基于ITS序列分析的外生菌根真菌的分子鉴定研究

1、题 目：基于ITS序列分析的外生菌根真菌的分子鉴定研究摘 要本实验是利用采自内蒙古贺兰山的外生菌根真菌子实体作为研究对象，通过常规CTAB法对该子实体进行基因组DNA提取，并利用真菌特有的引物ITS1F和ITS4对特异的DNA片段进行PCR扩增，将扩增产物在浓度为1%的琼脂糖凝胶中电泳进行检测，并在紫外透射反射分析仪下观察检测的结果，对于较好的扩增产物利用回收试剂盒进行纯化，后将纯化产物送由上海生工进行DNA测序，将测序所得到的序列输入GeneBank数据库中的局部相似性查询（Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)程序进行比对，列出数据库中与所测得到的

2、序列同源性较高的序列信息并进行分类鉴定，然后运用软件raxmlGUI进行系统发育树构建。最终的研究结果显示该菌种属于报道的choiromyces helanshanensis。 关键词：外生菌根真菌；ITS序列；分子生物学；鉴定AbstractIn this experiment, an ectomycorrhizal fungi collected from Helan Mountain, Inner Mongolia, was used as the research object. The extraction of genomic DNA of the fruiting body of

3、 ectomycorrhizal fungi was carried out by the conventional CTAB method. The specific primers ITS1F and ITS4 were used to amplify the specific DNA sequences by PCR amplification. The amplified products were tested by electrophoresis with a 1% agarose molecular biology grade gel, and the results of th

4、e gel were observed under the ultraviolet transmission reflectance analyzer. The better amplification products were purified by using a recovery kit. Then, the purified products were sent to Shanghai Shenggong for DNA sequencing. The sequence obtained by sequencing was input into the Basic Local Ali

5、gnment Search Tool(BLAST) program in the GeneBank database for comparsion. In the database, find out the sequences with higher homology with the sequenced sequences and perform the classification and identification. The phylogenetic tree was constructed by using the software raxmlGUI. The final resu

6、lts showed that the strain belongs to the reported Choiromyces helanshanensis in Helan Mountain, Inner Mongolia.Key words：ectomycorrhizal fungi; ITS sequence; molecular biology; identification目 录引 言11 材料与方法31.1 实验材料31.2 实验设备及药品31.2.1 试剂配方31.3 实验方法31.3.1 基因组DNA的提取31.3.2 rDNA ITS区段的PCR扩增41.3.3 PCR扩增产物

7、的回收和纯化51.3.4 DNA测序分析52 结果与分析62.1 PCR产物的检测62.2 提纯效果的检测62.3 rDNA ITS序列的同源性分析72.4 raxmlGUI系统发育树分析93 结论与讨论10参考文献11致 谢12引 言贺兰山坐落于宁夏回族自治区的西北部，是银川平原的原始屏障，也是三北防护林建设的重点地段1贺永喜.贺兰山麓野生食(药)用真菌资源调查初告J.中国食用菌,2003(03):7-9.。贺兰山植被类型比较复杂，既有标志山地所在水平地带属性的草原和荒漠，也有山地植被垂直系列中出现的针叶林和稀疏草原，还有各种灌丛、草甸和落叶阔叶林李娟.内蒙古自治区贺兰山国家级自然保护区森林

8、资源动态分析J.内蒙古林业调查设计,2013,36(01):42-43.。贺兰山是我国西北部温带草原与荒漠的分界线，同时也是连接蒙古高原、青藏高原及华北植被区系的重要枢纽。因特殊地理位置及气候条件越来越受到国内学者的重视。同时独一无二的地理位置、地形地势和天然气候条件及丰富多样的生态系统造就了贺兰山丰富的真菌资源孙丽华. 贺兰山（宁夏）大型真菌多样性及其营养成分的研究D.内蒙古农业大学,2012.。青海云杉、油松等为组分的森林大约在贺兰山2000m以上。由于贺兰山的特殊地势，对贺兰山真菌资源进行研究调查和保护发展就显得迫切需要王宽仓,查仙芳.宁夏贺兰山真菌J.宁夏农林科技,2000(S1):4

9、8-51.。菌根（Mycorrhizae）是真菌与植物的根系形成的具有一定的形态和功能的共生体许美玲,孙军德,朱教君,康宏樟.树木外生菌根真菌多样性研究方法进展J.土壤通报,2005(06):155-160.，能够促进林木吸收营养元素。外生菌根真菌（Ectomycorrhizal fungi，EMF)是森林生态系统的重要成员之一，能与6000多种树木形成菌根，对维持生态系统的功能和生物多样性具有不可代替的作用耿荣,耿增超,黄建,和文祥,侯琳,佘雕,韩其晟,龙东风.秦岭辛家山林区锐齿栎外生菌根真菌多样性J.菌物学报,2016,35(07):833-847.。面临我国林木连作后生产力明显下降的近况

10、，研究外生菌根真菌在这个过程中发挥到底着怎样的作用，首先要明确外生菌根真菌群落的组成情况和物种多样性武斌. 东北落叶松外生菌根真菌物种多样性及与土壤因子的关系D. 中国科学院大学, 2013. 。正是因为外生菌根真菌具有丰富的物种多样性，所以宿主植物才能适应各种不同的恶劣环境的影响，并能充分地利用土壤中的各种化学元素和养分。大量的研究表明，在森林的生态系统中，如果外生菌根真菌较少，则会影响森林中植被的生长和发育。外生菌根真菌能促进森林生态系统发挥其自我调节和更新功能，并协助维持森林生态系统的稳定。诸多研究表明，植被的生长通常受到重金属的胁迫，而外生菌根真菌则可产生大量的有机酸来消除这种重金属，

11、降低重金属的有害作用乌仁陶格斯,王娟,昭日格,苏楞高娃.外生菌根生态学研究进展J.安徽农业科学,2018,46(06):26-28+36.。传统的菌种的分类鉴定通常是采用形态学和解剖学相结合的方法，即以观察子实体的形态为基础，通过形态学的特征来对某个菌种进行分类鉴定。然而随着分子生物学技术的发展，分子生物学方法也越来越被广泛运用于菌种的分类鉴定，尤其是基于rDNA ITS序列分析的分子鉴定方法，为属内、种间及种内群体菌种的分类鉴定带来了巨大的便利杨智,王华伟,沙涛.外生菌根真菌的研究进展J.中国食用菌,2016,35(01):1-7.。ITS是rDNA的内转录间隔区(Internal Tran

12、scribed Spacer)，是真菌核糖体RNA基因非转录区的一部分。受到的选择压力较小，在绝大多数真核生物中有着极其广泛的序列多态性苏春丽,唐传红,张劲松.基于ITS序列的紫芝分子鉴定J.成都医学院学报,2014,9(02):121-123.。ITS具有两个显著的特点:(1）进化速度较编码区进化速度快（2）能被独立复制。因此，ITS能在比较广泛的水平上表现真菌种间变化，通常用于研究低等级，如属间、种间的系统发育关系。由于真菌种类数目繁多，依靠形态特征、生化特性等指标来鉴定真菌既需要丰富的关于真菌鉴定的经验又需要较长的检验时间，尤其是对于那些生长条件相同、形态特征又极其相似的菌种，想要通过传

13、统的形态解剖特征来完成真菌的鉴定工作是极为困难的。而基于rDNA ITS的多态性(包括长度多态性和序列多态性)的序列分析，由于可以从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息来反映生物的亲缘关系与分类情况，因而成为真菌分类及鉴定研究的主要方向，目前已广泛应用于真菌的属种间及部分种内组群水平的系统学研究赵育卉,李连强,湛东锐,王惠,刘天行,辛志宏.盐生海芦笋内生真菌S19的分离鉴定与抗氧化发酵条件优化J.南京农业大学学报,2013,36(02):137-144.。本实验就是运用分子生物学手段，以外生菌根真菌的子实体为材料，提取DNA，利用真菌特有的引物ITS1F和ITS4，利用PCR技术对外生菌根真菌

14、rDNA的ITS序列进行扩增 张文泉. 樟子松外生菌根真菌多样性及菌根生物技术研究D.内蒙古农业大学,2013.，然后测序并与NCBI（National Center for Biotechnology Information)数据库中的信息资源进行比对以及通过系统发育树上所体现的亲缘关系，将外生菌根真菌对应到属或种的水平，对外生菌根真菌进行分类研究。从而为丰富贺兰山真菌的物种多样性及我国真菌的系统分类研究奠定基础。 1材料与方法1.1实验材料实验材料是包头师范学院植物实验室提供的采自内蒙古贺兰山的外生菌根真菌的子实体，编号为HBTTC004。1.2实验设备及药品实验设备：电泳仪(DYY-10

15、C/北京六一仪器厂)、PCR自动系列化分析仪(2720/美国ABI公司)、台式离心机(CT14D/上海天美科学仪器有限公司)、紫外透射反射分析仪（2WF-1/上海金达生化仪器厂）、电子精密天平（BS223S/赛多利斯科学仪器有限公司）、高压蒸气灭菌锅、移液枪、微波炉、电热恒温水浴箱、超净工作台。实验药品：液氮、巯基乙醇、2CTAB提取液、异丙醇、2Taq PCR Master Mix、ddH2O（双蒸水）、氯仿/异戊醇（24:1)、引物ITS1F、引物ITS4、Biospin胶回收试剂盒、Agarose-Molecular Biology Grade(琼脂糖）、5TBE缓冲液、Gold Vie

16、w型核酸染色剂、6DNA Loading Buffer、DL 2000 Plus DNA Marker、1mol/L Tris-HCL(PH=8.0)、0.5mol/L EDTA（乙二胺四乙酸钠)(PH=8.0)、无水乙醇、70%乙醇。1.2.1试剂配方1mol/L Tris-HCL(pH=8.0)：取浓盐酸42mL和Tris 121.1g，加去离子水定容至1升。5TBE缓冲液：取Tris 54g和硼酸27.5g及0.5mol/L EDTA（pH=8.0）20mL，加去离子水定容至1升。2CTAB：取CTAB 2g、1mol/L Tris-HCL（pH=8.0) 10mL、0.5mol/L E

17、DTA 4mL及5mol/L Nacl 28mL，加去离子水定容至100mL。0.5 mol/L EDTA（pH=8.0)：取二水乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O）186.1g和NaOH 20g，加去离子水定容至1升。1.3实验方法1.3.1 基因组DNA的提取采用CTAB法提取外生菌根真菌基因组DNA。(1)准备工作：打开水浴锅，65温浴2CTAB提取液。(2)取-20下保存的真菌子实体放入研钵中，加入适量灭菌的石英砂至研钵中，迅速研磨至粉末，取适量倒入1.5mL离心管中，之后向1.5mL离心管中加入65已预热的2CTAB提取液600l，同时加入20l 巯基乙醇。(3)将离心管置于6

18、5下水浴1h，水浴过程中温和摇匀数次，使样品充分裂解。(4)取出离心管，加入等体积（约600l）的24:1的氯仿：异戊醇溶液，混合均匀，25，12000rmp离心15min。（同时做好准备工作：打开4离心机备用）(5)提取上清液（约500l），加入等体积的24:1的氯仿：异戊醇溶液，4，12000rmp离心15min。(6)提取上清液（约300l），加入5mol/L KAC约30l，然后加入异丙醇约200l，混匀。(7)-20下过夜。(8)准备工作：打开真空干燥机，预热30min。(9)将过夜样品置于4，9200rmp离心2min。(10)弃掉液相，加入400l 70%乙醇，震荡洗涤3min，

19、再次4，9200rmp离心2min。(11)重复步骤10一次。(12)将样品置于干燥机中，室温下抽真空干燥DNA，约15min。(13)加入65l去离子无菌水，室温下溶解DNA样品后于-20下保存。1.3.2 rDNA ITS区段的PCR扩增用ddH2O将提取的基因组DNA稀释10倍，并以ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）和ITS1F（5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3）为引物，以稀释DNA作为模板，对rDNA ITS区段进行PCR扩增。PCR反应体系为25l（如表1）。表1 PCR反应体系（25l）成分组成成分含量2Taq PCR MasterMi

20、x12.5lddH2O10.5l引物ITS1F0.5l引物ITS40.5l模板DNA1lPCR反应条件：Stage1：预变性:94 3min Stage2：step1:变性94 30s step2:退火57 1min 30个循环 step3:延伸72 1min Stage3：补平72 5min Stage4：保存4 PCR扩增结束后，取8l扩增产物点样，扩增产物用浓度为1%琼脂糖凝胶在0.5TBE电泳缓冲液中电泳，电泳的电压为80V，电泳的时间为1小时，并在紫外透射反射分析仪下观察拍照，检测扩增产物的长度。1.3.3 PCR扩增产物的回收和纯化PCR扩增产物经电泳和紫外透射反射分析仪检测后，对

21、于较理想PCR扩增产物采用Biospin胶回收试剂盒从含有目的产物条带的琼脂糖凝胶上回收、纯化。具体步骤如下：(1)用锋利、灭菌的刀片，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入1.5mL的离心管中。(2)按1：3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体微升数）加入Extraction Buffer。(3)于恒温水浴箱中50温育，直到凝胶融化为止。(4)将混合液全部转移到Spin column内，于6000rmp离心1min，并弃去接液管内的液体。(5)向Spin column内加500l Extraction Buffer，于12000rmp离心1min，并弃去接液管内液体。(6)向Spin co

22、lumn内加750l Wash Buffer，于12000rmp离心1min，并弃去接液管内液体。(7)再次于12000rmp离心1min，然后将Spin column转移到无菌的1.5mL离心管中。(8)向1.5mL离心管内加50l Elution Buffer，并于室温静置1min。(9)于12000rmp离心1min，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段卞喜座. 玉米辐照诱变及遗传转化研究D.山东农业大学,2012.。1.3.4 DNA测序分析按照试剂盒步骤要求纯化扩增后的DNA。并将纯化后的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，符合要求后将纯化产物送交上海生工生物工程公司完成测序工作。将

23、测序得到的序列输入GeneBank的局部相似性查询程序（Basic Local Alignment Search Tool)进行比对，列出数据库中与被测序列同源性较高的序列信息，从而进行分类鉴定研究。然后通过软件raxmlGUI构建系统发育树。2结果与分析 2.1 PCR产物的检测本试验采用常规CTAB法提取外生菌根真菌的基因组DNA，通过PCR技术将目的rDNA ITS序列片段进行扩增，以DL 2000 Plus DNA Marker作为参考，在紫外透射反射分析仪下观察拍照，结果如下。图1 PCR扩增后得到的ITS片段的电泳检测图如图1所示，PCR扩增产物片段大小大概在650bp左右，条带较

24、为清晰，整齐。由此可见，PCR扩增得到的DNA完整性比较好，纯度比较高，可以割胶回收用于本次试验的研究。在PCR过程中，引物的浓度会影响扩增产物的条带，引物浓度较大，将会出现较多的引物二聚体，所以本次试验的引物稀释了10倍，使得电泳后的的DNA条带无引物二聚体出现。此外，退火温度的设定也将影响PCR扩增的产物。本实验在经过多次探索后，最终是在适宜的退火温度57条件下进行的。2.2 提纯效果的检测采用Biospin胶回收试剂盒回收纯化，将经纯化后的DNA进行检测。取DNA样品6l，加入1l 6DNA Loading Buffer，二者充分混合后吸取6l点样，电泳的电压为80V，电泳的时间为1小时

25、，在紫外透射反射分析仪下观察拍照，结果如下。图2回收试剂盒割胶回收纯化产物的电泳检测结果如图2所示，割胶回收纯化得到的DNA经电泳检测后，可以看出是一条清晰的条带。由此可见，经回收试剂盒回收纯化的DNA完整性较好、纯度较高。样品片段大小在650bp左右，与预期的条带大小相符。已达到检测水平，可以送去测序。2.3 rDNA ITS序列的同源性分析经上海生工测序后，HBTTC004样DNA序列长度为680bp，运用NCBI的序列局部相似性查询系统（Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)，在NCBI序列数据库中检索与上述 DNA 序列同源性比较高的序列，并进

26、行分析比较樊永军. 内蒙古地区四种树木外生菌根形态多样性及分子鉴定D.内蒙古农业大学,2009.。选择同源性较高的18个序列进行同源性分析，如表2。由表2得知，所研究的真菌HBTTC004与这18个属种的同源性较高。这表明研究的真菌HBTTC004与这些属种亲缘关系较近。表2 与试验菌株ITS序列同源性高的18个序列AccessionDescriptionMaxscoreTotal scoreQuery cover(%)EvalueIdentities(%)KU531609.1Choiromyces helanshanensis voucher HMAS8376610961096910.099

27、KP019344.1Choiromyces helanshanensis strain 8063810961096870.099KP019343.1Choiromyces helanshanensis strain 8063610961096870.099KP019345.1Choiromyces helanshanensis strain 8064510791079870.099KU531606.1Choiromyces helanshanensis voucher HKAS8064110771077920.098KU531602.1Choiromyces helanshanensis vo

28、ucher HKAS8063210701070950.096KU531604.1Choiromyces helanshanensis voucher HKAS8063310611061890.098KU531603.1Choiromyces helanshanensis voucher HKAS8063010481048930.096KP019347.1Choiromyces helanshanensis strain 8064410381038870.098KU531607.1Choiromyces helanshanensis voucher HKAS80646977977820.098N

29、R153899.1Choiromyces helanshanensis HKAS 80634909909750.099KP019346.1Choiromyces helanshanensis strain 80634909909750.099KP019351.1 Choiromyces helanshanensis strain 80639 94494478099KX510042.1Uncultured fungus clone NXHLS31010991099910.099LC204921.1Uncultured fungus genes for 18S rRNA442442400.096K

30、J769323.1Uncultured Tuber clone315315290.095KY574434.1Uncultured Tuber clone309380340.096KX816330.1Uncultured fungus clone309309280.096Royse等在对土层中分布的外生菌根菌群落进行分子鉴定时提出，供试的 rDNA ITS序列与NCBI的GeneBank 数据库进行BLAST检索比对，序列同源性99%，可鉴别为相同种；序列同源性为95%99%，可鉴别为相同属；序列同源性95%，可鉴别为相同科樊永军,赵艳玲,闫伟.贺兰山两株大型真菌物种分子鉴定与系统地位分析J.广

31、东农业科学,2014,41(02):153-156.。DNA序列数据库中，在可比较的碱基范围内进行DNA序列同源性比较时，BLAST查询的结果表明，在数据库中，登录的一个编号为KU531609.1的ITS区段DNA序列与本研究的序列最相似，这一个DNA序列共有650个碱基，在BLAST查询结果中表明的两者同源性（Identities）为99%。两者相比较的score值为1096，E值为0.0，分子鉴定结果相似率非常的高，且相似率比对得分最高。此外BLAST查询结果中列出的34个E值为0的主要同源序列中有20个都属于Choiromyces helanshanensis。2.4 raxmlGUI系

32、统发育树分析将提取的DNA经扩增，纯化后测序，将测序得到的DNA序列运用GeneBank的序列相似性查询系统（BLAST)进行比对，选择数据库中的序列，将其导出。然后运用软件raxmlGUI构建系统发育树。如图3所示，并以Tuber sp.作为外类群，KF742773.1是在该外类群在NCBI数据库里的登录名。图3基于ITS序列的raxmlGUI软件构建的系统发育树raxmlGUI系统发育树表明，菌种HBTTC004与KP019344.1聚集在一个分支上，因此可表明二者的相似性最高，KP019344.1属于Choiromyces helanshanensis，因此结合BLAST和系统发育树的共

33、同结果，可以将HBTTC004鉴定为Choiromyces helanshanensis。3结论与讨论通过CTAB法提取真菌基因组DNA并利用真菌特有的引物ITS1F和ITS4，对特异的DNA片段进行PCR扩增，并利用回收试剂盒进行提纯，将纯化产物送由上海生工进行DNA测序，将检测所得到的序列输入GeneBank数据库中与已知的相关序列进行局部相似性查询，最终的研究结果显示该外生菌根真菌为报道的Choiromyces helanshanensis。本试验充分利用了真菌rDNA ITS区段的保守性表现为种内相对一致，种间差异比较明显的特点，同时借助GeneBank生物数据库的大量信息，从分子水平上对真菌进行鉴定。本试验中的PCR扩增过程极其重要。PCR中引物自身以及引物之间很容易形成引物二聚体，应防止引物二