目的基因的克隆与分离鉴定

1、6 目的基因的克隆与分离鉴定目的基因的克隆与分离鉴定 目的基因的克隆目的基因的克隆 目的基因的分离鉴定目的基因的分离鉴定 v基因克隆与基因分离基因克隆与基因分离 1 1、克隆、克隆 个体水平上的克隆个体水平上的克隆 细胞水平上的克隆细胞水平上的克隆 分子水平上的克隆分子水平上的克隆 2 2、基因克隆、基因克隆 分子水平上的克隆，将某一段分子水平上的克隆，将某一段DNADNA或一个基因插入到或一个基因插入到 一个载体分子上，并导入特定的宿主细胞中，形成寄一个载体分子上，并导入特定的宿主细胞中，形成寄 主主/ /载体单元，称为一个载体单元，称为一个克隆。克隆。 3 3、基因分离、基因分离 从复杂的

2、基因组中分离出单个具特定功能或特性的从复杂的基因组中分离出单个具特定功能或特性的 基基 因或因或DNADNA片段。片段。 该基因的功能或序列并不一定要了解。该基因的功能或序列并不一定要了解。 v基因工程或基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物重组技术的前提条件是从生物 体基因组中分离克隆目的基因。体基因组中分离克隆目的基因。 确定其表达调控机制和生物学功能；确定其表达调控机制和生物学功能； 建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌 （细胞）；（细胞）； 将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰；将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰； 然后

3、转入受体细胞内改良生物体的遗传性状，包括人然后转入受体细胞内改良生物体的遗传性状，包括人 体基因治疗。体基因治疗。 v一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类： 另一类是利用另一类是利用PCR扩增技术甚至扩增技术甚至化学合成法化学合成法体外直接合体外直接合 成目的基因，然后将之克隆表达。成目的基因，然后将之克隆表达。 一类是构建感兴趣的生物个体的一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，基因文库，即将某生物即将某生物 体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基 因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；因组文库

4、中挑出含有目的基因的重组克隆； 第一节第一节 目的基因的克隆目的基因的克隆 C PCR法法 B cDNA法法 A 鸟枪法鸟枪法 D 化学合成法化学合成法 E 基因文库的构建基因文库的构建 一、一、 鸟枪法鸟枪法 鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法操作的改进 鸟枪法克隆目的基因的局限性 (一)鸟枪法克隆目的基因的基本战略 鸟枪法（鸟枪法（shot-gun approach)shot-gun approach)：随机克隆供体细胞随机克隆供体细胞 的全基因组的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程片段，然后通过快速有效的筛选程 序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，序从众多克隆中分离

5、出含有目的基因的目的重组子， 进而获得目的基因。进而获得目的基因。 鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离。 1.1.染色体染色体DNA的切断的切断 超声波处理：超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端；片段长度均一，大小可控，平头末端； 全酶切：全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有 可能使目的基因断开，大小不可控；可能使目的基因断开，大小不可控； 部分酶切：部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基片段长度可控，含有粘性末端，目的基 因完整。因完整。 2.2.与载体连接与载体连接 如果转化子采用菌落原

6、位杂交法或限制性酶切图谱法如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法 筛选，则选择多拷贝筛选，则选择多拷贝克隆载体；克隆载体； 如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表表 达型载体；达型载体； 3.3.转化受体细胞转化受体细胞 如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能 使目的基因表达的受体细胞；使目的基因表达的受体细胞； 4.筛选含有目的基因的目的重组子筛选含有目的基因的目的重组子 菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的 建立）建立）

7、如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法 筛选，则选择大肠杆菌作为的受体细胞。筛选，则选择大肠杆菌作为的受体细胞。 问题问题 鸟枪法获得的克隆群体庞大鸟枪法获得的克隆群体庞大 以人的基因组为例，如果载体承受外源以人的基因组为例，如果载体承受外源DNADNA片段片段 的能力为的能力为1-3kb1-3kb；那么；那么, ,人类基因组人类基因组DNADNA需被切割成需被切割成 几十万个大小不等的片段；几十万个大小不等的片段； 每个片段都分别插入到一个载体分子上，这样就每个片段都分别插入到一个载体分子上，这样就 会形成由几十万个不同的重组分子组成的克

8、隆群体；会形成由几十万个不同的重组分子组成的克隆群体； 要想从如此巨大的克隆群体中筛选带有目的基因要想从如此巨大的克隆群体中筛选带有目的基因 的克隆，显然是非常费事的。的克隆，显然是非常费事的。 (二二) 鸟枪法操作的改进鸟枪法操作的改进 如果已知目的基因两端的酶切位点，可用该酶处理如果已知目的基因两端的酶切位点，可用该酶处理 染色体染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基然后与载体拼接，这样可以保证目的基 因的完整性，从而提高重组子中因的完整性，从而提高重组子中目的重组子目的重组子的出现频的出现频 率。率。 使用特征性限制性内切酶切开染色体使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA 使用

9、这一改进方法的前提条件是：使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切目的基因的酶切 图谱已知。图谱已知。 例如，已知某目的基因位于例如，已知某目的基因位于1.8 kb 的的SalI片段中，将染色体片段中，将染色体DNA用用SalI 切开，琼脂糖凝胶电泳分离；切开，琼脂糖凝胶电泳分离； 在连接前将在连接前将DNA片段进行分级分离片段进行分级分离 2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb 用刀片切下相当于用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小大小 区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收 DNA片段，然后与载体进行拼接。片段，然后与载体进行拼接。 v凝胶凝胶DNA片

10、段回收技术片段回收技术 冻融法冻融法 滤纸法滤纸法 吸附法吸附法 低融点凝胶法低融点凝胶法 溶解法溶解法 v凝胶凝胶DNA片段回收程序片段回收程序 1.1.切胶回收于离心管中；切胶回收于离心管中； 2.2.加入等体积的加入等体积的溶液溶液I I； 3.50-603.50-60水浴加热约水浴加热约1010分钟至胶融分钟至胶融解解； 4.4.加入到加入到DNADNA纯化柱内，室温放置纯化柱内，室温放置1 1分钟分钟； 5 5. .离心离心1 1分钟，倒弃收集管内的液体分钟，倒弃收集管内的液体； 6 6. .加入加入700700微升微升溶液溶液IIII，室温放置室温放置1 1分钟分钟； 7 7. .

11、离心离心1 1分钟，洗去杂质分钟，洗去杂质； 8 8. .加入加入500500微升微升溶液溶液IIII，最高速离心最高速离心1 1分钟分钟； 9 9. .将将DNADNA纯化柱置于纯化柱置于1.51.5mlml离心管上，加入离心管上，加入 3030ulul溶液溶液IIIIII至管内柱面上，放置至管内柱面上，放置1 1分钟分钟； 1010. .高速离心高速离心1 1分钟，所得液体即为高纯度分钟，所得液体即为高纯度DNADNA。 ( (三三) )鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性 工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识 不能获得最小长度的目的

12、基因不能获得最小长度的目的基因 不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构 二、二、cDNA法法 cDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略 cDNA法分离目的基因的基本程序法分离目的基因的基本程序 cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性 (一一) cDNA法克隆目的基因的基本战略法克隆目的基因的基本战略 mRNA 1.c1.cDNA第一链的合成第一链的合成 5ppp 5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH3 5ppp 5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH3 TTTTTTTTTTTTTTp5 5ppp 5 G G AAAA

13、AAAAAAAAAAOH3 TTTTTTTTTTTTTTp5 cDNA第一链第一链 引物引物退火退火 逆转录酶逆转录酶 dNTPs 2.c2.cDNA第二链的合成第二链的合成 煮沸煮沸NaOH 自身引导法：获得的双链自身引导法：获得的双链cDNA 5端会有几对碱基缺失端会有几对碱基缺失 5ppp 5 G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 TTTTTTTTTTTTTTp 5 AAAAAAAAAAAAAAOH 3 AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTT OH 3 KlenowdNTPs S1 TTTTTTTTTTTTTTp 5 DNA

14、pol dNTPs RNaesH 置换合成法：获得的双链置换合成法：获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺端也会有几对碱基缺 失失 5ppp 5 G G AAAAAAAAAAAAAA OH3 TTTTTTTTTTTTTT p5 S1 5 AAAAAAAOH 3 TTTTTTTTTTTTTTp 5 3 T4-DNA ligase 5 AAAAAAAAAAAAAAp 3 TTTTTTTTTTTTTTOH 5 5AAAAAAAAAAAAAA 3 TTTTTTTTTTTTTT 5 dCTPTdT 引导合成法：获得的双链引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的能保留完整的5端序列端序列 5ppp

15、5 G G AAAAAOH3 TTTTTp53HO 5ppp 5 G G AAAAACCCCCCCOH3 3 HOCCCCCCCTTTTTp5 3 HOCCCCCCCTTTTTp5 5 pGGGGGGG 3 HOCCCCCCC TTTTTp5 5 pGGGGGGGAAAAAOH3 NaOH退火退火 KlenowdNTPs 3.3.双链双链c cDNA的克隆的克隆 双链平头的双链平头的cDNA与载体的连接：与载体的连接： 平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收 平头两端分别接同聚物尾，最好是平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾同聚物尾， 这

16、样重组分子可通过加热局部变性和这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理核酸酶处理 回收插入片段回收插入片段 加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 (二二) cDNA法克隆目的基因的局限性法克隆目的基因的局限性 并非所有的并非所有的mRNAmRNA分子都具有分子都具有polyApolyA结构结构 细菌或原核生物的细菌或原核生物的mRNAmRNA半衰期很短半衰期很短 mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感， 分离纯化困难分离纯化困难 仅限于克隆蛋白质编码基因仅限于克隆蛋白质编码基因 三三 PCR法法 使用使用PC

17、R法克隆目的基因的前提条件是：法克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目已知待扩增目 的基因或的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合 反应必需的双引物反应必需的双引物。 (一一)PCR法定向扩增目的基因的基本原理法定向扩增目的基因的基本原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，法，又称为聚合酶又称为聚合酶 链反应或链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合聚合 程序。程序。 5 5 目的基因 变性加热 5 5 引物退火 5 5 底物聚合 5 加热变性 5 5 5 5 5 5

18、5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 退火 引物 底物聚合 加热变性 引物退火 底物聚合 1 2 3 5 由由Taq DNA聚合酶扩增的聚合酶扩增的PCR产物中，其产物中，其3末端总是会带末端总是会带 有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因因 为为Taq DNA聚合酶对聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基具有优先聚合活性。由于该突出碱基 的存在，克隆时即可以采取的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，末端加同聚尾的方法与载体拼接， 也可以使用专门

19、的也可以使用专门的T载体克隆。载体克隆。 (二二) PCR克隆目的基因的基本程序克隆目的基因的基本程序 5 5 A A T T5 5 PCR扩增产物扩增产物 T 载体载体 T7lacZ MCSoriApr 四四 化学合成法化学合成法 化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略 化学合成的单元操作化学合成的单元操作 DNA化学合成的用途化学合成的用途 一、化学合成一、化学合成DNADNA的发展的发展 二、化学合成寡核苷酸片段的主要方法二、化学合成寡核苷酸片段的主要方法 磷酸二酯法磷酸二酯法 磷酸三酯法磷酸三酯法 亚磷酸三酯法亚磷酸三酯法 固相合成法固相合成法 自动化法自动化法 三、化学合成三、化学

20、合成DNADNA（寡核苷酸）的应用寡核苷酸）的应用 v作为合成基因的元件作为合成基因的元件 v作为测序的引物作为测序的引物 v作为核酸分析杂交的探针作为核酸分析杂交的探针 v用于基因定点诱变研究用于基因定点诱变研究 v作为作为PCRPCR反应的引物反应的引物 v作为重组作为重组DNADNA连接等的构件连接等的构件 (一一)化学合成法的基本战略化学合成法的基本战略 全基因合成全基因合成 化学合成目的基因的前提条件是基因的化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：序列已知，有三种战略： 1.小片段粘接法：小片段粘接法： 混合退火混合退火 根据目的基因全序列，分别合成根据目的基因

21、全序列，分别合成12-15碱基长的单链碱基长的单链DNA小片段小片段 T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接 连接入合适的载体连接入合适的载体 2.补钉延长法：补钉延长法： 混合退火混合退火 根据目的基因根据目的基因两条互补链两条互补链全序列，分别合成全序列，分别合成12-15碱基长的单链碱基长的单链 DNA小片段以及小片段以及20-30碱基长的单链碱基长的单链DNA中片段中片段 T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接 克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合 3.大片段酶促法：大片段酶促法： 混合退火混合退火 根据目的基因根据目的基因的的全序列，分别

22、合成全序列，分别合成40-50碱基长的单链碱基长的单链DNA片段片段 T4-DNAT4-DNA连接酶连接连接酶连接 克隆入合适的载体克隆入合适的载体 KlenowKlenow酶聚合酶聚合 (二二)化学合成的单元操作化学合成的单元操作 v化学合成化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个 个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、基团保护、 缩合、氧化、去保护缩合、氧化、去保护等步骤；等步骤； v从反应机理上来讲，从反应机理上来讲，DNA化学合成有化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、磷酸

23、二酯法、磷酸三酯法、 亚磷酸液三酯法；亚磷酸液三酯法；具体操作过程又有具体操作过程又有液相合成液相合成和和固相合成固相合成两种形两种形 式；式； v前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便，前者操作繁琐，基本上已淘汰；后者反应中间物的分离程序简便， DNA合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。合成仪就是根据固相亚磷酸液三酯法原理设计的。 化学合成的单元操作化学合成的单元操作 O H G H HH HO CH2 ODMT POMe N CH Me Me CH Me Me O H G H HH HO CH2 ODMT POMe N CH Me Me CH Me Me H DM

24、T： 二甲氧基三苯甲基 激活激活 缩合缩合氧化氧化脱取代基脱取代基 玻璃珠玻璃珠 连接臂连接臂 O H G H HH HO CH2 ODMT POMe O H A H HH HO CH2 O O (三三) DNA化学合成的用途化学合成的用途 合成天然基因合成天然基因 修饰改造基因修饰改造基因 设计新型基因设计新型基因 制备探针、引物、接头制备探针、引物、接头 如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、如生长激素释放抑制素基因、脑啡肽基因、胰岛素基因、 干扰素基因等。干扰素基因等。 如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等。如组织型纤溶酶原激活剂基因、尿激酶原基因等。 全基因合成的问题

25、全基因合成的问题 上述三种方法各有利弊：化学合成上述三种方法各有利弊：化学合成DNA的的单片段愈单片段愈 短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本 较高；较高； 在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的 份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率 极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%，则则 合成合成50个碱基长的个碱基长的DNA单链大片段的总收率只有单链大片段的总收率只有7.7% 第一节第一节 目的基

26、因的克隆目的基因的克隆 三、三、PCR法法 二、二、cDNA法法 一、鸟枪法一、鸟枪法 四、化学合成法四、化学合成法 五、基因文库的构建五、基因文库的构建 五、基因（组）文库的构建五、基因（组）文库的构建 基因文库的基本概念基因文库的基本概念 基因文库的构建程序基因文库的构建程序 (一一) 基因文库的基本概念基因文库的基本概念 v基因库与基因文库基因库与基因文库 基因库（基因库（gene pool） 特定生物体全基因组的集合（天然存在）特定生物体全基因组的集合（天然存在） 基因文库（基因文库（gene library or gene bank） 将特定生物个体的全部将特定生物个体的全部DNA片

27、段连接入载体片段连接入载体DNA分子上，并分子上，并 导入受体细菌或细胞中，经扩增产生的包含该生物全部基因导入受体细菌或细胞中，经扩增产生的包含该生物全部基因 组序列的克隆群体。（人工构建）组序列的克隆群体。（人工构建） 基因组文库基因组文库（含有全部基因）（含有全部基因） cDNA文库文库（含有特定时期或组织中蛋白质编码基因）（含有特定时期或组织中蛋白质编码基因） 根据构建方法的不同，基因文库分为：根据构建方法的不同，基因文库分为： v基因文库构建的基本战略基因文库构建的基本战略 用鸟枪法构建基因组文库，用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体材料来自染色体DNA。 用用cDNA法构建法构建c

28、DNA文库，文库，材料来自材料来自mRNA。 v 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的 mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的 cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚 胎组织cDNA文库等。很显然， cDNA文库的信息量远小于基 因组文库。 1.1.重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力； 2.2.载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆； 3.3.克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；克隆与克隆之间必须存在足够

29、长度的重叠区域，以利克隆排序； 4.4.克隆片段易于从载体分子上完整卸下；克隆片段易于从载体分子上完整卸下； 5.5.重组克隆能稳定保存、扩增、筛选；重组克隆能稳定保存、扩增、筛选； 6.6.具有较高的完备性。具有较高的完备性。 v基因文库的质量标准基因文库的质量标准 基因文库的完备性是指：基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概在构建的基因文库中任一基因存在的概 率，它与基因文库最低所含克隆数率，它与基因文库最低所含克隆数N N之间的关系可用下式表示：之间的关系可用下式表示： N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f ) 其中：其中： P = P = 任一基因被克隆

30、（或存在于基因文库中）的概率任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率 f = f = 克隆片段的平均大小克隆片段的平均大小/ /生物基因组的大小生物基因组的大小 基因文库的完备性基因文库的完备性 F例如，人的单倍体例如，人的单倍体DNADNA总长为总长为2.92.9x10 x109 9bpbp，基因文库中基因文库中 克隆片段的平均大小为克隆片段的平均大小为1515kb,kb,则构建一个完备性为则构建一个完备性为0.90.9 的基因文库至少需要的基因文库至少需要4545万万个克隆；个克隆； F而当完备性提高到而当完备性提高到0.99990.9999时时, ,基因文库至少需要基因文库至少需要18

31、0180万万 个克隆。个克隆。 （二）基因文库的构建程序（二）基因文库的构建程序 1.基因组基因组DNA的制备的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性，为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因用于基因 组文库构建的组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂；在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂； AA AA 制备的制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末 端的端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。 2. 基因组基因组DNA的切割的切割 用于基因组文

32、库构建的用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理片段的切割一般采用超声波处理 和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是：和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： 第一，保证第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区片段之间存在部分重叠区 第二，保证第二，保证DNA片段大小均一片段大小均一 超声波处理后的超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装片段呈平头末端，需加装人工接头；人工接头； 部分酶切法一般选用部分酶切法一般选用四对碱基识别序列四对碱基识别序列的限制性内切酶的限制性内切酶，如如： Sau3A I或或Mbo I等，这样等，这样DNA酶解片段的大小可控；酶解片段的大小可控；

33、连接前，上述处理的连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行片段必须根据载体的装载量进行分级分级 分离，分离，以杜绝不相干的以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体！片段随机连为一体！ 3. 载体和受体的选择载体和受体的选择 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常 选装载量较大的选装载量较大的-DNA或考斯质粒；或考斯质粒； 对于大型基因组（如动、植物和人类）需使用对于大型基因组（如动、植物和人类）需使用YAC或或BAC载体；载体； 由于绝大多数真核生物的由于绝大多数真核生物的mRNA小于小于10 kb，因此用于因此用于c

34、DNA 文库构建的载体通常选质粒。文库构建的载体通常选质粒。 -DNA 上述几种载体的最大装载量如下：上述几种载体的最大装载量如下： 质粒质粒 考斯质粒考斯质粒 15 kb 25 kb 45 kb BAC300 kb YAC400 kb v用于基因文库构建的受体则根据载体使用用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌大肠杆菌或或酵母菌酵母菌 4. 基因文库构建的技术性问题基因文库构建的技术性问题 v在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是：在基因组文库的构建过程中，最应引起重视的问题是： 避免外源避免外源DNADNA片段之间的连接！片段之间的连接！ v为了避免上述情况的发生，可采取下列

35、措施的组合：为了避免上述情况的发生，可采取下列措施的组合： 将待连接的将待连接的DNA片段根据载体的装载量分级分离片段根据载体的装载量分级分离 用碱性磷酸单酯酶除去用碱性磷酸单酯酶除去DNA片段的末端磷酸基团片段的末端磷酸基团 用用TdT酶在酶在DNA片段的末端上增补同聚尾末端片段的末端上增补同聚尾末端 第二节第二节 基因的分离基因的分离 一、基于基因功能的基因分离技术一、基于基因功能的基因分离技术 二、基于二、基于DNA插入作用的基因分离技术插入作用的基因分离技术 三、基于基因图谱的基因分离技术三、基于基因图谱的基因分离技术 一、基于基因功能的基因分离技术一、基于基因功能的基因分离技术 1、

36、已知目的基因的氨基酸序列、已知目的基因的氨基酸序列 2、根据基因的同源性分离目的基因、根据基因的同源性分离目的基因 3、根据、根据mRNA的特异性分离目的基因的特异性分离目的基因 1 1、已知目的基因的氨基酸序列、已知目的基因的氨基酸序列（功能克隆）（功能克隆） 将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，根据某些蛋白将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，根据某些蛋白 质的氨基酸保守性合成寡核苷酸探针从质的氨基酸保守性合成寡核苷酸探针从cDNAcDNA库或基库或基 因组文库中筛选编码基因；因组文库中筛选编码基因； 将相应的编码蛋白制成相应抗体探针将相应的编码蛋白制成相应抗体探针, ,从从cDNAcDNA载载 体表达

37、库中筛选相应克隆。体表达库中筛选相应克隆。 根据某些蛋白质的氨基酸保守性设计特异引物，根据某些蛋白质的氨基酸保守性设计特异引物， PCRPCR扩增出目的基因；扩增出目的基因； v某段连续氨基酸序列的简并探针的序列设计某段连续氨基酸序列的简并探针的序列设计 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile TGT ATG GAC GAA ATG AAA AGA AAC ATA C T G G G T T C TGTATGGACGAAATGAA 此外还可以参考各种生物体的此外还可以参考各种生物体的EST数据库进行倾向性简并序列设计数据库进行倾向性简并序列设计 总探针类型：总探

38、针类型：2222=16 密集铺板（密集铺板（1-10万）万） 杂 交 挖 取 铺 板 铺 板 目的重组克隆 v文库筛选文库筛选 氨基酸序列氨基酸序列核苷酸序列核苷酸序列PCR 特异蛋白质特异蛋白质 目的基因目的基因 抗体抗体 基因文库筛选基因文库筛选 评价评价 优点优点 - 在单基因性状的基因分离方面仍为在单基因性状的基因分离方面仍为常用常用策略策略 缺点缺点 - 特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难特异蛋白质确定、鉴定及其纯化困难* - 难以分离微量表达基因难以分离微量表达基因 - 无法研究无无法研究无蛋白质蛋白质产物的基因产物的基因 - 难以进行多基因控制性状的基因分离难以进行多基因控制性状的

39、基因分离 根据近缘物种间或进化关系较近的物种间功根据近缘物种间或进化关系较近的物种间功 能相关的基因间核苷酸序列的保守性，设计能相关的基因间核苷酸序列的保守性，设计 探针，从基因文库中筛选并鉴定目的基因。探针，从基因文库中筛选并鉴定目的基因。 2 2、根据基因的同源性分离目的基因、根据基因的同源性分离目的基因 v文库筛选法文库筛选法 保守序列保守序列 保守序列保守序列 F5个个MYB转录因子基因的比对结果转录因子基因的比对结果 A. cDNA的合成的合成 vcDNAcDNA末端快速扩增末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE) 以以mRNA为模

40、板，用依赖于为模板，用依赖于RNA的的DNA聚合聚合 酶酶(反转录酶反转录酶)来催化合成来催化合成cDNA。目前商品化反。目前商品化反 转录酶有禽类成髓细胞病毒转录酶有禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和逆转录酶和 鼠白血病病毒鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。反转录酶。 B. 同源片段的克隆同源片段的克隆 简并引物的设计简并引物的设计 利用利用DNAman、DNAstar等软件对等软件对GENbank中已公中已公 布的欲克隆的同源基因的氨基酸和核苷酸序列进行同布的欲克隆的同源基因的氨基酸和核苷酸序列进行同 源分析，然后，根据基因的保守区设计合成一对简并源分析，然后，根据基因的保守区设计合成一对

41、简并 引物。引物。 简并引物简并引物:是指编码单个氨基酸的所有不同碱基可能是指编码单个氨基酸的所有不同碱基可能 性的不同序列的混合物。性的不同序列的混合物。 v为了增加特异性为了增加特异性,可以参考密码子使用表可以参考密码子使用表,根据不同生根据不同生 物的碱基使用偏好物的碱基使用偏好,减少简并性。减少简并性。 Gene1: TTC TAT CAC GAG TGC TGG Phe Tyr His Glu Cys Trp TTT TAT CAT GAA TGT TGG Gene2: Degenerate Primer: 5-TT(T/C) TAT CA(T/C) GA(A/G) TG(T/C)

42、TGG-3 氨基酸序列氨基酸序列: : 为了增加特异性为了增加特异性，可以参考密码子使用表可以参考密码子使用表，根据不根据不 同生物的碱基使用偏好同生物的碱基使用偏好，减少简并性。减少简并性。 简并简并PCR扩增同源片段扩增同源片段 琼脂糖凝胶电泳对琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定；用洁净的刀产物进行鉴定；用洁净的刀 片在长紫外灯下切下含有目的片在长紫外灯下切下含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶，片段的琼脂糖凝胶， 放入放入1.5ml的微量离心管中；的微量离心管中；PCR产物回收试剂盒回收产物回收试剂盒回收 目的片段。目的片段。 将回收的将回收的PCR产物连接至产物连接至pMD18-T载体上，转

43、化大载体上，转化大 肠杆菌感受态，克隆目的片段，并测序鉴定。肠杆菌感受态，克隆目的片段，并测序鉴定。 C. cDNA 3末端序列的克隆末端序列的克隆 3RACE引物的设计引物的设计 根据已获得的基因的同源片段，设计基因特异的根据已获得的基因的同源片段，设计基因特异的 巢式引物巢式引物(nested PCR primer)。GSP1和和GSP2，巢式，巢式 PCR扩增扩增cDNA 3末端序列末端序列。 RNA的提取及的提取及cDNA的合成的合成 方法同前，但反转录引物不同方法同前，但反转录引物不同(带有接头序列带有接头序列)： QT: 5-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCA

44、TGACAGTG(T)18-3 可利用此接头序列设计两条接头引物可利用此接头序列设计两条接头引物Q1和和Q2。 Q1 Q2 巢式巢式PCR扩增扩增3-端端cDNA 以以QT引物反转录获得引物反转录获得cDNA为模板，分别用基因为模板，分别用基因 特异引物特异引物GSP1与通用引物与通用引物Q1进行第一轮进行第一轮PCR； 将第一轮将第一轮PCR产物稀释产物稀释100倍作为模板，分别用基倍作为模板，分别用基 因特异引物因特异引物GSP2与通用引物与通用引物Q2进行第二轮巢式进行第二轮巢式PCR； 0.8%的琼脂糖凝胶电泳，回收的琼脂糖凝胶电泳，回收PCR产物并连接至产物并连接至 T载体，转化大肠

45、杆菌载体，转化大肠杆菌DH-5，利用，利用-互补及菌落互补及菌落 PCR筛选阳性克隆，并送测序公司测序。筛选阳性克隆，并送测序公司测序。 图 ZmABC1-10 基因全长cDNA克隆 D. cDNA 5末端序列的克隆末端序列的克隆 5RACE引物的设计引物的设计 根据已获得的基因的同源片段，设计基因特异的巢式根据已获得的基因的同源片段，设计基因特异的巢式 引物（引物（nested PCR primer）。）。GSP1和和GSP2，巢式，巢式PCR 扩增扩增cDNA 5末端序列。末端序列。 1）TaKaRa公司公司RACE原理原理 添加接头序列添加接头序列 以以RNaseH分解掉分解掉cDNA-

46、RNA杂交体中杂交体中RNA； 利用一利用一5端磷酸化的特异性引物对端磷酸化的特异性引物对mRNA进行反进行反 转录形成转录形成5端磷酸化的端磷酸化的cDNA第一链；第一链； 在在T4RNA连接酶的作用下将单链连接酶的作用下将单链cDNA环化或首环化或首 尾相连；尾相连； 用两对基因特异性引物：用两对基因特异性引物：A1、S1及及A2、S2分别分别 进行二次进行二次PCR扩增得到所需目的片段扩增得到所需目的片段 2） Clontech公司的公司的SMART 5 -RACE的原理的原理 以以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶作为锁定引物在反转录酶M- MLV作用下，反转录合成标准第

47、一链作用下，反转录合成标准第一链cDNA； 利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反 转录达到第一链的转录达到第一链的3末端时自动加上末端时自动加上3-5个个(dC)残残 基，退火后基，退火后(dC)残基与含有残基与含有SMART寡核苷酸序寡核苷酸序 列列Oliogo(dG)通用接头引物通用接头引物配对后，转换为以配对后，转换为以 SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头序列为模板继续延伸而连上通用接头； 然后用一个含有部分接头序列的通用引物然后用一个含有部分接头序列的通用引物 UPM（Universal Primer）作为上游引物，用一）作为上游引物

48、，用一 个基因特异引物（个基因特异引物（Gene Specific Primer，GSP） 作为下游引物，作为下游引物，PCR扩增目的基因扩增目的基因5末端的末端的 cDNA片段片段 3）Invitrogen的的 GeneRACER 5 -RACE的原理的原理 5 mRNA CAP3 Poly A tail Full-length mRNAm7 G-P-P-PAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA P/ Truncated mRNA P/ Non-mRNA CIP m7 G-P-P-PAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA 去磷酸化反应去磷酸化反应: 利用碱性磷酸酶利用

49、碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶，如牛小肠碱性磷酸酶，CIP)处理，水处理，水 解掉解掉RNA 5末端的磷酸。但末端的磷酸。但CIP不能破坏不能破坏mRNA5末端末端 的帽子结构的帽子结构； 去帽反应：去帽反应： 利用烟草焦磷酸酶利用烟草焦磷酸酶Tobacco Acid Pyrophosphatase （TAP）消化掉）消化掉mRNA5末端的帽子结构末端的帽子结构； m7 G-P-P-PAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAP/ TAP 接头连接：接头连接： 将经去磷酸化和去帽处理的将经去磷酸化和去帽处理的RNA转入另一转入另一PCR管中，加管中，加 入入RNA接头片段，在接头片段，

50、在RNA Ligase 作用下，将作用下，将RNA Oligo接接 头连接于去帽的头连接于去帽的mRNA5末端末端； AAAAAAAAAAAA RNA Ligase RNA Oligo AAAAAAAAAAAAP/ 反转录：反转录： 在反转录酶的作用下，利用在反转录酶的作用下，利用Oligo(dT)反转录获得反转录获得cDNA; RT AAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTT AAAAAAAAAAAA RNA Oligo TTTTTTTTTTTTT 巢式巢式PCR： 利用接头的通用引物利用接头的通用引物UP（Universal Primer）和基因特）和基因特 异引物，巢式异引物，

51、巢式PCR获得基因获得基因5片段。片段。 UPGSP 5cDNA 巢式巢式PCR扩增全长扩增全长cDNA： 根据已获得根据已获得目的目的基因的基因的3序列序列和和5序列，设计基因特异序列，设计基因特异 的巢式引物的巢式引物5GSP和和3GSP，巢式，巢式PCR扩增扩增cDNA全长全长 序列。序列。 TTTTTTTTTTTTT 5GSP3GSP PCR 差别杂交差别杂交 Differential hybridization 扣除杂交扣除杂交 Substractive hybridization 抑制性消减杂交抑制性消减杂交Suppression substractive hybrid 差别显示差

52、别显示 Differential display 基因芯片技术基因芯片技术 Gene chips 3 3、根据、根据mRNAmRNA的特异性分离目的基因的特异性分离目的基因 v差别杂交差别杂交(Differential hybridization)又叫差别筛选又叫差别筛选 (Differential screening)，适用于分离经特殊处理而被，适用于分离经特殊处理而被 诱发表达的诱发表达的mRNA之之cDNA克隆。克隆。 v差别杂交差别杂交的技术基础十分简单，它不需要任何有关的技术基础十分简单，它不需要任何有关 目的基因的核苷酸序列信息，但重要的是要拥有两种目的基因的核苷酸序列信息，但重要

53、的是要拥有两种 不同的细胞群体。不同的细胞群体。 3.1 3.1 差别杂交差别杂交 1 1）差别杂交的操作程序）差别杂交的操作程序 mRMA mRMA cDNA探针探针 cDNA探针探针 cDNA cDNA文库文库 表达目的基因表达目的基因 mRNA的细胞的细胞 不表达目的基因不表达目的基因 mRNA的细胞的细胞 原初平板原初平板 影印影印 影印影印 2 2）差别杂交的局限性）差别杂交的局限性 差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰 度的度的mRNA而言，这个缺点就显得更为突出。而言，这个缺点就显得更为突出。 差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大

54、量的差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的 噬菌斑或克隆片段，因此成本较高、工作量较大。噬菌斑或克隆片段，因此成本较高、工作量较大。 由于两套平行转移的滤膜之间，由于两套平行转移的滤膜之间，DNA的保有量往的保有量往 往会有差别，导致杂交信号的强度不一致，从而降往会有差别，导致杂交信号的强度不一致，从而降 低了此法的可重复性。低了此法的可重复性。 不表达目的基因不表达目的基因 的总的总mRNA 表达目的基因表达目的基因 的总的总mRNA cDNA 杂交杂交 DNA-RNA 杂交分子杂交分子 游离的单链游离的单链 mRNA分子分子 3.2 3.2 扣除扣除( (消减消减) )杂交杂交(Sub

55、tractive hybridization) 差异分离程序差异分离程序 利用两组细胞利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异种类的差异，分离克隆差异 mRNA所对应的所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆因而这种程序较适用于分离克隆 新基因新基因 例如：例如：正常的大鼠正常的大鼠FR3T3成纤维细胞成纤维细胞中，有些新基因中，有些新基因 是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。 任务是：任务是：分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。 多瘤病毒感染的多瘤病毒感染的FR3T3细胞细胞

56、 正常的正常的FR3T3细胞细胞 总总mRNA 总总mRNA cDNA 双链双链cDNA 单链单链cDNA 提取提取mRNA 合成合成cDNA 合成第二链合成第二链 克隆克隆 提取提取mRNA 共价交联共价交联 上柱上柱 原位杂交原位杂交 病毒诱导表达的基因病毒诱导表达的基因 cDNA克隆克隆 3.3 3.3 抑制性消减杂交抑制性消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH) FSSHSSH的核心技术是抑制性的核心技术是抑制性PCRPCR，它是一种将检测子，它是一种将检测子cDNAcDNA 单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术；单链标准化

57、步骤和消减杂交步骤融为一体的技术； F抑制性抑制性PCRPCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，是利用链内复性优先于链间复性的原理， 是非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产是非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产 生生“锅柄样锅柄样”结构或结构或“发夹结构发夹结构”而无法与引物配对，而无法与引物配对， 从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。 (In excess) 总总mRNA （B） 总总mRNA （A） cDNA cDNA 电泳，电泳， 显影显影 比较差异条带比较差异条带 RT-PCR （加入已标记的加入已标记的dCTP) 3.4 差别显示

58、差别显示(Differential display) 基因芯片基因芯片(gene chip) 基因芯片又称为基因芯片又称为DNADNA微阵列微阵列(DNA microarray)，它是，它是 指通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的探针指通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的探针 有序地固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，有序地固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交， 通过杂交信号的强弱检测靶分子的一种检测工具。通过杂交信号的强弱检测靶分子的一种检测工具。 基因芯片技术上的特点是具有基因芯片技术上的特点是具有高度可行性、多样性、高度可行性、多样性、 微型化微型化和和自动化自动化

59、四大特点。四大特点。 激光共聚焦荧光扫描显微镜检测杂交信号激光共聚焦荧光扫描显微镜检测杂交信号 二、基于二、基于DNA插入作用的基因分离技术插入作用的基因分离技术 1 1、原理：、原理： 由于插入的由于插入的DNADNA序列相当于人为地给目的基因加上一个序序列相当于人为地给目的基因加上一个序 列标签，因此用此列标签，因此用此DNADNA插入突变分离基因的技术又称为插入突变分离基因的技术又称为DNA 标签法标签法(DNA tagging).(DNA tagging). 当一段特定的当一段特定的DNA序列插入到基因组中某一个基因的内序列插入到基因组中某一个基因的内 部或其邻近位点时，便会诱发该基因

60、发生突变，并最终导部或其邻近位点时，便会诱发该基因发生突变，并最终导 致表型变化，形成突变体。如果此段致表型变化，形成突变体。如果此段DNA插入序列是已知插入序列是已知 的，则可作为的，则可作为DNA杂交的分子探针，从突变体基因组杂交的分子探针，从突变体基因组DNA 文库中筛选到突变基因。再以突变基因为探针，从其原始文库中筛选到突变基因。再以突变基因为探针，从其原始 个体的基因组个体的基因组DNADNA文库中筛选目的基因。文库中筛选目的基因。 v利用转座子的转座作用使被插入的目的基因突变利用转座子的转座作用使被插入的目的基因突变 失去活性，而转座子的删除作用又可使目的基因失去活性，而转座子的删