紫杉醇和吡柔比星治疗骨肉瘤的分子机制研究

1、紫杉醇和吡柔比星治疗骨肉瘤的分子机制研究 河北医科大学 硕士学位论文 紫杉醇和吡柔比星治疗骨肉瘤的分子机制的研究 姓名：林亮 申请学位级别：硕士 专业：外科学 指导教师：刘思源 20090301 中文摘要 紫杉醇和吡柔比星治疗骨肉瘤的分子机制的研究 摘 要 目的：骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于 10-20岁的青少年，恶性程度高，预后差【11，手术和化疗在临 床治疗骨肉瘤提高患者生存期中发挥着重要和关键的作用 12。但是，在骨肉瘤复发患者的化疗中发现存在高的失败率 和较低的中位生存率【3】。研究骨肉瘤化疗机制对骨肉瘤的治 疗和提高病人的生存率是非常必要的。吡柔比星已临床用于 治疗骨肉瘤

2、，而紫杉醇只作为治疗骨肉瘤的二线用药而且应 用不如吡柔比星【41。目前已有吡柔比星和紫杉醇在临床上联 合应用的报道【571。然而，很少有对化疗药物诱导骨肉瘤细 胞凋亡的分子机制的研究。因此，为了找到更加合理和-彳了效 的综合治疗方箸：，本实验研究了吡柔比星和紫杉醇诱导凋1 活性的分子机制。 10DMEM培养基中常规培养，待细胞进入对数生长期后月j 于实验。 l光镜观察：将不同浓度的紫杉醇和吡柔比星作用于 MG63细胞，在倒置相差显微镜下定时观察细胞的生长情况 并照相。 2 培养于96孔培养板中，进入对数生长期后采用四甲基偶氮 中文摘要 作用。 3流式细胞仪检测细胞周期：采用不同浓度的紫杉醇和吡

3、 度为5106个，用PBS洗一次，离心去上清；加入冰预冷 TrintonX1001O 室温避光 PropidiumIodide，PI：50mgL II型流式细胞仪检测细胞凋亡和细 染色30min，用EpicsXL 胞周期分布，应用软件进行分析。 4Western印迹法观察紫杉醇及吡柔比星作用后的人成骨 的表达。 杉醇处理MG一63细胞12h后，细胞折光变强，部分细胞体 积变小变圆，24h后细胞开始皱缩，贴壁能力差，细胞体 ：； 更小，少量细胞漂浮，48h后细胞体积普遍变小，胞质浓缩， 大量细胞变圆漂浮，72h后大部分细胞变圆，失去增殖能力 漂浮于液体中，出现明显的药物抑制现象。103nmolL

4、吡柔 比星作用12h后细胞增值数量减少，细胞体积增大胞膜破裂 胞质外溢，细胞坏死漂浮，24h后分裂期细胞少见，胞膜破 裂细胞坏死，漂浮细胞增多，48h后大部分细胞形态不规则， 体积增大，坏死漂浮，存活细胞颜色晦暗，生长停滞，72h 中文摘要 显示紫杉醇和吡柔比星均能明显抑制MG63细胞增殖，并 后，G0G1期前面出现凋亡峰，G2M期所占比例随药物浓 度和时间增加呈上升趋势，而G，期所占比例呈递减趋势。 48h、72h后未见明显凋亡峰出现，S期所占比例随药物浓度 紫杉醇和吡柔比星处理过的骨肉瘤细胞与对照组相比均表 蛋白表达增强。 结论： 1 紫杉醇和吡柔比星均对骨肉瘤细胞MG63 存在抑制细胞增

5、殖作用且具有时间剂量依赖关系。 随时间 延长不同浓度吡柔比星对细胞的最终抑制作用是一致的。凋 亡峰最高时的浓度可能是最适浓度。低浓度紫杉醇长时间和 高浓度紫杉醇短时间对细胞抑制作用致。浓度和时间不是 很重要的选择，凋亡峰最高的时间和浓度效果最佳。 用，并且有一定的时间剂量依赖性，使细胞周期受到阻滞， 并进一步诱导其凋亡。吡柔比星在细胞增殖周期中阻断细胞 进入G2期，使细胞停滞于S期，抑制DNA合成干扰细胞 分裂。在一定范围内存在时间剂量依赖性且对剂量关系更密 中文摘要 切。不同浓度紫杉醇作用骨肉瘤细胞后G0G1期比例整体呈 下降趋势，表明紫杉醇对细胞增殖周期的G0G1期存在阻断 作用，具体机制

6、有待进一步研究。不同浓度吡柔比星作用骨 肉瘤细胞后细胞G0G1比例呈先下降后上升趋势，表明吡柔 比星对骨肉瘤细胞增殖周期GOG1期延缓作用。 3 如果S期过大时停药可导致肿瘤细胞继续分裂， 且分裂很快，如果是G2M期，停药后细胞很快进入S期。 细胞被阻滞于GO期是最有效的。浓度过低时未见明显凋亡 峰说明药物只杀伤正常细胞达不到杀伤肿瘤细胞的目的。浓 度过高时仍无明显凋亡峰出现，表明浓度过高时凋亡较少且 相对副作用较大。只有合适有效浓度时，即凋亡峰明显时达 到杀伤肿瘤细胞的目的。吡柔比星还可能通过破坏骨肉瘤细 胞MG63细胞膜的结构和功能直接杀死细胞。 4 紫杉醇可与吡柔比星联合应用治疗骨肉瘤。

7、 关键词：紫杉醇；吡柔比星；MG一63；细胞凋亡：MTT； 流式细胞；抗体 英文摘要 ofCell MolecularMechanism The Apoptosisby andPirarubicininaHuman Paclitaxel CellLine 0steosarcoma ABSTRACT in is suffered ective：Osteosarcoma，whichmainly Obj adolescentof1020 themostcommon old，is primarily years thelower witha and bonetumor highermalignancy

8、 malignancy and and playsignificant chemotherapy prognosis【l】Surgery to cancertreatment inclinicalantiosteosarcoma crucialroles failure achieve survival哆However,ahigh prolongedpatient are in ansurvivalrate observed rateandlOWmedi patients with intractable recurrent， chemotherapy undergoing the survi

9、val osteosarcomat31Topatient rate， improve ofthemechanismof for investigation chemotherapy treatmentiS hasbeen osteosarcomaveryimportantPirambicin the while usedforthetreatmentofosteosarcoma clinically wasusedasthe chemicalfor paclitaxel secondary drug andthe waslessthan osteosarcoma application The

10、antitumorof and havebeen paclitaxel potencypirarubicin inclinical few welldocumented of carriedoutonthe ofthemechanisms studieshave analysis findmore bonetumorcell orderto inducing deathTherefore，in andeffectivecombination we reasonable treatment，here 5 英文摘要 the investigatedpossible of apoptosisindu

11、cingactivity treatmentwith and pirarubicin was paclitaxelOur experiment aboutthemolecules mechanism ofthe of apoptosis osteosarcomawhich hadbeen might used and by pirarubicin clinicaltreatment paclitaxelfor Methods：MG?63cells wereculturedat37inDMEM with1 supplemented0heatinactivatedFBSinthetissue cu

12、lture flaskunderahumidified to 5C02 the when enteredthe experiment they logarithmicgrowth phase 1 Light observationofcell microscopy concentrations changes：differentof andTHPwere paclitaxel roledintheMG一63 cellsandtoobservatthe ofcell growth in invertedcontrast to regularly phase and microscope phot

13、o cultures 2 MTTessay：Thewereinitiatedi n96well plates x ata of5 104Cellswere for treated72hwith density various o 02 03 04 concentrations 1nmolL，1nmolL，1 nmolL，1nmolL of 03 04 05 paclitaxelor 102nmolL，1nmolL，1 nmo nmolL，1 lL of with three wellsfor each pirarubicin replicate concentration The relati

14、vecellnumber ofadherentcellswas thendetermined theMTTmethod by cellswere with 3 Flow treated cytometryanalysis：The various concentrationsof and for24h paclitaxelpirarubicin Thenwe cellsfromcontrol gathered group withoutmedication ， identical concentrations 1 0znmolL paclitaxel group，and identical 1

15、on concentrations 10jnmolL pirarubicin2h， group 6 英文摘要 48hand72h 5100cells respectivelyWegot and attherateof1 washedoncewithPBSand 000rmin，then harvested in 1bovineserum bytrypsinization，washed fixedwith 75ethanol O5 albumin BSA and containing between20forat1east1 hat4Thecellswerewashedinl BSAand in

16、acold Pirarubicinsolution resuspended staining 00 RnaseAand10 Pirarubicinin mlfor 1 Itgml ggml PBS 1 minat 40 4Data and werecarriedout acquisitionanalysis by aflow erton， using cytometrysystem BeckmanCoulter,Inc，Full CA，USA blot observedthe of 4 Westernanalysis：Wre expression andbaxin and PCNA，cycli

17、nD1，cyclinE，Bcl一2 paclitaxel PirarubicintreatedMG一63westernblot by theMG一63cellstreated Paclitaxel Results： 1 After by 1 about observedthatundertheinvertedcontrast 2h，we phase became cellsrefraction volumeof microscope，the strong，the somecellsbecameround after and small，and 24h，cellsbegan to adhere

18、became ofthem shrink，theability weak，volume fewcells volumeofcells smaller,a floated，after48h，the becamesmaller lotofcells concentrated，a universally,cytoplast roundand came the became whenit to of floated，and 72h，most floatedandthe cells became treated change significantAfterby 105nmolLPirarubicin1

19、2hthe numberofcells increasing decreasedandvolume membrane enlarged，cell broke，and floatedAfter at cells overflew,necrotic 24h，cells cytoplast fission could be membrane stage seen，cell broke，more rarely 7 英文摘要 necroticcells after ofmostcell floated，and48h，thetype became ofthembecame cells irregular,

20、volume larger,necrotic the cellswere floated，even tarnish，stoppedgrowing living After cellsfloated MTT 72h，necrotic increasingly 2 The thatafter MG63cellsindifferent resultsshowed wetreated with indifferent time12h，24h、48hand72hand drugs 0 02 03 04nmolL concentration， 1nmolL，1nmolL，1nmolL，1 02 03 04

21、 05nmolL Paclitaxel， 1nmolL，1nmolL，1nmolL，1 ofthe could retrainthe Pirarubicin，both significantly drugs of theeffectivenesson MG一63，and depended multiplication time anddose I-CM ofexperiment thatwhenthecellsweretreatedindifferent found analysis，we concentrat 1OnmolL，10nmolL，10nmolL，1 andthen identic

22、al at by concentrations 1 12h、24h、48hand of cameoutbefore 72h，thepeakapoptosis G0G1 ofG2M increasedassociated percentagestage stage，the oftimeand the of with concentration，and increasing percentage G1 hadthe ofdecreaseAndwhenthecells stage tendency treated in different were byPirarubicin 103nmolL、10

23、4 102nmolL、 nmolL、105 10nm01L、 andthen identical 03nmolL nmolL 24h by concentrations 1 ous at1 and wasnotobvi Pirarubicin2h，24h，48h72h，there the ofS hadthe percentagestage tendency apoptosispeak，and with oftimeand ofincrease increasing withthe of control Western-blotting：Comparedgroup，the Bcl一2 of a

24、nd expression protein 8 英文摘要 weredown in andPirarubicin regulatedpacitaxel groups，and bax proteinexpressionupregulated MG一63osteoscarcomacellcouldbe Conclusion： 1 The inhibitedPaclitaxelandPirarubicin ontimeand by depended inhibit doseThefinal ratewasthesamein different concentration thetimeTheconcentrationat byincreasing bethesuitableconcentrationTheinhibit apoptosispeakmight rateofPaclitaxelinlowconcentrationand time treating long wassameasthatin concentrationandshort high treatin