PI染色法测细胞周期PI染色法测细胞周期

1、PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 PI染色法测细胞周期染色法测细胞周期 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 n正常人静止体细胞有46条染色体，相当 于7.10-12 pg DNA/细胞核，我们称之为 二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不 同的DNA含量。在细胞周期(G0，G1，S， G2 ，M)的各个时期，DNA含量随各时相 呈现出周期性的变化：在G1期，细胞开 始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保 持二倍体； PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 n进入S期后，DNA开始合成，这时细胞核内DNA 的含量介于G1和G2期之间；当DNA复制结束成 为4倍体时，细胞进入G

2、2期，G2期细胞继续合 成RNA及蛋白质，直到进入M期，因此，单纯从 DNA含量无法区分G2期和M期；一旦有丝分裂发 生，细胞分裂成两个子细胞，这两个子细胞或 者进入下一个细胞周期，或者进入静止期(G0 期)，而G0期从DNA含量上同样无法与G1期区分。 因此，整个复制周期可以描述为G0/G1，S， G2/M期。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 n通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪 进行分析，可以得到细胞各个时期的分 布状态，计算出G0/G1，S及G2/M的百分 含量，了解细胞的增殖能力；结合DNA指 数分析，还可进行凋亡、异倍体等检

3、测。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 0 200 400 600 8001000 DNA content C o u n t Normal Cell Cycle PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 n染料的选择取决于流式激光的配置。 488nm的激光下应用PI(碘化丙啶)，由于 PI也与RNA结合，所以分析前样本应用 Rnase处理.。重要的是染料要足够，以 保证饱和结合。PI的推荐浓度是至少 20ug/10 6 个细胞。其最佳浓度为 50ug/106 个细胞。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 细胞浓度及质量要求 n单细胞和核的上机浓度应约106/ml。浓度 太

4、低，上机时样本的流速不得不提高， 这样就会影响检测的CV。浓度太高，则 可能导致染料的相对不足，最终使染色 不饱和，同样影响CV和检测结果。 n制备完成后的标本应用光学显微镜检查 其质量：细胞是否聚集或过多的碎片。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 操作步骤操作步骤 n取一瓶生长期的A549细胞，倒掉瓶中旧的培 养液，加入3mlPBS，细胞生长面在下轻轻晃 动细胞瓶，然后去掉液体，加入1ml胰蛋白酶 消化15分钟（以镜下观察决定） n加入5mlPBS轻轻吹打细胞生长面，制成细胞 悬液，将细胞悬液移至15ml离心管中 1500rpm离心5min，去上清。 n加入500ulPBS轻轻吹打

5、细胞团成细胞悬液， 在旋涡状态下逐滴加入2ml-2095%冷乙醇， 混匀后固定30min。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 n加入5mlPBS，1500rpm离心5min，去 上清液。 n加入5mlPBS重悬细胞，1500rpm离心 5min，去上清液。 n加入800ulPI染液，用枪轻轻吹打细胞 团，混匀，室温避光染色30min n上机检测。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 影响荧光染色的因素影响荧光染色的因素 n温度：温度高于20时，即出现温度淬 灭。 n2、PH：PI在7.27.6，保持荧光染料分 子与溶剂间的电离平衡。 n3、荧光染料浓度：染料太少，结合不完 全

6、。染料过多，又会出现浓度淬灭现象。 n4、固定剂：醛类固定剂会干扰插入性染 料与核酸分子的结合，造成荧光发射强 度减弱。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 什么是流式细胞仪 n流式细胞仪(Flow Cytometer 简称FCM) 是一项集激光技术电子物理技术光 电测量技术计算机技术以及细胞荧光 化学技术单克隆抗体技术为一体的新 型高科技仪器。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 什么是流式细胞术 n简单说就是自动化的萤光显微镜 n测定分析悬浮于液流中的颗粒在通过激 光束时发出的光学信号的一个系统 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 流式细胞仪特点及检测标本 n特异性

7、强，灵敏度高，速度快，并能实 现多参数分析； n可检测的样本种类多样 n(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实 体组织，培养细胞 n(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 流式细胞仪的结构 n液流系统 n将细胞引导至检测点 n光学系统 n产生并收集光学信号 n电子系统 n将光信号转换成电信号，使之数字化，输入 计算机并分析 n分选系统 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 液流系统 n流动室 n鞘液 n酸碱平衡的电解液，可选PBS、血球稀释液 或蒸馏水。 n样本流 n单细胞悬液，浓度51051 106/mL PI染色法测细胞周期PI染色法测细

8、 胞周期 液流系统 n-FLOW CELL(流动室)：是仪器的核心部件， 被测样品在此与激光相交。 Injector Tip 荧光信号 聚焦的激光光束 鞘液鞘液 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 光学系统 n光学激发系统 n激光 激光 (Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相 干光源，它能提供单一波长、高强度及稳定性高的 光照 n488nm，635nm n光学信号 n光学收集系统 n光学滤片 n透镜 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 光学信号 n光学信号有两种 n1.散射光信号：

9、前向角散射光 (FSC,Forward Scatter) 侧向角散射光 (SSC,Side Scatter) n2.荧光信号(488nm,635nm) PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 光学信号 n信号产生-散射光信号 n当颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方 向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射 光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向 角散色光信号（SSC）。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 光学信号光学信号 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 光学信号 n信号产生 n前向角散射光信号(FSC)：反应了细胞或颗 粒大小的不同。 n侧向角散射光信号(SSC)：

10、反应了细胞或颗 粒内部的复杂程度或颗粒性的不同。 n散射光不依赖任何细胞样品的制备技术（如 染色），因此被称为细胞的物理参数，反应 细胞的大小和内部结构。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 前向角散射光信号前向角散射光信号 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 侧向角散射光信号侧向角散射光信号 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 n双参数散点图 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 信号产生-荧光信号 n荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束 时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态 时，染料释放出能量，大部分以光的形式释 放。这种发射出的光称为荧光。 PI染色法测

11、细胞周期PI染色法测细 胞周期 n荧光信号 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 荧光信号 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 荧光信号 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 光学收集系统 nFCM的光学系统是由若干组透镜, 滤波 片, 小孔组成 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 光学收集系统 n滤片 n长通滤片（LP）：长于设定波长的光通过， 并反射短于设定波长的光 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 n短通滤片(SP):只允许特定波长以下的光 通过。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 流式细胞仪 带通滤片（BP）：允许一定带宽波长的光 通过。

12、 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 光学系统 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 基本图形 n单参数直方图：细胞每一个单参数的测 量数据可整理成统计分布，以直方图来 显示。 n双参数数据图：用于表达同一细胞两个 参数与细胞数量间的关系。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 流式细胞术的应用 n细胞生理学研究 n细胞膜表面标记 n胞内标记 n细胞周期分析 n凋亡分析 n分选 nCBA PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 细胞生理学研究 n细胞相对大小和颗粒性 n胞内pH值检测

13、 nCa+流动性检测 n膜电势检测 n细胞活性检测 n细胞活力(增殖能力)的检测 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 荧光信号的面积和宽度 n所谓荧光信号的面积是采用对荧光光通 量进行积分测量，一般对DNA倍体测量时 采用面积（如FL2-A),这是因为荧光脉冲 的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映 DNA的含量，当形状差异较大，而DNA含 量相等的二个细胞，得到的荧光脉冲高 度是不等的，经过对荧光信号积分后， 所得到的信号值就相等。 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 n宽度（FL2-W）常用来区分双联体细胞。 由于DNA样本极容易聚集，当两个G1期细 胞粘连在一起时，其测量到的DNA荧光信 号（FL2-A）与G2期细胞相等，这样得到 的测量数据G2期细胞比例会增高，影响 测量准确性 PI染色法测细胞周期PI染色法测细 胞周期 ModFit LT n是由美国Verity Software House 公司设计， 专门用于流式细胞术中进行细胞周期分析的软 件。它通过对DNA 含量直方图进行曲线拧合， 能快速计算出分析细胞周期各时相细胞的含量、 G1/S/G2+M 细胞的百分比，并测量肿瘤细胞的