荧光定量PCR技术及临床应用

1、1 荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量PCRPCR技术介绍技术介绍 1985年美国年美国PE-cetus公司的人类遗传研究室公司的人类遗传研究室mullis等等 人发明了具有划时代意义的人发明了具有划时代意义的PCR技术，从而使人们梦技术，从而使人们梦 寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。寐以求的体外扩增核酸片段的愿望成为现实。 1987年该项技术获美国专利年该项技术获美国专利。 1988年年PE-cetus公司推出了第一台公司推出了第一台PCR热循环仪，从热循环仪，从 而使而使PCR技术的自动化成为现实。技术的自动化成为现实。 Mullis出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变的发

2、出因其卓越的贡献与寡核苷酸基因定点诱变的发 明者明者Michael分享了分享了1993年诺贝尔化学奖。年诺贝尔化学奖。 随着随着PCR技术的日臻成熟技术的日臻成熟1995年出现年出现荧光基因探针杂荧光基因探针杂 交定量交定量PCR方法方法 2 传统的临床微生物检测方法传统的临床微生物检测方法 细菌涂片细菌涂片 细菌培养细菌培养 免疫学技术免疫学技术 分别存在分别存在检出率低、周期长、特异性差检出率低、周期长、特异性差的缺点。的缺点。 3 普通普通PCRPCR临床检测技术的缺点临床检测技术的缺点 普通普通PCRPCR临床检测技术虽然解决了检出率低、临床检测技术虽然解决了检出率低、 周期长的问题，

3、但由于假阳性率高，不能正确周期长的问题，但由于假阳性率高，不能正确 指导临床实践。指导临床实践。 因此国家卫生部曾在因此国家卫生部曾在19971997年行文禁止将普通年行文禁止将普通 PCRPCR技术用于临床诊断。技术用于临床诊断。 4 FQ-PCR与普通与普通PCR的区别的区别 采用闭管检测，不需采用闭管检测，不需PCR后处理，并采用后处理，并采用 dUTP-UNG酶的防污染系统，扩增和检测一次酶的防污染系统，扩增和检测一次 同时完成。不需开盖，不产生污染。同时完成。不需开盖，不产生污染。 避免了避免了 假阳性。假阳性。 探针与被检探针与被检DNA序列特异杂交，序列特异杂交， 增强了特异增强

4、了特异 性。性。 5 FQ-PCR与普通与普通PCR的区别的区别 可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感可定量结果，准确灵敏地反应了病原体的感 染和治疗恢复情况。染和治疗恢复情况。 光谱分析仪直读结果，自动分析，光谱分析仪直读结果，自动分析， 增强了灵增强了灵 敏性和客观性。敏性和客观性。 6 荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量PCRPCR技术技术 随着随着PCR技术的日臻成熟，已出现的荧光基技术的日臻成熟，已出现的荧光基 因探针杂交定量因探针杂交定量PCR方法把目的基因扩增方法把目的基因扩增、 特异分子杂交和荧光化学融为一体，使特异分子杂交和荧光化学融为一体，使PCR 扩增和产物分析的

5、全过程均在单管封闭条件扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件 下进行，并通过微机控制，实现了对扩增下进行，并通过微机控制，实现了对扩增 产物进行实时动态检测和结果的自动分析。产物进行实时动态检测和结果的自动分析。 7 荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量PCRPCR技术技术 不仅进一步提高了特异性，并从根本上解决了不仅进一步提高了特异性，并从根本上解决了PCR扩扩 增产物污染的难题，保持了增产物污染的难题，保持了PCR技术的快速和高灵敏技术的快速和高灵敏 性，使假阳性率和假阴性率降低到最低限度，而且能性，使假阳性率和假阴性率降低到最低限度，而且能 定量被检微生物的核酸拷贝数，为临床实践提供

6、准确定量被检微生物的核酸拷贝数，为临床实践提供准确 的病原微生物的诊断、提供评估药物临床治疗效果的的病原微生物的诊断、提供评估药物临床治疗效果的 可靠依据。可靠依据。 因此，荧光基因探针杂交定量因此，荧光基因探针杂交定量PCR技术诊断病原微生技术诊断病原微生 物与迄今本院各临床科室所进行的临床检测技术不相物与迄今本院各临床科室所进行的临床检测技术不相 重复，它是一种属不同层次、快速、准确、直接并具重复，它是一种属不同层次、快速、准确、直接并具 有不同临床指导意义的检测方法。有不同临床指导意义的检测方法。 8 荧光定量聚合酶链反应荧光定量聚合酶链反应 （FQ-PCRFluorescence qu

7、antitative PCRFQ-PCRFluorescence quantitative PCR） 一种完全闭管式的一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交和荧光探针杂交 技术相结合的定量技术相结合的定量PCR方法方法 PCR的高效扩增特性的高效扩增特性 核酸探针的高特异性核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性光谱技术的高灵敏性和可计量性 9 荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量 PCRPCR技术与临床技术与临床 在确保特异性的前题下，高质的灵敏性使得在确保特异性的前题下，高质的灵敏性使得PCR技术技术 能探测到疾病发展的初期阶段，甚至于临床症状出现能探测到疾病发展的初期阶段，甚至

8、于临床症状出现 前或亚临床状态或机体正在向病态发展的早期过程之前或亚临床状态或机体正在向病态发展的早期过程之 中，如对于感染性疾病，以往的方法要么间接的检查中，如对于感染性疾病，以往的方法要么间接的检查 机体免疫系统对侵入微生物的反应产物降解产物（如机体免疫系统对侵入微生物的反应产物降解产物（如 抗原）或直接检查侵入微生物（如培养，镜检），但抗原）或直接检查侵入微生物（如培养，镜检），但 上述方法的灵敏度都受到方法学上的限制而达不到检上述方法的灵敏度都受到方法学上的限制而达不到检 查极微量级（如查极微量级（如Pg水平），因而难以在早期对疾病的水平），因而难以在早期对疾病的 发生做出准确，客观的

9、诊断，但发生做出准确，客观的诊断，但PCR巨大的放大效率巨大的放大效率 却解决了这一问题。却解决了这一问题。 10 荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量 PCRPCR技术与临床技术与临床 另外如对像肿瘤等另外如对像肿瘤等“渐变性渐变性”疾病是因多基因积疾病是因多基因积 累性突变才能造成正常细胞转变成癌细胞的，那累性突变才能造成正常细胞转变成癌细胞的，那 么及时检测到突变由量变转化为质变前期阶段则么及时检测到突变由量变转化为质变前期阶段则 显得极为重要，只有基因诊断才能完成这一目标。显得极为重要，只有基因诊断才能完成这一目标。 11 荧光定量荧光定量PCR检测的对象是致病的病因，所以对检测的

10、对象是致病的病因，所以对 于鉴别疾病的致病因子非常实用和准确，这对于于鉴别疾病的致病因子非常实用和准确，这对于 区别相近临床症状的不同致病子，以期对因治疗区别相近临床症状的不同致病子，以期对因治疗 极为有用。极为有用。 荧光定量荧光定量PCR可以对致病因子进行准确的定量，可以对致病因子进行准确的定量， 对治疗前后及治疗过程进行量化监控，则可以有对治疗前后及治疗过程进行量化监控，则可以有 效的观察药物治疗效果。效的观察药物治疗效果。 如果用致病子的数量多少表示治疗效果，则可以如果用致病子的数量多少表示治疗效果，则可以 进行临床治疗方案的评价及治愈标准的确立。进行临床治疗方案的评价及治愈标准的确立

11、。 12 荧光定量荧光定量PCR检测的临床应用范围检测的临床应用范围 用于疾病的早期诊断用于疾病的早期诊断 用于疾病的鉴别诊断用于疾病的鉴别诊断 用于疾病的病因确定用于疾病的病因确定 用于药物疗效的评价用于药物疗效的评价 用于治疗效果的评价用于治疗效果的评价 用于治愈标准的确定用于治愈标准的确定 13 荧光定量荧光定量PCRPCR技术应用于技术应用于 感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断 14 结核杆菌的临床诊断方法结核杆菌的临床诊断方法 目前结核病确诊主要依靠痰片染色，抗酸杆菌和结核杆目前结核病确诊主要依靠痰片染色，抗酸杆菌和结核杆 菌的培养法鉴定。但涂片阳性率不高，且不能确诊；培菌的培养法鉴定

12、。但涂片阳性率不高，且不能确诊；培 养法需较长时间。养法需较长时间。 ELISA和和RIA法敏感性低，尚不能直接检测临床标本。法敏感性低，尚不能直接检测临床标本。 近年来国外出现了培养早期进行放射性检测的近年来国外出现了培养早期进行放射性检测的BacTec 技术，能显著缩短报告时间，但价格极贵，国内很难推技术，能显著缩短报告时间，但价格极贵，国内很难推 广。广。 基因诊断技术的应用是一大突破，其中包括基因探针技基因诊断技术的应用是一大突破，其中包括基因探针技 术，染色体指纹技术和荧光定量术，染色体指纹技术和荧光定量PCR技术。技术。 15 .北京胸科医院;北京市结核病胸部肿瘤研究所;上海肺 科

13、医院三家医院的考核情况。 1.三家医院标本分布 医院医院 结核组结核组351例例 对照组对照组 160例例 例数例数 涂阳涂阳 培阳培阳 北京胸科北京胸科143364260 北京结研所北京结研所151403150 上海肺科上海肺科57572950 结核分枝杆菌结核分枝杆菌( (TB)TB) FQ-PCRFQ-PCR检测与常规检测比较检测与常规检测比较 16 FQ-PCRPCR法与涂片法、培养法的检出率比较法与涂片法、培养法的检出率比较 组别组别 涂片法涂片法 培养法培养法 FQ-PCRFQ-PCR法法 例数例数 阳性阳性 检出率检出率 阳性阳性 检出率检出率 阳性阳性 检出率检出率 结核病组结

14、核病组 351 133 37.9% 102 29.1% 220 62.7% 351 133 37.9% 102 29.1% 220 62.7% 对照组对照组 160 0 0% 0 0 % 0 0 % 160 0 0% 0 0 % 0 0 % 17 荧光定量荧光定量PCRPCR技术技术 检测结核杆菌应用评价检测结核杆菌应用评价 1. 特异性特异性 人型结核杆菌，牛型结核杆菌及卡介菌均可人型结核杆菌，牛型结核杆菌及卡介菌均可 扩增检测出，其它分支杆菌均否。扩增检测出，其它分支杆菌均否。 2. 敏感性敏感性 可检测可检测1pg DNA，其相当于其相当于30个结核杆菌个结核杆菌 的染色体的染色体DNA

15、量。量。 3. 临床应用临床应用 快速快速 可检测无法培养的结核杆菌可检测无法培养的结核杆菌 18 临床上，结核性脑膜炎是小儿多发病，病情凶临床上，结核性脑膜炎是小儿多发病，病情凶 险，所以早期快速诊断具有重要意义，而荧光险，所以早期快速诊断具有重要意义，而荧光 定量定量PCR方法整个过程才方法整个过程才45小时，远较细胞小时，远较细胞 培养法为快，而且准确。培养法为快，而且准确。 检测标本无特殊限制：检测标本无特殊限制： 痰、尿、腹水、胸水、关节液、血、肺泡灌洗痰、尿、腹水、胸水、关节液、血、肺泡灌洗 液、脑脊液、分泌物等均可送检液、脑脊液、分泌物等均可送检 19 荧光定量荧光定量PCRPC

16、R检测淋球菌检测淋球菌 淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要是进淋病的临床表现缺乏特异性，其确诊主要是进 行实验室检查。传统的方法有涂片染色法，分离行实验室检查。传统的方法有涂片染色法，分离 培养法和用来检测淋球菌抗原的培养法和用来检测淋球菌抗原的EIA-Gonozyme 系统法。近年来，荧光定量系统法。近年来，荧光定量PCR诊断技术的应用，诊断技术的应用， 使淋病的快速诊断有重大突破。使淋病的快速诊断有重大突破。 荧光定量荧光定量PCR方法适用于方法适用于淋病的快速诊断淋病的快速诊断和和流流 行病学调查。行病学调查。 20 乙型、丙型肝炎病毒的乙型、丙型肝炎病毒的PCRPCR检测检测 21

17、HBV感染感染的诊断主要采用的诊断主要采用免疫测定法免疫测定法检测血清标本检测血清标本 中的中的HBSAg，HbeAg，抗抗-Hbs，抗抗-HBc和抗和抗-Hbe （两对半），免疫学方法虽然比较简单，但只能提两对半），免疫学方法虽然比较简单，但只能提 供血清中的供血清中的HBV间接证据，无法证明是否具有传染间接证据，无法证明是否具有传染 性，而且敏感性较低。性，而且敏感性较低。 而而内源性内源性DNA聚合酶法聚合酶法和和斑点杂交分析法斑点杂交分析法则可直接则可直接 确定临床标本中确定临床标本中HBV DNA的存在。尽管比较敏感，的存在。尽管比较敏感， 但只能检测到但只能检测到0.1pg的的HB

18、V DNA。 而而荧光定量荧光定量PCR方法方法则可检测到则可检测到200copy/ml的的 HBV DNA，因而是极为有用的方法。因而是极为有用的方法。 22 肝炎病毒的肝炎病毒的PCR检测的意义检测的意义 PCRPCR方法可检出杂交法测定阴性而具有不同方法可检出杂交法测定阴性而具有不同 HBVHBV血清学标志的血清标本中的血清学标志的血清标本中的HBV DNAHBV DNA。 PCRPCR方法可检出方法可检出HBs AgHBs Ag阳性而阳性而Hbe AgHbe Ag阴性携阴性携 带者的带者的HBV DNAHBV DNA。 PCRPCR方法可检出慢性方法可检出慢性HBVHBV感染感染 干扰

19、素治疗后转阴的患者干扰素治疗后转阴的患者 血清中残存的血清中残存的HBV DNAHBV DNA。 23 丙型肝炎病毒的丙型肝炎病毒的PCR检测检测 丙型肝炎多由丙型肝炎多由输血或血液制备输血或血液制备引起引起,临床临床 预后较差预后较差,死亡率高死亡率高, 所以早期诊断具有所以早期诊断具有 非常重要的意义非常重要的意义. 目前目前最为敏感和特异最为敏感和特异的方法的方法, 属属荧光基因荧光基因 杂交定量杂交定量PCR方法。方法。 24 应用评价应用评价 PCR法是检测病毒血症法是检测病毒血症(HCV RNA)的最敏感的最敏感 方法。方法。 PCR方法克服了抗体测定法之不足方法克服了抗体测定法之

20、不足,通通 过扩增核酸达到检测病毒的目的过扩增核酸达到检测病毒的目的. PCR法可用来区分活动性法可用来区分活动性HCV和急性期的消和急性期的消 退性感染退性感染,后者与病毒后者与病毒RNA的消失有关。的消失有关。 血清转化期血清转化期,PCR法也可检出法也可检出HCV RNA存在。存在。 对非甲非乙肝炎患者对非甲非乙肝炎患者,PCR方法对肝活检组织方法对肝活检组织 HCV RNA有很高的检出率。有很高的检出率。 25 肝炎病毒的肝炎病毒的PCRPCR检测的意义检测的意义 HBV及及HCV的的PCR检测检测确诊对手术相关科室待手术确诊对手术相关科室待手术 病人十分重要。病人十分重要。 明确术前

21、病人是否具有传染性，对术中医务人明确术前病人是否具有传染性，对术中医务人 员的自身保护、术后病人敷料及分泌物的正确处理员的自身保护、术后病人敷料及分泌物的正确处理 以防止院内交叉感染，并避免因术前、术后诊断不以防止院内交叉感染，并避免因术前、术后诊断不 明确引起的医疗纠纷都具有直接的指导意义。明确引起的医疗纠纷都具有直接的指导意义。 因此，建议手术相关科室从以上诸方面考虑，因此，建议手术相关科室从以上诸方面考虑， 常规进行常规进行HBV、HCV荧光基因杂交定量荧光基因杂交定量PCR检测。检测。 也建议其他科室对相关病人进行检测。也建议其他科室对相关病人进行检测。 26 人类巨细胞病毒人类巨细胞

22、病毒( (HCMV)HCMV)的的PCR检测检测 巨细胞病毒巨细胞病毒(CMV)为疱疹病毒科成员，其基因组为疱疹病毒科成员，其基因组 由一由一240kb的线性双股的线性双股DNA分子组成，人类巨分子组成，人类巨 细胞病毒对人的感染很普遍，有时感染是致死细胞病毒对人的感染很普遍，有时感染是致死 性的。这种病毒也是引起人类先天性畸形的一性的。这种病毒也是引起人类先天性畸形的一 个重要原因，所以建立快速敏感的诊断方法甚个重要原因，所以建立快速敏感的诊断方法甚 为重要。为重要。 27 一、人类巨细胞病毒一、人类巨细胞病毒( (HCMV)HCMV)的的 诊断方法诊断方法 快速细胞培养技术快速细胞培养技术

23、 LISA法法 分子杂交法分子杂交法 PCR方法方法 28 快速细胞培养技术敏感性低。快速细胞培养技术敏感性低。 ELISA法除敏感性不高外，还易受干扰因素的法除敏感性不高外，还易受干扰因素的 影响。影响。 探针杂交检测探针杂交检测DNA法，对标本的处理及制备较法，对标本的处理及制备较 麻烦；而且只有当细胞中麻烦；而且只有当细胞中CMV的拷贝数很高时，的拷贝数很高时， 该方法的敏感性才可提高。该方法的敏感性才可提高。 随着对随着对CMV基因组序列的阐明，基因组序列的阐明，PCR技术在技术在 CMV的检测方面已成为最准确的方法。的检测方面已成为最准确的方法。 29 用用PCR检测衣原体检测衣原体

24、DNA 衣原体属包括衣原体属包括3个种，分为：个种，分为： 沙眼衣原体沙眼衣原体 (引起眼部疾病和性传播疾病引起眼部疾病和性传播疾病) 鹦鹉热衣原体鹦鹉热衣原体 (引起呼吸道疾病引起呼吸道疾病) 肺炎衣原体肺炎衣原体 (引起肺炎引起肺炎) 30 沙眼衣原体沙眼衣原体 不仅可致眼部疾病，也是性传播疾病的主要病原体。不仅可致眼部疾病，也是性传播疾病的主要病原体。 鹦鹉热衣原体鹦鹉热衣原体和和肺炎衣原体肺炎衣原体 在人类则主要引起呼吸道疾病。在人类则主要引起呼吸道疾病。 然而衣原体感染然而衣原体感染常缺乏特异症状常缺乏特异症状，使临床诊断和监，使临床诊断和监 控甚为困难。选择衣原体保守的控甚为困难。

25、选择衣原体保守的16SrRNA基因为基因为 模板，模板， 应用应用PCR技术则可以敏感，特异和简便地进行诊断。技术则可以敏感，特异和简便地进行诊断。 31 应用前景应用前景 PCR技术适于：技术适于： 沙眼衣原体生殖泌尿道感染的沙眼衣原体生殖泌尿道感染的早期诊断早期诊断，尤，尤 其适于对无症状携带者或轻症患者的诊断。其适于对无症状携带者或轻症患者的诊断。 根据采集标本的部位不同，检测根据采集标本的部位不同，检测其它衣原体其它衣原体 的感染。的感染。 作衣原体感染的作衣原体感染的分子流行病学调查分子流行病学调查.为性传播为性传播 疾病的监控提供依据。疾病的监控提供依据。 32 第三军医大学基因诊

26、断中心第三军医大学基因诊断中心 附属于附属于西南医院综合实验研究中心西南医院综合实验研究中心，位于，位于西南医院科西南医院科 教楼教楼4 4楼楼 是重庆市首家引进美国是重庆市首家引进美国BIO-RAD BIO-RAD 公司的公司的“iCycleriCycler”荧荧 光定量光定量PCRPCR检测仪和检测仪和PEPE公司公司377377型全自动型全自动DNADNA测序仪的测序仪的 实验室。实验室。 能准确、及时地为临床在能准确、及时地为临床在 基因水平提供肝炎、性病基因水平提供肝炎、性病 、结核、结核、HIV HIV 等病原体感等病原体感 染染 的定量分析及疗效评估。的定量分析及疗效评估。 33

27、 第三军医大学基因诊断中心第三军医大学基因诊断中心 现所开展的检测项目现所开展的检测项目 乙肝病毒乙肝病毒（HBV）荧光定量荧光定量PCR检测检测 丙肝病毒丙肝病毒（HCV）荧光定量荧光定量PCR检测检测 淋球菌淋球菌（NG）荧光定量荧光定量PCR检测检测 沙眼衣原体（沙眼衣原体（CT）荧光定量荧光定量PCR检测检测 解脲支原体（解脲支原体（UU）荧光定量荧光定量PCR检测检测 结核分支杆菌（结核分支杆菌（TB）荧光定量荧光定量PCR检测检测 34 单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（HSV）荧光定量荧光定量PCR检测检测 人类巨细胞病毒人类巨细胞病毒（CMV）荧光定量荧光定量PCR检测检测 人乳头瘤

28、病毒人乳头瘤病毒6 型（型（HPV 6型型）荧光定量荧光定量PCR检测检测 人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒11型（型（HPV 11型）型）荧光定量荧光定量PCR检测检测 人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒16型（型（HPV 16型）型）荧光定量荧光定量PCR检测检测 人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒18型（型（HPV 18型）型）荧光定量荧光定量PCR检测检测 梅毒螺旋体（梅毒螺旋体（TP）荧光定量荧光定量PCR检测检测 肺炎支原体（肺炎支原体（MP）荧光定量荧光定量PCR检测检测 EB病毒（病毒（EBV）荧光定量荧光定量PCR检测检测 35 谢谢 谢谢! ! 01-3-30 36 荧光定量聚合酶链反应荧光定量聚合酶

29、链反应 （FQ-PCRFluorescence quantitative PCRFQ-PCRFluorescence quantitative PCR） 一种完全闭管式的一种完全闭管式的PCR和荧光探针杂交和荧光探针杂交 技术相结合的定量技术相结合的定量PCR方法方法 PCR的高效扩增特性的高效扩增特性 核酸探针的高特异性核酸探针的高特异性 光谱技术的高灵敏性和可计量性光谱技术的高灵敏性和可计量性 37 荧光基因探针杂交定量荧光基因探针杂交定量 PCRPCR技术与临床技术与临床 在确保特异性的前题下，高质的灵敏性使得在确保特异性的前题下，高质的灵敏性使得PCR技术技术 能探测到疾病发展的初期阶段，甚至于临床症状出现能探测到疾病发展的初期阶段，甚至于临床症状出现 前或亚临床状态或机体正在向病态发展的早期过程之前或亚临床状态或机体正在向病态发展的早期过程之 中，如对于感染性疾病，以往的方法要么间接的检查中，如对于感染性疾病，以往的方法要么间接的检查 机体免疫系统对侵入微生物的反应产物降解产物（如机体免疫系统对侵入微生物的反