《生物化学》（王镜岩版）专题

1、生物化学专题共价修饰酶共价调节是利用蛋白质的共价变化来调节酶的活性的，有些共价变化是可逆的，如蛋白质的磷酸化；有些则是不可逆的，如酶原激活（一）可逆共价修饰的调控（共价调节酶）共价调节酶：酶分子被其它的酶催化进行共价修饰，从而在活性形式与非活性形式之间相互转变。有多种类型： 1 ser thr tyr 残基的磷酸化 2 thr 残基的腺苷酰化 3 arg cys 残基的ADP-核糖基化其中磷酸化是最普遍，发生最多的，真核细胞的1/21/3的蛋白质被磷酸化，在这个过程中，有两种酶参与反应，一种是蛋白激酶，催化蛋白质发生磷酸化反应；另一种是蛋白质磷酸酶，催化蛋白质的去磷酸化反应。共价调节与别构调节

2、的区别:1 共价修饰系统能把调节物的效应放大，即级联放大效应2 共价修饰系统有较大的能力进行生物学整合，能把胞内代谢和胞外刺激（包括电刺激）联系起来，别构调节作用于胞内，特点在于灵敏、迅速；共价调节也作用于胞内但是涉及整体，在数分钟或者更长时间内起作用。（二）不可逆的共价调节（酶原的激活）有些蛋白质合成时不具有活性，经蛋白酶专一性作用后，构象发生变化，变成有活性的蛋白。这种不具生物活性的蛋白质称为前体。如果活性蛋白质是酶，这个前体就称为酶原。特点是不可逆。属于此类的有*消化系统中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶）*血液凝固系统中的酶*某些蛋白质激素，如胰岛素由胰岛素原激活而成*存在于皮肤

3、和骨骼中的纤维蛋白胶原，由前胶原激活而成。例如： 胰蛋白酶原肠激酶胰凝乳蛋白酶原 弹性蛋白酶原 胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶 弹性蛋白酶 羧肽酶原 羧肽酶RNA转录调控（主要为原核生物转录调控）基因表达有几个水平的调节转录水平翻泽水平加工水平 转录后加工、翻译后加工蛋白质活性调节其中最关键的是，基因表达的控制主要发生在转录水平,原核生物尤其如此。所以RNA转录调控专门列出（一） 几个重要概念操纵子：在细菌基因组中，编码一组在功能上相关的蛋白质的几个结构基因，与共同的控制位点组成的一个基因表达的协同单位，称为操纵子。结构基因（S structural gene）：表达一种或功能相关的几种蛋白的基因控制位

4、点：操纵基因（O operator） 启动子（P promotor）位于操纵基因上游，为RNA聚合酶结合位点。调节基因 (R regulator gene)：可转录翻译出诱导（或阻遏蛋白），控制操纵基因的开与关。 调节基因 启动子 操纵基因 结构基因 结构基因 结构基因 .结构基因 R P O S1 S2 S3 . Sn正调控和负调控在没有调节蛋白存在时，基因是关闭的，加入调节蛋白后,基因表达被开启，此为正调控。在没有调节蛋白存在时，基因是表达的，加入调节蛋白后,基因表达被关闭，此为负调控。在正调控中，调节蛋白称诱导蛋白。在负调控中，调节蛋白称阻遏蛋白。(二)大肠杆菌乳糖操纵子（Lac操纵子）

5、1 乳糖操纵子负调控LacZ、LacY、LacA为结构基因，上游依次为 操纵基因、启动子和调节基因LacI。当细胞内无诱导物（乳糖或IPTG）存在时，阻遏蛋白与操纵基因结合。由于操纵基因与启动子有一定程度重叠，妨碍了RNA聚合酶在-10序列上形成开放性启动子复合物。当细胞内有诱导物（乳糖或IPTG）存在时，诱导物与阻遏蛋白结合，改变阻遏蛋白构象，使之迅速从操纵基因上解离下来。这样RNA聚合酶就能与启动子结合，并形成开放性启动子复合物，从而开始转录LacZYA结构基因。 2 乳糖操纵子正调控在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高

6、，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。3调节机制 大肠杆菌根据碳源性质选择代谢方式。 倘若有葡萄糖存在时，细菌优先选择葡萄糖供应能量。葡萄糖通过降低 cAMP浓度，阻碍cAMP与CAP结合而抑制乳糖操纵子转录，使细菌只能利用葡萄糖。 在没有葡萄糖而只有乳糖的条件下，阻遏蛋白与 O序列解聚，CAP结合cAMP后与乳糖操纵子的CAP位点，激活转录，使得细菌利用乳糖作为能量来源。 DNA一级结构分析及PCR技术DNA测序的

7、生物学意义 DNA是遗传信息的储存者和传递者，遗传信息是由碱基序列体现的，碱基序列略有改变，即可引起遗传信息的显著改变。所以DNA测序是研究DNA功能的基础。DNA测序的实验方法双脱氧终止法（Sanger法）原理DNA 测序DNA聚合酶催化的DNA链延伸是在3-OH末端上进行的。由于2，3-双脱氧三磷酸核苷酸(ddNTP)的3-位脱氧而失去游离-OH，当它参入到DNA链后，3-OH末端消失，使DNA链的延伸终止。本实验根据此原理，将待测DNA片段插入单链噬菌体M13载体，并用合成的寡聚核苷酸引物与该载体上插入待测片段的上游顺序退火，随后在T7DNA聚合酶催化下进行延伸反应。实际操作中同时进行，

8、分别终止于A、G、C和T的4个反应体系。每个反应体系均含4种脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)底物，其中种dATP为32P标记物，以便能用放射自显影法读序。但在这4个反应体系中，分别加一种低浓度的ddNTP(ddATP、ddGTP、ddCTP或ddTTP)，这样ddNTP可随机参入正在延伸的DNA链上，使链延伸终止。例如在“A”管中加ddATP，反应结束时，管内所有新合成的DNA链都是以A结尾的不同长度的片段，而且这些片段都带放射性。将反应物加在高分辨凝胶上电泳，DNA片段则因其长度不同(分子量大小不同)被分离，短的走在前端，长的泳动在后面。其他3管则分别为以G，C或T结尾的不同长度DNA片段。由于

9、：即使是长短相差一个核苷酸的DNA片段，亦可根据其电泳距离的差异而加以区分；A、G、C和T4种反应体系的产物在电泳凝胶中相邻排列。故而在阅读凝胶电泳的放射自显影图像时，由下至上按前后顺序即可将DNA的核苷酸顺序读出。操作1单链模板与引物退火(1)用无菌蒸馏水按1：5稀释通用引物(约4.44g/ml)。(2)取1.5ml微量离心管1只，加入下列试剂：模板DNA(1.5-2ugDNA/10l)10l；稀释通用引物2l；退火缓冲液2l,总体积14l。2链延伸/终止反应(1)稀释T7DNA聚合酶：取2l(或4l)冷的酶稀释缓冲液至1只微量离心管中，加入0.5l(或ll)T7DNA聚合酶，用加样器轻轻抽

10、吸和排出而混匀，置冰浴中待用。(2)另取4只微量离心管，分别用记号笔标明“A”、“G”、“C”和“T”。依次将A-Mix、G-Mix、C-Mix和T-Mix液各2.5l分别加入这4只微量离心管中，置37预温1分钟以上 (说明：4种mix液各又分为short和long两种，前者中ddNTP浓度较高，用于 线形DNA 环形DNA脉冲电泳：可达104kb的DNA核酸分离纯化主要方法 层析法 羟基磷灰石柱层析：除去核酸混合物中的RNA和蛋白质、 结合温度改变，可按碱基组成分离DNA亲和层析: 分离带有特定序列的核酸，如poly(A)mRNA 离心法-氯化铯密度梯度超离心：分子密度梯度： RNA 超螺旋

11、DNA环形DNA 线形DNA 蛋白质 紫外吸收法：280nm处有最大吸收 280nm-260nm吸收差法：蛋白质浓度（g/ml）=1.45OD280-0.74OD260 凯氏定氮： 福林酚法（Lowry法）：Pr Pr-铜复合物 鉬蓝或钨蓝（ ）蛋白质含量 G-250(红棕色)测定 考马斯亮蓝染料结合法：Pr(10-100g/ml) 蓝色复合物（正比） 595nm比色 Cu2+ 双缩脲法：双缩脲 OH- 紫色复合物（正比）灵敏度差可用来快速鉴定 紫外吸收法：RNA(g/ml):A260/(0.024*L)*稀释倍数 DNA(g/ml):A260/(0.020*L)*稀释倍数 CUSO4、K2SO4 钼酸根 还原剂 定磷法：H3PO4+H2SO4 H2O2 P(无机) H+ 磷钼酸复离子 鉬蓝 660nm比色核酸含量 浓HCl 3，5-二羟基甲苯（地衣酚）测定 定糖法：RNA 核糖 糠醛 绿色复合物 670nm比色 FeCl3,CuCl2 H+ H+ H+二苯胺法：DNA 脱氧核糖 ，-