研究生免疫组织化学染色技术

1、武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞通过检测细胞内、细胞表面或细胞 间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的间的正常或异常的物质，以研究组织细胞的 正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理，正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理， 广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的 检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表检测，细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表 型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞型分析、细胞增殖和凋亡的研究，以及细胞 周期和信号转导的研究等。周期和信

2、号转导的研究等。 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 链霉菌亲和素链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法过氧化物酶连结法 (Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称简称S-P法法) 检测胃癌组织检测胃癌组织CKVimentin的蛋白表达的蛋白表达 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 过氧化物酶过氧化物酶 链酶亲和素链酶亲和素 生物素生物素 生物素化二抗生物素化二抗 特异性一抗特异性一抗 待测抗原待测抗原 武

3、汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 组织、细胞标本组织、细胞标本 抗原修复抗原修复 阻断内源性过阻断内源性过 氧化物酶氧化物酶 正常血清封闭正常血清封闭 滴加特异性一抗滴加特异性一抗滴加二抗滴加二抗 滴加三抗滴加三抗显色显色复染复染 封片封片 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l具体步骤如下：具体步骤如下： 1石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min； 2所有组织

4、均采用微波修复抗原；所有组织均采用微波修复抗原； 3室温冷却后，室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min； 4滴加滴加50l过氧化物酶阻断液（试剂过氧化物酶阻断液（试剂A），），37湿盒湿盒 孵育孵育 10min； 50.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min； 6滴加非免疫性动物血清（试剂滴加非免疫性动物血清（试剂B），），37湿盒孵育湿盒孵育 10min； 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 7甩去多余血清，分别滴加种抗体，甩去多余血清，分别滴加种抗体，4湿盒孵育湿盒孵育 过夜，

5、过夜， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min； 8滴加生物素标记的二抗（试剂滴加生物素标记的二抗（试剂C），），37湿盒孵育湿盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min； 9滴加链亲和素滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂过氧化物酶溶液（试剂D），），37湿盒孵湿盒孵 育育 15min， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min ； 10每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显色液，）显色液， 光镜下控制反应时间（约为光镜下控制反应时间（约为1-5min），自来水充分冲洗，），自来水充分冲洗， 苏木

6、素复染；苏木素复染； 11常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析；常规脱水、透明、中性树胶封片并镜检分析； 12阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用阳性对照采用已知阳性片为标准，阴性对照采用PBS取取 代第一抗体，其余步骤相同。代第一抗体，其余步骤相同。 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l内源性过氧化物酶的灭活内源性过氧化物酶的灭活 l血清封闭血清封闭 l冲洗冲洗 l抗体选择及一抗孵育时间抗体选择及一抗孵育时间 l检测及显色系统检测及显色系统 l复染复染 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武

7、汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l组织及时固定组织及时固定 固定剂选择：固定剂选择：10%中性缓冲福尔马林中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛多聚甲醛 l常规下固定常规下固定8-24小时小时 l取材厚度：取材厚度：2mm 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l常选用多聚耐氨酸（常选用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：注意：1）应严格控制使用次数）应严格控制使用次数 2）玻片洁净度）玻片洁净度 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病

8、理教研室 l包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过包埋：选择低熔点石蜡，温度不超过62 l切片：厚度切片：厚度 3-4m l烤片：温度烤片：温度60，时间，时间1小时；或小时；或602小时小时 （迈新）；或（迈新）；或60过夜过夜 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l切片不宜长时间在常温下保存切片不宜长时间在常温下保存 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规原则：免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开脱蜡分开 武汉大学

9、病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l抗原修复抗原修复 l实验操作中的注意事项实验操作中的注意事项 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l影响染色结果的最关键因素影响染色结果的最关键因素 l抗原修复方法分类抗原修复方法分类 1）酶消化法）酶消化法 2）加热法（高压法）加热法（高压法水煮法水煮法微波法）微波法） l抗原修复液的选择抗原修复液的选择 1）柠檬酸盐缓冲液（）柠檬酸盐缓冲液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH

10、 8.0） 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、存在部位：红细胞、横纹肌细胞、粒细胞、 单核细胞、肝细胞及肾细胞单核细胞、肝细胞及肾细胞 l消除方法：消除方法：3% H2O2 浸泡浸泡10分钟分钟 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l目的：减少非特异性着色目的：减少非特异性着色 l时间：一般在加载一抗之前使用时间：一般在加载一抗之前使用 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研

11、室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l一般采用一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分冲洗）充分冲洗 l增加效果增加效果 可加入可加入Tween20 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l应选择信誉高、质量好的试剂公司应选择信誉高、质量好的试剂公司 l抗体切忌反复冻融抗体切忌反复冻融 l一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度一抗为浓缩液时，需选择最佳稀释浓度 l按说明书可采用按说明书可采用 37 1-2 小时或小时或 4 冰箱过夜冰箱过夜 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学

12、病理教研室武汉大学病理教研室 l一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的 检测方法。检测方法。如如SP、LSABC、ABC等等 l显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测显色方法：经常采用辣根过氧化物酶系统检测 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 常用的酶常用的酶 1.1.辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP) A: A:显色底物显色底物DAB-DAB-棕黄色棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:B:显色底物显色底物AE

13、C-AEC-砖红色砖红色 2.2.碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AP)(AP) 显色底物显色底物:BCIP/NBT-:BCIP/NBT-蓝紫色蓝紫色 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l原则：注意两者之间对比，突出阳性信号原则：注意两者之间对比，突出阳性信号 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照原则：所有检测指标均设阳性对照、阴性对照 编号编号阳性片阳性片待检片待检片阴性对照阴性对照结论结论 1操作失误，抗体失效

14、操作失误，抗体失效 2非特异性着色非特异性着色 3阳性片不含靶抗原阳性片不含靶抗原 4待检片不含定位抗原待检片不含定位抗原 5待检片含定位抗原待检片含定位抗原 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 1.1.特定的定位特定的定位 胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型，局限性或弥 散性。散性。 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 CK10 CD44v6 ER 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大

15、学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 2.2.染色的不均一性染色的不均一性 阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在阳性切片的染色应分布不均，片状或点状散在 分布；染色强弱也不等，颜色深浅反映抗原量分布；染色强弱也不等，颜色深浅反映抗原量 的多少。的多少。 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 人肝癌中人肝癌中EGFR的表达的表达 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 3.3.颗粒性显色颗粒性显色 DABDAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀

16、着色。显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 人肺癌组织中人肺癌组织中P63的表达的表达 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 链霉菌亲和素链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法过氧化物酶连结法 (Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 简称简称S-P法法) 检测胃癌组织检测胃癌组织CKVimentin的蛋白表达的蛋白表达 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武

17、汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 l具体步骤如下：具体步骤如下： 1石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min； 2所有组织均采用微波修复抗原；所有组织均采用微波修复抗原； 3室温冷却后，室温冷却后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min； 4滴加滴加50l过氧化物酶阻断液（试剂过氧化物酶阻断液（试剂A），），37湿盒湿盒 孵育孵育 10min； 50.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min； 6滴加非免疫性动物血清（试剂滴加非免疫性动物血清（试剂B），），37湿

18、盒孵育湿盒孵育 10min； 武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室武汉大学病理教研室 7甩去多余血清，分别滴加种抗体，甩去多余血清，分别滴加种抗体，4湿盒孵育湿盒孵育 过夜，过夜， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min； 8滴加生物素标记的二抗（试剂滴加生物素标记的二抗（试剂C），），37湿盒孵育湿盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min； 9滴加链亲和素滴加链亲和素-过氧化物酶溶液（试剂过氧化物酶溶液（试剂D），），37湿盒孵湿盒孵 育育 15min， 0.01M PBS（pH 7.4）漂洗）漂洗35min ； 10每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺（DAB）显色液，）显色