生物传感器的制备及应用

1、生物传感器的制备及应用摘要 生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术。因其具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、在复杂的体系中进行在线连续监测,特别是它的高度自动化、微型化与集成化的特点,从最先提出生物传感器的设想至今,其在近几十年获得蓬勃而迅速的发展。在国民经济的各个部门如食品、制药、化工、临床检验、生物医学、环境监测等方面有广泛的应用前景。特别是分子生物学与微电子学、光电子学、微细加工技术及纳米技术等新学科、新技术结合,正改变着传统医学、环境科学动植物学的面貌。关键词 生物传感器 应用 纳米材料一、生物传感器的原理生物传感器主要是由生物识

2、别和信号分析两部分组成的生物识别部分是由具有分子识别能力的生物敏感识别元件构成,包括细胞、生物素、酶、抗体及核酸等1。信号分析部分通常又叫做换能器,它们的工作原理一般是根据物质电化学、光学、质量、热量、磁性等。物理化学性质将被分析物与生物识别元件之间反应的信号转变成易检测、量化的另一种信号,比如电信号、焚光信号等,再经过信号读取设备的转换过程,最终得到可以对分析物进行定性或定量检测的数据。生物传感器识别和检测待测物的一般反应过程为:首先,待测物分子与识别元素接触;然后,识别元素把待测物分子从样品中分离出来;接着,转换器将识别反应相应的信号转换成可分析的化学或物理信号;最后,使用现代分析仪器对输

3、出的信号进行相应的转换,将输出信号转化为可识别的信号。生物传感器的各个部分包括分析装置、仪器和系统也由此构成。生物传感器中的识别元素决定了传感器的特异性,是生物定性识别的决定因素;识别元素与待测分子的亲合力,以及换能器和检测仪表的精密度,在很大程度上决定了传感器的灵敏度和响应速度。二、生物传感器的分类根据所用换能器和监测物理量、化学量和生物量可分为电化学生物传感器2、光学生物传感器3和压电生物传感器4等。1、光学生物传感器光学生物传感器是基于待测物能够引起传感器表面某种特定指示剂光吸收率或光传播发生反射、折射、散射等性质的变化进行设计的。大量光学生物传感器已经见诸报道,Borisov等5对近年

4、来光学生物传感器的发展和应用进行了综述。表面等离子共振(SPR)生物传感器是一种常用的光学生物传感器。其光源为偏振光,传感芯片表面镀有一层金膜,金膜与微流体流动系统相联,当金膜表面键合了目标分析物后,检测器能够跟踪溶液中的分子与芯片表面的分子结合、解离整个过程的变化。SPR生物传感器能实时监测生物分子间的相互作用,且不需要复杂的标记,因此被广泛应用于蛋白质组学、临床诊断以及食品安全等领域。2、电化学生物传感器6电化学生物传感器通常包括电流型电位型和电阻型三种类型。它的工作原理是由于待测物的引入使得传感器表面发生物理或者化学变化,这些变化经电化学转换器将其转化为可检测的电信号。销电极、金电极和玻

5、碳电极是最常用的工作电极,一方面是因为它们具有良好的导电性;另一方面,它们容易处理,在检测过程尤其是生物检测过程中对待测物无污染。丝网印刷电极也是一种常用的工作电极,常用作电位生物传感器,电位生物传感器(在零电流下产生电压)能够在很宽的动力学范围内给出相应的对数响应。这种电极虽然只有两个电极,但是具有很高的灵敏度及良好的稳定性,而且即使分析物的制备过程不是很严格,也可以对分析物的检测达到同用HPLC和LC/MS技术相同的水平。电化学生物传感器因其检测灵敏度高、操作简便快捷、省时、成本低及所需仪器简单等优点受到广大科研人员的研究兴趣3、压电生物传感器7压电生物传感器是一种质量敏感型生物传感器,它

6、利用对电压敏感的石英晶体产生弹性形变而引起其本身共振频率产生变化来进行检测的。传感过程中交流电压(AC)在晶体中产生驻波的特征频率,这个特征频率依赖于晶体的弹性形变。当表面覆盖有生物识别元素的受体键合上目标分析物后,引起晶体共振频率的改变,这样就能获得检测信号。三、生物传感器的应用1、生物传感器应用于医学检测(1)生物传感器对葡萄糖的检测8,9人体中血糖的浓度正常值为3.96.0 mmol/L,对血液中葡萄糖的检测研究一直是生物传感器发展的主要方向。Park等将葡萄糖氧化酶固定在肽纳米管上制备了一种安培传感器,借助金纳米粒子的放大作用,在低于人体正常血糖浓度范围内(0.5-2.4 mmol/L

7、)该传感器可以对葡萄糖进行检测。Wang等利用Mg-Al-C03能使发光氨在弱酸性(pH 5.8)溶液中产生化学发光的现象对更低浓度(检测线性范围是0.005-1.0mmol/L,检测限为0.1 mol/ L)葡萄糖成功实现了检测;Wu等用电化学沉积的办法制备了普鲁士蓝/Bi2Se3传感器,在葡萄糖氧化酶的催化下,该传感器对葡萄糖的检测范围为0.01-11mmol/L,适合用于对正常人体血糖浓度或者血糖浓度稍微偏高或偏低者进行检测;Li等使用金纳米粒子和聚啦咯纳米纤维构建了一种非酶葡萄糖传感器,该传感器对葡萄糖的检测范围为0.2-13 mmol/L,相对于酶传感器来说,该传感器更稳定;Wu等使

8、用Ag纳米粒子制备了在生理环境下能进行显色检测的SPR传感器,该传感器可以对更宽浓度范围的葡萄糖(0-20 mmol/L)进行检测; Yilmaz等经过进一步研究获得了一种可以使用葡萄糖氧化酶或氧化葡萄糖酸杆菌作为灵敏元件的电化学生物传感器,该传感器可以分别对较高浓度血糖(葡萄糖氧化酶:2-16 mmol/L,葡萄糖酸杆菌:1.5-25 mmol/L)实现检测,提高了对血糖浓度检测的可信度。大多数葡萄糖生物传感器的检测原理是基于葡萄糖发生氧化还原反应生成同等浓度的过氧化氢和葡萄糖酸,因此也可以通过检测H2O2实现对葡萄糖的间接检测。Yang等使用银纳米线构建了一种传感器,该传感器对低浓度H2O

9、2 (20 nmol/L-3.62 mmol/L)表现出良好的线性;Wang等用Pt多孔纳米线制备了一种安培计传感器,该传感器对H2O2的检测范围为4.5mmol/L-27.1 mmol/L,既降低了检测限,又拓宽了线性范围;Li等用Mg-Fe双层氢氧化物将血红素蛋白固定在玻碳电极表面制备了一种电化学传感器,进一步降低了 H2O2的检测限(0.036 mol/L)。(2)生物传感器对癌细胞的检测10,11,12癌症严重危害了人类的生命健康,是造成人力资源丧失的主要原因之一,严重影响着社会发展。对目标细胞的直接检测可以实现对疾病的监测,这也是近年来各国科学家努力的方向。一般来讲,电化学细胞传感器

10、主要是基于测定细胞吸附于传感器界面引起的电流和阻抗变化,从而对细胞状态和数量实现间接的分析测定。电化学阻抗和循环伏安法常被用于监测癌细胞的點连、活性、增殖和调亡等生理过程。Cheng等人发展了一种基于辣根过氧化物酶与糖类化合物特异性结合的电化学细胞传感阵列,用于细胞表面糖组碳水化合物的动态分析。由于细胞表面呈现负电性,在一些研究中,人们通过构建正电性的传感界面,基于静电相互作用实现细胞的固定和检测。然而这种基于静电作用只能实现细胞的非特异性固定,多数应用于细胞的生理状态监测,以及药物筛选方面的研究,并不能够满足医疗诊断和治疗方面的需求。因此,人们越来越关注于构建具有特异性识别功能的细胞传感器用

11、于癌细胞的选择性检测。肿瘤标志物如核仁素、叶酸受体等的反常性特征与很多癌症密切相关,因而常被选作紀向分子用于设计能够选择性检测肿瘤细胞的细胞传感器。例如,Feng等基于适配体AS1411对癌细胞表面过表达的核仁素特异性识别能力构建了一种选择性电化学细胞传感器。通过测定修饰电极的电荷转移电阻的变化从而间接检测固定的癌细胞数量。由于多数肿瘤细胞的细胞膜表面具有过表达的叶酸受体,因而对叶酸受体具有高度亲和性的叶酸也常被用作特异性识别癌细胞的功能性分子构建癌细胞传感器。Li等将叶酸修饰到电化学整流器界面,首次实现了基于分子器件高灵敏度检测Hela细胞,实现了在大量正常细胞(104个细胞/mL)存在下选

12、择性检测其中10个Hela细胞,检测范围101-106个/mL。构建具有特异性识别功能细胞传感器的研究目前仍处于早期阶段。(3)生物传感器对DNA的检测13,14许多疾病的发生与DNA碱基突变有关。核酸碱基突变在癌症的发生中也起着不可忽视的作用,因此发展高灵敏度检测DNA的方法一直是相关领域专家共同关注的问题。在分析领域,各国工作者利用核酸适配体、纳米材料等构筑了一系列生物传感器用于DNA的检测,目前DNA的检测限通常在nmol/L,借助新材料结果可达pmol/L,甚至fmol/L。Ren等根据核酸自身的性质构建了一种对染料敏感的四极子来检测目标DNA,在目标DNA的浓度范围5-200 nmo

13、l/L内该突光传感器显示出良好的线性;Sharma等使用CdTe量子点和壳聚糖制备了一种检测白血病DNA的电化学生物传感器,该传感器对目标DNA的检测限可达2.56 pmol/L; Chung等使用多壁碳纳米管进一步构建一种高灵敏电化学传感器,该传感器可以在0.1-100 pmol/L范围内对目标DNA获得良好的线性,检测限更是低至0.031 pmol/L。(4)生物传感器对其他疾病检测15,16,17近年来也发展了对人体内其他疾病进行有效检测的方法。级毛膜促性腺激素(HCG)是一种妊娠激素,检测值的大小可以直接反应女性怀孕天数,非孕女性血HCG正常值不超过10 g/L, Marquina等使

14、用磁性纳米粒子制备了GMR传感器,该传感器能够有效的用于对HCG的检测;凝血酶是一种重要的蛋白质,在机体内通常是不表达的,表达的凝血酶通常与某些疾病的发生有关,Lee等使用适配子-量子点功能化的纳米纤维制备了一种突光传感器,对凝血酶的检测限达到了 10 pmol/L,当上述传感器的量子点用突光染料代替后,检测范围变成10-200 nmol/L,检测限为1 nmol/L;尿酸是呤代谢的一种产物,血尿酸的高低与痛风有直接关系,成人体内尿酸正常值为90-420 nmol/L。Jindal等用CuO制备了一种传感器,在脲酶的催化作用下,该传感器能够对0.05-1 mmol/L浓度范围内的尿酸进行检测;

15、癌胚抗原(CEA)是血清中的一种糖蛋白,可以用于检测肿瘤发展情况,正常人体内癌胚抗原浓度不超过5 ng/L, Lin等使用金纳米粒子构建了一种突光传感器,该传感器可对0.1-10 ng/ml浓度范围内的CEA进行很好的检测;ATP是生物体内一种重要的能量分子,生物体内ATP含量的多少可以直接反应生物体的状态,正常细胞和组织裂解液中ATP浓度为0.1-1mol/L, Zhou等设计了一种基于电化学发光能量共振转移的适配子量子点传感器来检测ATP,可以检测至浓度185 nmol/L。由此可见生物传感器在检测中有着广泛的应用范围,随着新材料、新方法的不断发展,其在疾病检测中的应用将有更为广泛。2、生

16、物传感器用于食品检测18,19食品安全问题严重影响着人类的身体健康,对食品中各种有毒物质的检测也变得越来越复杂。生物传感器的使用使得检测方法更简单,检测结果更可靠。氨必妥又名瘦肉精,长期接触或食用会引起人体心律失常等疾病,使用银纳米粒子和石墨稀氧化物构建了一种电化学免疫传感器,在含量0.01-10ng/ml范围内该传感器可对氨必妥进行有效的检测,检测限低至6.8 pg/ml;亚硫酸盐被用作多种食品添加剂,因为它们可以防止抑制微生物的活性从而延长食物保持新鲜色泽的时间,但是摄入含亚硫酸盐食品或饮料容易导致呼吸困难、呼吸急促、哮喘、咳嗽等呼吸道疾病,高浓度的亚硫酸盐还能造成死亡,国家标准中规定不同

17、食品中亚硫酸盐残留的要求浓度不同:从0.05-0.4 g/kg。Frasca等使用金纳米粒子构建了一种电化学传感器,在人亚硫酸盐氧化酶的催化作用下,该传感器对食品中亚硫酸盐具有良好的选择性,检测线性范围是0.005-5.4 g/kg,可以用于对食品中亚硫酸盐的检测。大肠杆菌(E.coli)是一种广泛存在的细菌,对人类和动物都很重要,生活饮用水的水质标准是不超过3个/L。由于突变的出现,新的菌属越来越多。对健康成年人来说,陌生菌株的危害并不大,但是对于幼儿或者使用某些药物的病人来讲,它们就有潜在的很大威胁,例如E.coli 0157: H7是一种非常危险的菌株。Wang等使用磁性纳米粒子构建了一

18、种信号放大的表面等离子共振生物传感器,该传感器对E.coli0157: H7表现出非常好的检测性,检测限为50 CFU/ml,是一般SPR检测技术的4倍;Guo等使用金纳米粒子功能化的压电免疫生物传感器成功实现了对E.coli 0157: H7的检测,检测范围为0-1 log CFU/ml3、生物传感器用于环境监测20,21,22环境污染问题在近年来变得日趋严重,生物传感器也已经被广泛的用于大气污染、水污染等方面的检测。甲酸是化工工业的重要原料,在人们的日常生活被广泛的使用,如建筑涂料、装饰材料等。由于其较低的溶沸点和良好的水溶性,甲酸常以气态或液态的形式存在于自然界中。过量的甲酵会对人类的呼

19、吸系统和消化系统产生极大的危害,尤其是对呼吸系统有巨大的毒性,用生物传感器可以实现对甲酵的快速检测,根据中华人民共和国国家标准,居室中甲酸的最高值为0.08 mg/m3,一次性食入甲醛超过10 mg就可能引起死亡,水中甲酸含量最高位1 mg/L。Kataky组使用亲脂性的四硫富瓦稀-四氰基对苯二醌二甲烧(TTF-TCNQ)盐作为媒介体,将甲酵脱氧酶固定在聚氨酷膜上构建了一种丝网印刷生物传感器,该传感器可实现对空气中甲酸的测定,检测的线性范围是从10-3-10-4 mol/L;将乙醇氧化酶固定在相互交叉平面薄膜电极上构建了一种电导型酶生物传感器,该传感器对甲醒的检测范围是1.5-15000 mg

20、/L; Xu等使用甘氨酸作为伯胺提供者来检测水产品中的甲酸含量,在检测范围从0.3-0.75 mg/ml之间获得了良好的线性相关系(R2=0.999),测得样品中甲醒的含量为1.2mg/kg。水质监测包括很多方面,包括水体中无机有毒物和有机物检测。无机有毒物检测包括悬浮物、非金属有毒物质(如氰化物、砷)及金属毒性离子(如汞、铬、镉、铜、镇)等的检测;有机物检测包括生化需氧量(BOD)、农药及微生物代谢物等的检测。以往的检测都涉及大型仪器及复杂的操作步骤,利用生物传感器可以实现灵敏、简便、及时快速检测。长期饮用含铜、砷等毒性物质的水,会导致人或动物中毒,严重的会导致死亡。中华人民共和国对污水中总

21、铜和总神的排放要求最高为0.5 mg/L, Lin等制备了一种功能化聚吡咯纳米管电化学传感器,该传感器对水体中Cu2+显示出了良好的选择性,检测范围是0.0064-1.92 mg/L; Wu等用金纳米粒子构建了基于核酸适配子的生物传感器,该传感器对As (III)的检测范围是0.001-1.5 mg/L,目测下检测限为0.04mg/L,色谱检测限为0.6g/L,说明该传感器可以很好的用于水中砷的检测。微囊藻毒素是一种蓝绿藻产生的毒素,可通过饮用水使人类中毒,国际卫生组织规定生活饮用水中微囊藻毒素的最高含量为0.001 mg/L,Shi等用石墨炼氧化物成功构建了一直焚光能量共振转移的传感器,该传

22、感器对微囊藻毒素的检测限是0.5g/L; BOD是表示水中有机需氧污染物含量的一个重要指标,国际标准检测法是用5天时间,表示为B0D5,检测范围在2100000 mg/L,纯水的B0D5为13 mg/L,高于10 mg/L说明水质很差,一般工业废水B0D5最高容许排放值为20 mg/L, Chang等用微生物燃料电池构建了一种可以进行实时监测BOD的生物传感器,该传感器在1.05h对废水中的BOD的检测值可达l00mg/L,大大缩短了检测时间;我国是世界上最大的农药生产国,农药年产量达200万吨,而有机 杀虫剂的产量约占50%,有机磷杀虫剂是一类有毒的农药,其本身和分解过程的中间体不仅会对人或

23、动物产生致癌、致畸作用,甚至会引起基因突变等,生产有机磷农药的过程中会产生大量污水对水体造成污染,有机 农药的大量使用也会造成水体的污染,因此对有机 农药的监测一直是社会的焦点,我国对工业废水中有机磷农药的排放标准规定为0.2 mg/L, Gong等用碘氧化秘制备了一种光电化学传感器,在乙酰胆碱酯酶的催化作用下,该传感器对有机磷杀虫剂的检测限为40ng/L,大大提高了对有机 杀虫剂的检出效率。生物传感器在近年来得到了迅速发展。针对识别元素种类的千差万别,生物传感器对目标物的特异性更强,对同一目标物的检测方法也多种多样。随着换能器质量的不断提高,生物传感器的灵敏度也获得极大提高。这些不仅推动着社

24、会的发展,也推动着人类健康的发展。另一方面,由于生物传感器种类的多样性,还存在很多尚需解决的问题,寻找和开发新型识别元素的步伐从未停息。参考文献1 Ben-Yoav H, Melamed S, Freeman A, et al. Whole-cell biochips for bio-sensing : integration of live cells and inanimate surfaces J. Crit. Rev. Biotechnol., 2011, 31 (4): 337-353.2 Chung D-J, Whittaker A K, Choi S-H. Electrochem

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