解放军307医院EGFR突变检测经验分享课件

1、解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 1 解放军解放军307307医院医院EGFREGFR突变检测经验分享突变检测经验分享 刘刘 毅毅 解放军解放军307307医院医院 全军肿瘤中心全军肿瘤中心 肿瘤学研究室肿瘤学研究室 350:2129-39 2004;350:2129-39 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 8 EGFREGFR的突变类型的突变类型 Nature Reviews CancerNature Reviews Cancer 2007;7:169-181 2007;7:169-181 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 9 肺癌靶向治疗的里程碑：肺癌靶向治疗

2、的里程碑：IPASSIPASS研究研究 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 10 肺癌靶向治疗的里程碑：肺癌靶向治疗的里程碑：IPASSIPASS研究研究 N Engl J Med 2009;361:947-57N Engl J Med 2009;361:947-57 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 11 肺癌靶向治疗的里程碑：肺癌靶向治疗的里程碑：IPASSIPASS研究研究 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 12 EGFREGFR突变状态指导突变状态指导TKITKI类药物的使用类药物的使用 EGFREGFR突变状态已成为患者能否在一线使用突变状态已成为患者能否

3、在一线使用TKITKI药物的重要指标药物的重要指标 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 13 二、怎么做及注意事项二、怎么做及注意事项 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 14 目前较为常见的目前较为常见的RGFRRGFR突变检测方法突变检测方法 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 15 EGFREGFR突变检测中需要明确的几个基本概念突变检测中需要明确的几个基本概念 2 2、基因突变是指、基因突变是指DNADNA发生碱基序列的改变：发生碱基序列的改变：须选择有针对性的检测手段，针对非DNA 的检测手段如：RT-PCR（检测RNA表达），免疫组化（检测蛋白表达）以及针对

4、非碱 基序列的检测手段如：FISH（检测DNA的扩增、缺失、断裂、融合）等，均不适用。 体细胞突变体细胞突变 发生在非种系组织中 不具有遗传性 不会遗传给子代 种系突变种系突变 发生于精子或卵子中 可以遗传子代 子代所有细胞均带突变 1 1、EGFREGFR突变为体细胞突变：突变为体细胞突变：发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不含 突变。要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测，这是保证检测结果可靠的根本前提。 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 16 肿瘤细胞内及与正常组织间的异质性肿瘤细胞内及与正常组织间的异质性 片段化的片段化的DNADNA不

5、容易进行扩增不容易进行扩增 EGFREGFR突变检测中需要明确的几个基本概念突变检测中需要明确的几个基本概念 3 3、样品特性：异质性，突变细胞或、样品特性：异质性，突变细胞或DNADNA的含量一般较少，的含量一般较少，DNADNA经常会严重片段化经常会严重片段化 4 4、关键是保证突变、关键是保证突变DNADNA有效扩增至可检测的范围：扩增效率及检测方法的敏感性有效扩增至可检测的范围：扩增效率及检测方法的敏感性 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 17 1 1、TapMan TapMan 探针法：边扩增边检测探针法：边扩增边检测 优势优势 只检测突变的序列只检测突变的序列 敏感性高且

6、污染几率小敏感性高且污染几率小 不足不足 探针费用较高探针费用较高 只能针对已知突变只能针对已知突变 正常正常DNADNA的扩增无限制的扩增无限制 Nature Reviews Drug Discovery Nature Reviews Drug Discovery 20042004：3 3, 749-761749-761 突变突变DNADNA 有荧光信号有荧光信号 野生型野生型DNADNA 无荧光信号无荧光信号 特定的探针：只结合突变序列特定的探针：只结合突变序列 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 18 2 2、高分辨率溶解曲线（、高分辨率溶解曲线（HRMHRM）：扩增后再检测）：

7、扩增后再检测 优势优势 已知和未知突变序列已知和未知突变序列 敏感性高且污染几率小敏感性高且污染几率小 不足不足 正常正常DNADNA的扩增无限制的扩增无限制 对仪器设备的要求较高对仪器设备的要求较高 阳性结果还需进一步确认阳性结果还需进一步确认 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 19 3 3、变性高效液相色谱分析（、变性高效液相色谱分析（dHPLCdHPLC）：扩增后再检测）：扩增后再检测 优势优势 敏感性高敏感性高 已知和未知突变序列已知和未知突变序列 不足不足 仪器普及率低仪器普及率低 正常正常DNADNA的扩增无限制的扩增无限制 开盖检测增加污染几率开盖检测增加污染几率 阳性

8、结果还需进一步确认阳性结果还需进一步确认 检测环境需独立且通风良好检测环境需独立且通风良好 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 20 4 4、直接测序法：扩增后再检测、直接测序法：扩增后再检测 优势优势 直观且相对成本低直观且相对成本低 已知和未知突变序列已知和未知突变序列 不足不足 工作量大且敏感性低工作量大且敏感性低 开盖会增加污染几率开盖会增加污染几率 正常正常DNADNA的扩增无限制的扩增无限制 SangerSanger 测序法原理测序法原理 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 21 5 5、焦磷酸测序：扩增后再检测、焦磷酸测序：扩增后再检测 优势优势 适合已知序列适合

9、已知序列 已知和未知突变均可测已知和未知突变均可测 敏感性高、直观、能够定量敏感性高、直观、能够定量 不足不足 需要专用仪器需要专用仪器 正常正常DNADNA的扩增无限制的扩增无限制 开盖会导致污染几率增加开盖会导致污染几率增加 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 22 6 6、突变富集、突变富集PCRPCR：扩增后再检测（抑制正常：扩增后再检测（抑制正常DNADNA扩增）扩增） 优势优势 敏感性高（此消彼长）敏感性高（此消彼长） 不足不足 操作繁琐操作繁琐 只针对已知突变只针对已知突变 开盖导致污染几率增加开盖导致污染几率增加 不好找合适的限制性内切酶不好找合适的限制性内切酶 Cli

10、n Cancer ResClin Cancer Res 2006;12(1):43-48 2006;12(1):43-48 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 23 7 7、扩增阻滞突变系统（蝎形探针）：边扩增边检测、扩增阻滞突变系统（蝎形探针）：边扩增边检测 优势优势 敏感性高且污染几率小敏感性高且污染几率小 只扩增并检测突变的序列只扩增并检测突变的序列 不足不足 只针对已知突变只针对已知突变 试剂盒费用较高试剂盒费用较高 7272延伸延伸 9494解链解链 6060自身杂交发光自身杂交发光 ARMSARMS引物引物 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 24 各种突变检测方法

11、的综合比较各种突变检测方法的综合比较 1 1、操作流程、操作流程 2 2、污染几率、污染几率 3 3、敏、敏 感感 性性 4 4、可实施性、可实施性 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 25 我们最初采用的方法：直接测序法我们最初采用的方法：直接测序法 选择的理由选择的理由 结果直观易懂结果直观易懂 大量文献支持、金标准大量文献支持、金标准 实验室条件能够满足要求实验室条件能够满足要求 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 26 注意事项：注意事项：DNADNA抽提部分抽提部分 新鲜组织新鲜组织体液（胸水或血浆）体液（胸水或血浆）石蜡包埋组织石蜡包埋组织 提取过程约提取过程约1

12、1小时小时提取过程约提取过程约1 1小时小时提取过程约提取过程约3 3小时小时 1 1、DNADNA提取之前的病理质量控制非常重要，它决定了最终检测结果的可靠性提取之前的病理质量控制非常重要，它决定了最终检测结果的可靠性 2 2、尽可能使用认可程度高的试剂，以保证、尽可能使用认可程度高的试剂，以保证DNADNA的提取效率（的提取效率（TaKaRa DEXPATTaKaRa DEXPAT） 3 3、严格按照说明书要求保存试剂（温度、湿度等），以免试剂失效、严格按照说明书要求保存试剂（温度、湿度等），以免试剂失效 4 4、可按自身需求对操作流程做适当修改，但要形成、可按自身需求对操作流程做适当修改

13、，但要形成SOPSOP操作规范（操作规范（示例示例1 1、2 2） 5 5、DNADNA提取区域与提取区域与DNADNA扩增后的分析区域要完全分隔，以避免气溶胶污染扩增后的分析区域要完全分隔，以避免气溶胶污染 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 27 注意事项：注意事项：PCRPCR扩增部分扩增部分 1 1、DNADNA质量控制非常重要，可保证后续实验的顺利进行（模板过量、质量控制非常重要，可保证后续实验的顺利进行（模板过量、PCRPCR抑制剂）抑制剂） 2 2、设置好阴性对照（避免污染）和阳性对照（验证实验体系，必要时可取消）、设置好阴性对照（避免污染）和阳性对照（验证实验体系，必要

14、时可取消） 3 3、选用保真性较高的、选用保真性较高的TaqTaq酶，避免由实验体系带来的假阳性酶，避免由实验体系带来的假阳性 4 4、做好详细的实验记录，为以后的各种分析提供依据（、做好详细的实验记录，为以后的各种分析提供依据（示例示例） Marker Marker 百倍稀释百倍稀释 原液原液 空白空白 Marker Marker 空白空白 19 2119 21Marker Marker 空白空白 19 2119 21 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 28 注意事项：注意事项：PCRPCR扩增部分扩增部分 原来的原来的1919号外显子巢式号外显子巢式PCRPCR引物引物 原来的原

15、来的2121号外显子巢式号外显子巢式PCRPCR引物引物 N Engl J MedN Engl J Med 2004;350:2129-39 2004;350:2129-39 改进后的改进后的1919号外显子巢式号外显子巢式PCRPCR引物引物 改进后的改进后的2121号外显子巢式号外显子巢式PCRPCR引物引物 5 5、巢式、巢式PCRPCR并非必须，如果并非必须，如果DNADNA的质量足够好，可以选择一次的质量足够好，可以选择一次PCRPCR 6 6、不必迷信权威文献中的实验条件，实践是检验真理的唯一标准、不必迷信权威文献中的实验条件，实践是检验真理的唯一标准 解放军307医院EGFR突变

16、检测经 验分享 29 注意事项：结果分析部分注意事项：结果分析部分 早期的报告早期的报告现在的报告现在的报告 报告力求简洁明了，不仅有检测结论还要有可靠的事实依据报告力求简洁明了，不仅有检测结论还要有可靠的事实依据 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 30 注意事项：结果分析部分注意事项：结果分析部分 检测结果随时归档，以备日后查询、统计检测结果随时归档，以备日后查询、统计 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 31 三、临床问题的解决：转化性研究三、临床问题的解决：转化性研究 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 32 转化医学转化医学 转化医学：以患者为中心，建立临床治

17、疗和基础研究间的双向通道，转化医学：以患者为中心，建立临床治疗和基础研究间的双向通道，从临床工作中发现从临床工作中发现 和提出问题，和提出问题，寻找或建立相应的解决方案，然后将其应用于临床，解决临床的实际问题寻找或建立相应的解决方案，然后将其应用于临床，解决临床的实际问题 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 33 测序法敏感性不足将导致假阴性结果测序法敏感性不足将导致假阴性结果 F Hirsch, et al. JCO 2006F Hirsch, et al. JCO 2006 C Zhu, et al. JCO 2008C Zhu, et al. JCO 2008 T Mok, et

18、 al. Discovery Med 2009T Mok, et al. Discovery Med 2009 ISEL ISEL BiomarkerBiomarker1 1 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 34 阿斯利康第四期阿斯利康第四期EGFREGFR突变检测培训班突变检测培训班 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 35 ADx-ARMSADx-ARMS：边扩增边检测且保证突变序列的有效扩增：边扩增边检测且保证突变序列的有效扩增 ARMSARMS引物引物 第一轮扩增第一轮扩增 6464退火退火 保证特异性保证特异性 第二轮扩增第二轮扩增 6060退火退火 保证扩增效率

19、保证扩增效率 扩增特异性扩增特异性 由一轮引物保证由一轮引物保证 突变荧光信号：突变荧光信号：FAMFAM 内控荧光信号：内控荧光信号：HEXHEX或或VICVIC 外控荧光信号：外控荧光信号：FAMFAM 阳性对照：内含阳性质粒阳性对照：内含阳性质粒 阴性对照：蒸馏水阴性对照：蒸馏水 内外控均检测内外控均检测EGFREGFR基因基因2 2号外显子号外显子 体系中含特殊石蜡避免气溶胶污染体系中含特殊石蜡避免气溶胶污染 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 36 ADx-ARMSADx-ARMS试剂盒的判读流程试剂盒的判读流程 是否污染是否污染 实验体系实验体系 DNADNA质量质量 DNADNA含量含量 结果判读结果判读 参数设置参数设置 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 37 ADx-AMRSADx-AMRS和和Dxs ARMSDxs ARMS试剂盒的比较试剂盒的比较 阿斯利康中国创新研究中心与张绪超阿斯利康中国创新研究中心与张绪超/ /吴一龙教授等合作共同完成吴一龙教授等合作共同完成 解放军307医院EGFR突变检测经 验分享 38 测序法和测序法和ARMSARM