血清蛋白质浓定量测定

1、nBCA法是近来广为应用的蛋白定量方法。法是近来广为应用的蛋白定量方法。 n操作简便，快速，灵敏度高，准确，试操作简便，快速，灵敏度高，准确，试 剂稳定性好，经济实用，抗干扰能力强剂稳定性好，经济实用，抗干扰能力强 【原理】：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为 Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物， 测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲 线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 【原理】： 基本原理 nBCA(bicinchoninic acid)法蛋白浓度定法蛋白浓度定 量：量： n在碱性环境下蛋白质与在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将络合并将 Cu2+还原成还原成Cu+（biuret

2、 reaction）。）。 BCA与与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，结合形成稳定的紫蓝色复合物， 在在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质处有高的光吸收值并与蛋白质 浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。 n【试剂】 n1、 试剂试剂A： n分别称取分别称取10g BCA二钠盐、二钠盐、20g无水碳酸无水碳酸 钠、钠、0.16g酒石酸钠、酒石酸钠、4g氢氧化钠氢氧化钠 、9.5g碳碳 酸氢钠，混合调酸氢钠，混合调PH值至值至11.25，加水至，加水至1L 。 n2、 试剂试剂B：4硫酸铜。硫酸铜。 n3、 BCA工作液：工作液： n试剂试剂A 100ml 试

3、剂试剂B 2ml混合。混合。 操作步骤 n1. 先将solutionA 摇晃混匀，根据样品数量， 按50体积solution A加1体积solutionB试剂 （50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。 BCA工作液在24小时内稳定。 n2、 蛋白质标准液：蛋白质标准液： n用结晶牛血清白蛋白用结晶牛血清白蛋白(BSA)根据其纯度根据其纯度用生理盐水用生理盐水 配制成配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液的蛋白质标准液。（纯度可经凯。（纯度可经凯 氏定氮法测定蛋白质含量而确定）氏定氮法测定蛋白质含量而确定） 3.绘制标准曲线： n取取6支试管，编号后分别加入支试管，编号后分别加入0mL、0.02

4、mL 、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL标准标准 蛋白质溶液蛋白质溶液(BSA)，然后各管分别用去离子，然后各管分别用去离子 水补充到水补充到0.1mL，最后各试管中分别加入，最后各试管中分别加入 2.0mLBCA工作液，工作液，每加完一管每加完一管，立即立即在漩在漩 涡混合器上涡混合器上混合混合（注意不要太剧烈，以免注意不要太剧烈，以免 产生大量气泡而难于消除产生大量气泡而难于消除），以蛋白质的），以蛋白质的 蛋白含量为横坐标、吸光度蛋白含量为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制为纵坐标绘制 标准曲线。标准曲线。 4.样品测定： 同绘制标准曲线方法，在一支试管中加入待 测样品0.

5、1mL代替标准蛋白质溶液，然后加入 2.0mLBCA工作液后，立即在漩涡混合器上混 合，测吸光度A，查标准曲线，求出待测样品 中蛋白质浓度（g/L）。 n【优缺点】 n(一) 操作简单，快速，45分钟内完成测定， 比经典的Lowary法快4倍且更加方便； n(二) 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的 蛋白质测定范围是20-200g/ml，微量BCA测 定范围在0.5-10g/ml。 n(三) 经济实用，除试管外，测定可在微板孔 中就进行，大大节约样品和试剂用量； n(四) 抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿 素等均无影响 n此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者此法测定蛋白质浓度，近些年被科

6、研工作者 广泛选用。目前广泛选用。目前BCA法的法的试剂盒试剂盒市面有售。市面有售。 n BCA蛋白浓度测定蛋白浓度测定试剂盒试剂盒(BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白是根据目前世界上最常用蛋白 浓度检测方法之一浓度检测方法之一BCA法研制而成，实现法研制而成，实现 了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵 敏度和高兼容性。敏度和高兼容性。检测浓度下限达到检测浓度下限达到25 微微 克克/毫升，最小检测蛋白量达到毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，微克， 待测样品体积为待测样品体积为120微升。微升。 试剂盒组成 n2.稀释标

7、准品：完全溶解蛋白质标准品 （5mg/mlBSA(牛血清白蛋白),-20保存）取10微升 用PBS(pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液)稀释至100微升 （样品一般可用PBS稀释），使终浓度为 0.5mg/ml。 n将稀释后的标准品（0.5mg/ml）按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升分別加到96孔板的蛋白标准品孔中， 加标准品稀释液补足到20微升。 体积 (ul) 02468121620 终浓度 （ug/ul) 00.050.10.150.20.30.40.5 npH7.4 pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（的等渗磷酸盐缓冲液（ PBS ）的配制）的配制 npH7.4 的等渗磷酸

8、盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.4,PBS）: nNaCI 8.0g nKH2PO4 0.2g nNa2HPO412H2O 2.9g nKCI 0.2g n将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量蒸馏水 溶解后，再定容至1000mL，调pH值至7.4, 高压消毒 灭菌112Kpa20min，冷却后，保存于4冰箱中备用 。 n6孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml, n12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml, n24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml, n96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml, n摘自司徒镇强的细胞培养 实验步骤实验步骤 实验步骤实验步骤

9、 n3、 待测样品：用双缩脲测定法的样品待测样品：用双缩脲测定法的样品 稀释而成。稀释而成。 n此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工 作者广泛选用。目前作者广泛选用。目前BCA法的法的试剂盒试剂盒市市 面有售。面有售。 n总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多 ，但是，还没有一个完美的方法。在选，但是，还没有一个完美的方法。在选 择测定方法时，可根据实验要求和实验择测定方法时，可根据实验要求和实验 室条件决定。室条件决定。 n【试剂】 n1、 试剂A：1BCA二钠盐 n2无水碳酸钠 n0.16%酒石酸钠 n0.4氢氧化钠 n0.95

10、碳酸氢钠 n混合调PH值至11.25。 n2、 试剂B：4硫酸铜。 n3、 BCA工作液：试剂A 100ml 试剂B 2ml混合。 n4、 蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成 1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确 定） n5、 待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。 n此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试 剂盒市面有售。 n总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法 。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。 实验步骤实验步骤 n 加适当体积样品到96孔板的样品孔中， 加标准品

11、稀释液不足道20ul。 即：将蛋白质样品作适当稀释（最好多做 几个梯度，如作2倍、4倍、8倍稀释 n 4. 各孔加入200微升BCA工作液，用加 样枪轻轻吹打混匀（注意：不要弄出气 泡影响读数），37放置30-60分钟。 n冷却到室温后，用酶标仪测定A562nm， 或540-590nm之间的其他波长的吸光度， 根据标准曲线计算出蛋白浓度。 n【计算】 n（一） 绘制标准曲线。 n（二） 以测定管吸光度值，查找标准曲线， 求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。 n（三） 再从标准管中选择一管与测定管光密 度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度 (g/L)。 基本原理 nBCA(bicinchonin

12、ic acid)法蛋白浓度定法蛋白浓度定 量：量： n在碱性环境下蛋白质与在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将络合并将 Cu2+还原成还原成Cu+（biuret reaction）。）。 BCA与与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，结合形成稳定的紫蓝色复合物， 在在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质处有高的光吸收值并与蛋白质 浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。 操作步骤 n1. 先将solutionA 摇晃混匀，根据样品数量， 按50体积solution A加1体积solutionB试剂 （50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。 BCA工作液在24小时内

13、稳定。 n2.稀释标准品：完全溶解蛋白质标准品 （5mg/mlBSA(牛血清白蛋白),-20保存）取10微升 用PBS(pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液)稀释至100微升 （样品一般可用PBS稀释），使终浓度为 0.5mg/ml。 n将稀释后的标准品（0.5mg/ml）按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升分別加到96孔板的蛋白标准品孔中， 加标准品稀释液补足到20微升。 体积 (ul) 02468121620 终浓度 （ug/ul) 00.050.10.150.20.30.40.5 n6孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml, n12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml, n24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml, n96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml, n摘自司徒镇强的细胞培养 n【试剂】 n1、 试剂A：1BCA二钠盐 n2无水碳酸钠 n0.16%酒石酸钠 n0.4氢氧化钠 n0.95碳酸氢钠 n混合调PH值至11.25。 n2、 试剂B：4硫酸铜。 n3、 BCA工作液：试剂A 100