内蒙古大学生物技术 基因工程实验论文1

1、2 分类号: Q78 编号: 00911094 本科生基因工程实验论文纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达指导教师：苏慧敏 学 生： 专 业： 生物技术 年 级： 2009级 2012年9月12 日 17 目 录摘要11 绪论22 材料与方法.2 2.1 材料.22.1.1 菌株与质粒2 2.1.2主要试剂及其配制 2 2.1.2.1 试剂22.1.2.2 试剂与培养基的配制22.1.1.3 主要仪器5 2.2 方法.52.2.1纳豆激酶（NK)引物的设计52.2.2 NK基因的PCR扩增及电泳检测52.2.3 DH5a和BL21(DE3)感受态的制备92.2.4 pMD19-T-N

2、K的构建及转化和鉴定102.2.5 pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切与回收112.2.6 pET-Trx-NK的构建及转化和检测112.2.7 pET-Trx-NK的诱导表达及SDS-PAGE检测113 结果与分析133.1 NK基因的PCR扩增133.2.pMD19-T-NK的构建与鉴定133.3 pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切和回收143.4 pET-Trx-NK的构建与检测143.5 pET-Trx-NK的诱导表达与SDS-PAGE检测14结论与讨论15参考文献15致谢与感想16内蒙古大学生命科学学院生物系本科生基因工程实验论文纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌

3、中的表达摘要 纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。纳豆激酶基因长度约为800bp.本实验通过构建纳豆激酶基因表达载体，使纳豆激酶基因在大肠杆菌中顺利表达.我们从经克隆在PMD-18-T载体上的纳豆激酶基因，用PCR技术扩增后获得其800bp的目的基因片段，将该基因片段同pMD19-T克隆载体连接后转入DH5a菌中，扩增带有目的基因的质粒，然后筛选出重组子。对重组子运用限制性内切酶双酶切后得到纳豆激酶基因片段，将该基因片段插入表达载体PET-trx中，转入BL21表达宿主菌中，通过IPTG进行诱导，用SDS-PAGE检测诱导产物纳豆激酶。关键词：纳豆激酶，基因表达，载体，大肠杆菌Const

4、ructing Expression Vector and Expressing NK in E.coli Author： Supervisor: Su HuimingABSTRACTNattokinase(NK) is a good natural protease thrombolytic substance. It is Gene length about for 800bp. This experiment through building Nattokinase gene expression vector, make it express in Escherichia coli.

5、We acquired Nattokinase gene from clonened in PMD-18-T vector by PCR(Polymerase chain reaction), and obtained the 800bp of target DNA fragment .Then we connected it with PMD19-T vector and transferred it in DH5a bacteria , screened out recombinants. We got nattokinase gene fragment resulting from th

6、e recombinants which cut by Restriction endonucleaset , and inserted the gene fragment into expression vector PET-trx,. We transferred the PET-trx vector into BL21 (DE3) bacteria, Through the IPTG induced, NK gene expressed, using SDS-PAGE detection result of nattokinase.KEY WORDS: Nattokinase, gene

7、 expression, vector，E.coli1 绪论纳豆是一种简单易得的有营养的优质发酵食品，是将接种过纳豆杆菌的蒸煮大豆在适当温度、湿度下发酵得到的。纳豆源于中国，而因其独特的风味、制作方便和有效的营养和保健功效而深受日本民众喜爱。纳豆具有很丰富的营养价值，富含蛋白质、各种氨基酸、维生素、矿物质，经发酵后营养更容易消化吸收。研究表明，纳豆的保健功能主要与其中的纳豆激酶、纳豆异黄酮、皂青素、维生素K2等多种功能因子有关。此外纳豆激酶还具有降血压，降血脂，降胆固醇，抗氧化等多方面作用。纳豆激酶在所有的纤溶酶类产品中研究最早，目前也是开发最多的溶栓剂产品，国内外对纳豆激酶已有二十多年的研究

8、，其理化性质 溶栓机制 分离纯化等已被人们所了解，纳豆激酶类药品及保健食品的研究正在进行当中【1】。1980 年须见【2】教授在美国芝加哥大学进行血栓溶解酶pro- UK与UK的构造分析研究时，无意间发现纳豆食品中含有高浓度的血栓溶解成分，纳豆食品在发酵过程中会产生一种丝氨酸蛋白酶，将其命名为纳豆激酶(Nattokinase, NK)， Nakamura【3】等首次报道了包括调控顺序在内的1473bp的 NK全长基因序列，NK基因以GTG为起始密码子，随后是1143bp组成的阅读框架，N端的第129个氨基酸残基是信号肽，第30106的77个氨基酸残基是前肽，随后的275个氨基酸残基为纳豆激酶成

9、熟肽。这使从基因工程角度入手提高纳豆激酶活性及产量成为可能。更进一步的研究表明，纳豆激酶能有效的溶解血栓，与临床药物如尿激酶（UK）、链激酶（SK）等相比，具有在体内的半衰期长，易被人体吸收，无副作用，生产成本低，能激活血管内皮细胞的组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）以进一步增强溶栓作用等优点，所以纳豆激酶可以被开发为同时具有预防和治疗功效的新型的溶栓药物【4】。目前，国内外对纳豆激酶的研究主要集中在优化枯草杆菌发酵条件以提高产量，蛋白结构分析，生理生化特性，药理药效等方面【5】。另外，日本学者还通过药物刺激、紫外线诱变、放射性照射、细胞融合和染色体插入变异等方法获得纳豆激酶高产菌株。而近年来以

10、基因工程方法构建纳豆激酶的高效表达载体，优化表达系统来提高纳豆激酶的表达水平一直是研究的热点，并且取得了很大的进展【6-7】。国内主要进行了纳豆杆菌液体发酵条件、纳豆激酶的春花等方面的研究，目前利用原核（如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）或真核细胞（如毕赤酵母）进行基因表达纯化后获得的纳豆激酶，其活性普遍较低【8】。因此，纳豆激酶的研发潜力和空间都是巨大的，纳豆激酶极有希望成为新一代理想的预防和治疗血栓的生化药物。 本实验的目的在于构建纳豆激酶基因重组表达载体，并对其表达进行初步研究，首先旨在利用实验室基本仪器进行基因工程以及分子生物学实验的熟练操作，其次也旨在利用基因工程技术提高纳豆激酶的产量，为生

11、产实践和药物开发提供理论依据。2 材料与方法【9】2.1材料2.1.1 菌株与质粒本研究所采用的是本基因工程实验室保存的已经克隆在PMD-18-T载体上的纳豆激酶基因，菌株为E.coil DH5a、BL21，表达载体PET-trx、克隆载体PMD19-T来自美国基因动力实验室公司，为本基因工程保存提供.2.1.2主要试剂及其配制2.1.2.1 试剂DNA HindIII、Tiangen 公司的Marker III 、EcoR I 和 BamH I 内切酶、 Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、DNA 凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、dNTP 混合液、X-gal、 IPTG、低分子量蛋

12、白分子量 Marker：97.4、66.2、43、31、20.1，14.4 kDa等。其他常用试剂均为进口或国产分析纯。2.1.2.2 试剂与培养基的配制1、LB培养基（按 1L的量计算） 胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,加200ml dd water搅拌完全溶解，用约200uL 5N NaOH调PH至7.0，加dd water至1L，121C 20min分装灭菌。在培养菌种时，向里面加入20%葡萄糖，终浓度为 0.2%。提取质粒时，向里加入氨苄青霉素，终浓度100ug/mL.2、0.1mol/L CaCl2溶液 称取60mmol/L的CaCl2 3.330g,充分溶解；称取

13、10mmol/L PIPES3.35g，充分溶解；量取15%的甘油75ml。三者混匀后，加蒸馏水至500ml，121C 20min分装灭菌后4C保存。3、50TAE缓冲液（pH约8.5） Tris碱242g,57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA-2H2O,dd water定容至1L，用时稀释 成1.4、1000溴化乙锭储存液（0.5mg/mL)： 50mg溴化乙锭溶于100mldd water,4C避光储存。使用时在蒸馏水里滴入适量，使水看起来微微发红即可。5、 氨苄青霉素储存液 无菌超纯水配制100mg/mL,分装后-20C保存。6、 0.5mol/L EDTA pH8.0 称取18

14、.61g Na2EDTA-2 H2O，加入约80mL的去离子水，充分搅拌。用NaOH颗粒调节pH值至8.0（约2g NaOH）,使其完全溶解。加去离子水将溶液定容至100mL。高温高压灭菌。7、1mol/L Tris HCl pH7.5 称取12.1g Tris碱,加80mL蒸馏水，缓慢地加浓盐酸至 pH6.8（约加6.5mL）。让溶液冷却至室温，调至pH7.5，加蒸馏水至100mL。高温高压灭菌后4C保存.8、1mol/L Tris HCl pH8.0 称取12.1g Tris 碱, 加80mL蒸馏水缓慢的加浓盐酸至 pH8.0（约加4.2mL）。让溶液冷却至室温，调至pH8.0，加蒸馏水至

15、100mL。高温高压灭菌后 4C保存.9、去盐分溶液的配制（1）溶液I 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液:50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA,调pH8.0.（2）溶液II（NaOH/SDS 溶液)：0.2mol/L NaOH，1% SDS，现用现配.（3）溶液III KAc 溶液（pH4.8）：60mL 5mol/L KAc，加冰乙酸调至 pH4.8 ， 补dd water至100mL.10、 TE-缓冲液的配制 10mmol/L Tris HClpH8.0.1mmol/L EDTA pH8.0，高温高压灭菌.11、 加样

16、、上样缓冲液的配制（1）10加样缓冲液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝；（2）6加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。（3）2上样缓冲液：0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2mL，甘油 2mL，20%SDS 2mL， 0.1%溴酚蓝0.5mL.（4）5电泳缓冲液：Tris 7.5g ，甘氨酸 36g，SDS 2.5g，加 dd water至 500mL，使用时稀释5倍12、95%和70%乙醇（各配制100ml)（1）95%的乙醇配制：量取95ml无水乙醇，加水至100ml,混匀即可。（2）7

17、0%的乙醇配制：量取75ml无水乙醇，加水至100ml,混匀即可。13、10%SDS 蒸馏水配制，室温保存。14、30% Acr（丙烯酰胺）/Bis（N,N-亚甲基双丙烯酰胺）：30g Acr+0.8g Bis，用 dd water 定容至100mL，4C棕色瓶避光保存。 17、20（M/V）%IPTG无菌水配制，过滤灭菌。18、100mg/mL（M/V）IPTG 无菌水配制，过滤除菌19、2%（M/V）X-gal：用 N,N-二甲基甲酰胺配制，过滤灭菌。20、 考马斯亮蓝 R250 染色液 考马斯亮蓝 R250 0.25g + 45mL 甲醇+10mL 冰醋酸，用dd water定容至 10

18、0mL21、脱色液的配制95%乙醇/冰醋酸/水= 4.5/0.5/5（体积比）2.1.1.3 主要仪器Biometra公司的PCR仪、北京六一仪器厂的GYY-1型电泳仪及DYCP-31D型水平凝胶电泳槽、英国Grant的凝胶成像仪 、德国Eppendorf的AG5415R型台式离心机，太仓科教器材厂的旋涡混合器，美国Thermo Fisher Scientific公司的微量移液取样器，金坛市富华公司的SHE-723G的恒温振荡器，双面微量离心管架，试管架，标签纸，制冰机。英 国 Grant 公司的PHC -19干式 恒 温 器、LG公 司 的 微 波 炉、太仓 科 教 器 材 厂的 涡 旋 振

19、 荡 器、电子天平、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、恒温水浴锅、紫外分光光度计、超净工作台等。2 .2 实 验 方 法2 .2 .1 纳 豆 激 酶（ NK )引 物 的 设 计上游引物（5端带 BamHI 酶切位点） 5-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3下游引物（5端带 EcoRI 酶切位点） 5-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3待扩增的 NK 片段长度：837bp（825bp NK+5BamH I 位点 GGATCC，3EcoRI 位点 GAATTC）。2.2.2 NK基因的PCR扩增及电泳检测1. 取 1L老师提供的质粒 pMD19-T-NK，

20、加入 9L dd water 稀释作为 PCR 模板。2. 在 0.2mL PCR 微量离心管中按下列参考剂量配制 50L 反应体系：45L PCR supermix ；1L模板 ；1L引物1 ； 1L引物2；1L ddwater； 共计50L。 3. 根据 PCR 仪的操作手册设置 PCR 仪的循环程序：（1） 94C 5min （2） 94C 1min （3） 60C 1min （根据引物的 Tm 值设定）（4） 72C 1min50s （根据所扩增的 DNA 的长度设定）（5） go to（2） 29 times（6） 72C 10min4、PCR 结束后，取 510L 产物进行琼脂糖凝

21、胶电泳，观察胶上是否有预计分子量的主要产物带。电泳步骤：a) 称取 0.25g 琼脂糖粉，放入三角瓶，加入 25mL 1TAE 电泳缓冲液（注意原液是 50，需要自己 稀释！），用保鲜膜盖住，放入微波炉中烧开（0.5min）。25mL 正好能倒满一块小胶。注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉。b) 戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却至不烫手。c) 把梳子（最细的齿）插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边 缘相差 12mm 即可，但尽量不要太厚，更不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置 1020 分钟 待胶完全凝固。d) 在水平电泳槽中加满1TA

22、E 电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至 10V/cm（170V），注意正负电极的位置连接正确。e) 待胶完全凝固后（1520 分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶，放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中，凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极（黑色电极。f) 取 1只PE手套 点 6L蒸馏水、1L 10加样缓冲液，再加入 3L 质粒 DNA 溶液制成 10LDNA混合样品。g) 在凝胶上选择相邻的加样孔。用 10L的吸液头分别将纸上的混合样品加入凝胶的加样孔中。在电泳 PCR 产物或酶切产物时，在相邻的加样孔中加入 3L DNA 分子量标准物。h) 打

23、开电源开关，170V 300mA电泳。电泳将进行约30min。当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。i) 把带有样品的凝胶小心放入盛有 EB 的搪瓷盒中。以下需戴手套到专门的染色区操作。放置约 10 分钟后，取出来在自来水中浸泡 10min。用自来水冲洗后放入凝胶成像系统中拍照。j) 染有 EB 的凝胶和手套（只要手套没破，可以节约使用：将手套脱下来以后张开口放在染色区， 下一次把手伸进去即可）要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。不可用接触过 EB 的手套接触电脑或凝胶成像仪的门。2.2.3 DH5a和BL21(DE3)感受态的制备1. 取一支无菌的摇菌试

24、管,在超净工作台中加入 2mL LB 培养基（不含抗菌素！） 2. 从超低温冰柜中取出 DH5a菌种和 BL21(DE3)菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含 2mL LB 培养基的试管中，37摇床培养过夜。3. 在超净工作台中取 0.5mL 上述菌液转接到含有 50mL LB 培养基的三角烧瓶中，37下 250r/min摇床培养 23h。4. 取少量菌液测定 OD590 为 0.45（0.4 OD 0.6），细胞数108/mL，此为关键参数。以下除离心外，都在超净工作台中进行。5. 将菌液分装到1.5mL预冷的无菌微量离心管中，于冰上放置 10min，然后

25、于4，5000r/min 离心 10min。6. 弃上清，并将离心管倒置以倒尽上清液。加入 1mL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶 7. 液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置 30min。8. 4，5000r/min 离心 10min。弃上清液后，用 1mL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液垂悬，插入冰中放置 30min。9. 4，5000r/min 离心10min。弃上清液后，用 200L冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管 50L分装到 1.5mL的无菌微量离心管中。10. 分装好的感受态菌可以直接用作转化实验，或立即放入-80超低温冰柜

26、中保 藏（可存放数月）。以后用的时候每次用完一管，不可反复冻融。2.2.4 pMD19-T-NK的构建及转化和鉴定1.取一个高压灭活的 0.5mL 微量离心管，加入载体连接体系：2L PCR产物；2Lm pMD19-T载体；1L 10Buffer缓冲液；4L dd Water ，1LmT4DNA连接酶。共计10L.2.将上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14水中保温3h。3.从-80超低温冰柜中取出一管（50L）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴510min。4.加入5L连接好的质粒混合液（DNA含量不超过 100ng） 轻轻震荡后放置冰上 20min。5.轻轻摇匀后，42水浴

27、 12min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置 35min。6.在超净工作台中向上述管中加入 300L LB 培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的 弹簧架上 37震荡 45min。7.在超净工作台中，向上述离心管中加入40L X-gal和7L IPTG，混匀用以进行蓝白斑筛选。8. 取上述混合液50300L滴到含合适抗菌素的固体 LB 平板培养皿中。从酒精中取出玻璃涂布棒，在火上点燃，熄灭后稍等片刻， 待其冷却后轻轻涂布均匀。9.在涂好的培养皿上做上标记，先放置在 37恒温培养箱中约 1030min 直到表面的液体都渗透 到培养基里后，再倒置过来放入 37恒温培养过夜.10.在转化的

28、平板培养基上随机选取 3 个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部 玻璃背面画圈做标记编号。11.在超净工作台中取 3 支无菌摇菌管，各加入 3mL LB（含 100mg/mL 氨苄青霉素），用记号笔写好编号。12.在超净工作台中用取液枪枪头尖挑取转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将枪头打入盛有 3mL LB（含 100mg/mL 氨苄 青霉素）的摇菌管中。13.37摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。14.将提取到的 3 管质粒样品与已知分子量的质粒同时电泳，根据分子量判断和选取有插入片段的质粒。2.2.5 pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切与回收1. 先准备一个冰盒

29、并放入一定量的冰块。混合下列溶液于一个高压灭菌的0.5mL 微量离心管中：8L 质粒DNA（pET-Trx或pMD19-T-NK） ；4L 10酶切缓冲液(BamHI) ；1L EcoRI ; 1L BamHI .共计40L。2.轻轻震动微量离心管，使管中的溶液混匀。再在离心机中 2000r/min 离心 10 秒。取出后插到水漂的孔中，在 37水浴中酶切 3.5 h。3.取少量（约 10L）酶切产物，与合适的已知分子量的 DNA（先前的 PCR 产物或 Marker 等） 对比电泳，确认酶切成功后，进行片段的回收。4.电泳结束后用薄塑料片（如 卡）切下含有小样 DNA 酶切产物的泳道，EB

30、染色。在紫外灯下找到目的 DNA 带，用刀片在目的 DNA 带的下上下边缘各切一个小口作为标记。含有大量 DNA 酶切产物的凝胶既不用 EB染色，也不用紫外灯照射。5.将做好切口标记的凝胶条用保鲜膜包住，与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的切口标记 估计未染色的大胶上 DNA 酶切产物的位置，用刀片切下大胶中 DNA 产物所在的凝胶。6.按照上海生工 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒操作步骤回收pMD19-T-NK片段。2.2.6 pET-trx-NK的构建及转化和检测1.取一个灭菌的 0.5mL 微量离心管，加入连接体系：4L NK回收片段；1LPET-Trx载体、酶切回收片段；

31、0.5L DNA连接酶（TAKARA,350L/mL);1L连接酶缓冲液。共计10L。2.将上述混合液轻轻震荡后离心1min，然后置于14干式恒温仪中保温过夜。3.运用质粒DNA转化技术将质粒混合物转入DH5a菌中，再进行检测，筛选出连接产物。2.2.7 pET-Trx-NK的诱导表达及SDS-PAGE检测1.按下列组合用 IPTG 进行诱导表达：BL21（DE3）空菌 不加 IPTGpET-his 转化的 BL21（DE3）菌 加 IPTG 至 100mg/mLpET-his-NK 转化的 BL21（DE3）菌 加 IPTG 至 100mg/mL2.150170r/min 37C 摇菌 1.

32、53h。3.10004000r/min 离心 15min，弃掉上清液，收获菌体。4.将表达后的菌体与 2上样缓冲液按 1：1 混匀于微量离心管中。5.将上述微量离心管用封口膜封住管盖，插入水漂中，放在电磁炉锅里的沸水中煮 35min。然后 立即插入冰中。（可在-20C 冰柜中保存）。6.清洗并擦干电泳玻璃板，组装电泳槽。7.配制 10%分离胶：按顺序和量取下列溶液混在一个 50mL的小烧杯中（Tris为pH8.8）：Acrylamide-Bis 3.96 mL1M Tris PH8.8 4.38 mLD.dWater 3.432 mL10%SDS 118.8LTEMED 9.9L10%APS

33、118.8L8.配支持胶：按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个 50mL 的小烧杯中（注意 Tris 为pH6.8）：Acrylamide-Bis 0.675 mL 0.5M Tris pH6.8 0.563 mL dd water 3.165 mL10%SDS 45LmTEMED 7.545Lm10%APS 4545Lm8、按实验手册规范倒胶。9.配制约 400mL 1电泳缓冲液。将电泳槽倾斜，在电泳槽的下部缓慢加入 1电泳缓冲液。同时 观察在玻璃中胶下缘的气泡随液面被赶出，然后放平电泳槽。在上部倒满电泳缓冲液（约 250mL),缓慢小心地拔出梳子。如发现加样孔形状歪斜，用注射器针

34、头（剪平尖部）或细铁丝修平加样 槽底部和侧面的胶面。10.选取几个形态好的加样槽，在实验记录本上做好对应的标记。用微量移液器在侧面的一个加样 槽中加入 510L低分子量蛋白分子量 Marker，其它槽中加入 1020L 自己制作的样品。11.接好电极，将电流调至10mA，待溴酚蓝移到分离胶后，再将电流调至 20 mA，电泳约 23h，期间随时观察电泳槽下部胶的前沿是否有气泡。当溴酚蓝移到玻璃距底部 0.5cm 时切断电源。12.在一个搪瓷盘里准备适量的考马斯亮蓝染色液。13.倒掉电泳槽中的缓冲液，取下玻璃。小心用或 卡从下部将带有缺口的玻璃板撬起14.染色 1045min后,把胶移入脱色液，轻

35、轻摇动脱色过夜。15.观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子量（NK 蛋白约3340kDa），判断是否是预期的基因产物。3 结果与分析3.1 NK基因的PCR扩增NK基因全长837bp，在本实验中我小组得到良好的结果，PCR产物进行电泳检测，得到高亮度、高特异性的条带。但由于实验室人数较多，多人使用电脑，我小组的PCR产物检测电泳图丢失，可能是其他小组或实验人员保存电泳图时操作失误将我小组的图像覆盖，造成丢失。3.2 PMD19-T-NK的构建与检测（图1：提取得三种质粒电泳图：、号泳道分别为：PMD19-T、PET-trx、PMD19-T-NK）电泳图显示，PE

36、T-Trx、PMD19-T-NK、PMD19-T的质粒提取都不是很理想，条带模糊而且不太明亮，但质粒的存在说明了这三个菌种在培养过程中进行了增值，可能由于电泳时点样手抖得原因，导致了条带不清晰，但该电泳结果表明，实验材料是可用的，可进行下一步实验。3.3 pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切和回收 图2 图3 图4图2为PET-trx酶切产物的电泳检测图，泳道1为DNA Marker，泳道2为PET-trx酶切产物，由图可见酶切产物的条带特异性高、亮度适中，所以PET-trx的酶切产物可以用于胶回收。图3为PMD-19-T-NK酶切产物的电泳检测图，泳道1为DNA Marker，泳道2为

37、PCR产物，泳道3为PMD19-T-NK酶切产物，由图中可见酶切产物没有明显的条带，所以证明酶切产物不能用于胶回收。图3为PET-trx的胶回收产物的电泳检测，泳道1为未酶切的PET-trx载体，泳道2为胶回收产物。由图可见胶回收产物条带特异性高、亮度强、大小适当，证明PET-trx胶回收非常成功，产物可以用于后续实验。3.4 pET-Trx-的构建与检测 由于第三大组的人全部没有提取到双酶切后的NK基因，所以我小组采用了老师提供的已经连接好的PET-trx-NK质粒直接转化到BL21感受态菌体中3.5 pET-Trx-的诱导表达与SDS-PAGE检测 M 1 2 3 4 5 6 图5 图5中

38、条带顺序为预染低分子量蛋白质Marker（14.397.2KDa）；1-5泳道：无IPTG空菌BL21、IPTG空菌BL21、。3、4、5蛋白条带分别对应于图5中1、2、3泳道质粒电泳图对应的菌株。图6中pET-trx-NK 载体转化后的蛋白电泳图，将图和marker 的标准条带对比可知，目的条带在26.0 KDa 和33.0 KDa 之间，且各组实验结果均比较明显。所以pET-trx-NK 载体的诱导表达这步骤做的都比较相当成功。4 结论与讨论 NK基因的扩增效果比较好，电泳条带显示，扩增的NK片段长度大约为837bp，在目的基因NK转入DH5a菌后，通过提取质粒，我们可以得知其转化情况，我们小组采用了传统的、未改进的治理提取方法，从预期上讲，该方法的治理提取效率应该相对比用试剂盒提取效率高，同时实验结果也证明的确如此。在pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切实验中，PET-trx的酶切和胶回收的效果还是比较好的，酶切产物片段大小符合预期，但是PMD19-T-NK的结果不好，没有酶切产物，应该是在配置酶切混合液体系是加药品的量不准确造成的。实验中还存在很多问题，实验前未能提前进行很好地策