1 /l5 00mmol/l 水溶液 ph=8.0抑蛋白酶醛肽丝氨酸蛋白酶，疏基 蛋白酶0.5 -2ig / m 110 m g/ml水溶液a 2-巨球蛋白广谱1 u /ml10 0 u/ m 1 pbs溶液避免接触还原剂p e fabloc s c(boe- hrin g er ma n nhe i m)丝氨酸蛋白酶0.1-1.0m g /m 1 或0.4-4mmol /l10 0 mm水溶液无毒，在中性p h下 较pms f稳定胃蛋白酶抑制剂酸性蛋白酶0. 7 心 g/m 11mg/m 1甲醇溶液pmsf丝氨酸蛋白酶17-17 0 心 g/ml1 0 m g / ml异内醇溶 液每一操作步骤时新 鲜加入tlc k胰蛋白酶3