选修1 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数).

1、课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的 分离分离与与计数计数 Zx.xk Zx.xk 一一. .研究思路研究思路 寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求， 到相应的环境中去寻找。到相应的环境中去寻找。 因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多数微，淘汰了绝大多数微 生物只有生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。 DNA DNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是是 一种在体外将一种在体外将少量少量DNADNA大量大量 复制复制的技术，此项技术要求的技术，此项技术要求 使用使用耐高温（耐高温（9393

2、0 0C C）的）的DNADNA 聚合酶。聚合酶。 原因：原因： 启示：启示： 3、选择培养基、选择培养基 l在微生物学中，将允许在微生物学中，将允许特定特定种类的微种类的微 生物生长，同时生物生长，同时抑制抑制或或阻止阻止 其他种其他种 类微生物生长的培养基，称作选择培类微生物生长的培养基，称作选择培 养基。养基。 4、配制选择培养基的依据、配制选择培养基的依据 l 根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某 种物质以达到选择的目的。种物质以达到选择的目的。 l例如：培养基中不加入有机物可以选择培养例如：培养基中不加入有机物可以选择培养 微生物；培养基中不加

3、入氮元素，可微生物；培养基中不加入氮元素，可 以选择培养以选择培养 的微生物，加入的微生物，加入高浓度的食高浓度的食 盐盐可选择培养可选择培养金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌等。等。 自养型自养型 固氮固氮 5 5、本课题使用的培养基的配方：、本课题使用的培养基的配方： 6 6、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理 以尿素为以尿素为 唯一氮源唯一氮源 的培养基的培养基 牛肉膏牛肉膏 蛋白胨蛋白胨 培养基培养基 是是 分离分离 尿素尿素 细菌细菌 判断该判断该 培养基培养基 有无选有无选 择性择性 实验组实验组 对照组对照组 培养基类型培养基类型 是否是否 接种接种 目

4、的目的 结果结果 只生长尿只生长尿 素细菌素细菌 生长多种生长多种 微生物微生物 是是 当样品的稀释度足够高时，培养基表当样品的稀释度足够高时，培养基表 面生长的一个菌落，来源于样品稀释面生长的一个菌落，来源于样品稀释 液中的一个活菌，通过统计平板上的液中的一个活菌，通过统计平板上的 菌落数，就能推测出样品中大约含有菌落数，就能推测出样品中大约含有 多少活菌。多少活菌。 统计的菌落数往往比活菌的实际统计的菌落数往往比活菌的实际 数目数目 低低 ，因此统计结果一般用，因此统计结果一般用 菌落数而不是活菌数菌落数而不是活菌数表示。表示。 例：两位同学用稀释涂布平板法测定同例：两位同学用稀释涂布平板

5、法测定同 一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为 10106 6的培养基中，得到以下两种统计结果。的培养基中，得到以下两种统计结果。 1 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的 菌落数为菌落数为230230。 2 2、乙同学在该浓度下涂布了、乙同学在该浓度下涂布了A A、B B、C C三个平板，三个平板， 统计的菌落数分别为统计的菌落数分别为2121、212212、256256，该同学以这三，该同学以这三 个平板上菌落数的平均值个平板上菌落数的平均值163163作为统计结果。作为统计结果。 你认为这两位同学的作法

6、正确吗？如果有问题，你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题， 错在哪？错在哪？ 甲：没有甲：没有重复实验重复实验（至少涂布（至少涂布3 3个平板）个平板） 乙：乙：A A组结果误差过大，不应用于计算平均值组结果误差过大，不应用于计算平均值 计算公式：计算公式： 每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数 =（CV）M 某同学在稀释倍数为106的培养基中测得 平板上菌落数的平均数为234，那么每克样 品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液 的体积为0.1ml）() A.2.34108 B.2.34109 C.234 D.23.4 B （三）设置对照（三）设置对照 判断培养基中是否有判断培养基中是否有杂

7、菌污染：杂菌污染： 将将未接种未接种的培养基同时进行培养。（空白对照）的培养基同时进行培养。（空白对照） 判断选择培养基是否具有判断选择培养基是否具有筛选作用筛选作用： 完全培养基（营养成分齐全，比如完全培养基（营养成分齐全，比如牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白 胨培养基胨培养基）接种接种后培养后培养观察菌落数目。观察菌落数目。 主要目的是排除实验组中非测试因素对实验主要目的是排除实验组中非测试因素对实验 结果的影响，提高实验结果的可信度。结果的影响，提高实验结果的可信度。 （一）土壤取样（土壤是天然培养基）（一）土壤取样（土壤是天然培养基） （1 1）取样的位置：）取样的位置： 土壤，天然培养基，含有大

8、量的微生物，土壤，天然培养基，含有大量的微生物， 土壤中土壤中7070 9090是细菌，细菌适宜在酸碱度是细菌，细菌适宜在酸碱度 接近接近中性中性的的潮湿土壤中生长。在富含有机的的潮湿土壤中生长。在富含有机 质的土壤层的质的土壤层的3 3 8cm8cm处中分布着绝大多数的处中分布着绝大多数的 细菌。细菌。 （2 2）取样要求：）取样要求：铲去表层土铲去表层土。 注意无菌操作：注意无菌操作： 取土样用的小铁铲和盛土样的信封等用具取土样用的小铁铲和盛土样的信封等用具 在使用前都要灭菌。在使用前都要灭菌。 应在火焰旁称取土壤。并在火焰附近将土应在火焰旁称取土壤。并在火焰附近将土 样到入锥形瓶并塞好棉

9、塞。样到入锥形瓶并塞好棉塞。 （1 1）测细菌数：一般用）测细菌数：一般用10104 4、10105 5、10106 6稀释液稀释液 （2 2）测放线菌：一般用）测放线菌：一般用10103 3、10104 4、10105 5稀释液稀释液 （3 3）测真菌数：一般用）测真菌数：一般用10102 2、10103 3、10104 4稀释液稀释液 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选 择了一个较为宽泛的范围：择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为稀释倍数为103107。 准备准备牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基和和选择培养基。（选择培养基。（制备以制

10、备以 尿素为唯一氮源的尿素为唯一氮源的选择培养基。）选择培养基。）每个稀释度下需要每个稀释度下需要3个个 选择培养基，选择培养基，1个个牛肉膏蛋白胨培养基。还需要牛肉膏蛋白胨培养基。还需要8个灭菌个灭菌 试管和试管和1个灭菌移液管个灭菌移液管 。 将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上 生长的菌落数目应明显生长的菌落数目应明显多于多于选择培养基上的数目，因此，选择培养基上的数目，因此， 牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养 基是否起到了基是否起到了选择选择作用。作用。 实验时要对实验时

11、要对 培养皿作好标培养皿作好标 记。记。注明培养注明培养 基类型、培养基类型、培养 时间、稀释度、时间、稀释度、 培养物等培养物等。 观察：观察： 筛选后必鉴定筛选后必鉴定- -鉴别培养基鉴别培养基 l鉴别培养基：不影响微生物的生存鉴别培养基：不影响微生物的生存 l 根据微生物的代谢特点，在培养基中加入根据微生物的代谢特点，在培养基中加入 某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同种类的某种指示剂或化学药品，用于鉴别不同种类的 微生物，微生物， l如加入如加入伊红伊红- -美蓝美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品培养基鉴别饮用水或乳制品 中是否中是否大肠杆菌大肠杆菌（如有，（如有，菌落呈黑色，并带有菌落呈黑色，并带有 金属光泽）金属光泽） 酚红酚红培养基：培养基： 鉴定分解尿素的细菌鉴定分解尿素的细菌。 原理：原理：脲酶催化尿素分脲酶催化尿素分 解成氨解成氨培养基培养基碱性增强碱性增强 酚红变红酚红变红脲酶阳性脲酶阳性 1 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2